益氣活血通絡(luò)方對脊髓型頸椎病模型大鼠miR-126a-5p及VEGF信號通路的影響

劉丹 唐占英 李攀 袁薇娜 李芳芳 陳倩 胡志俊

摘要：目的 探討益氣活血通絡(luò)方對脊髓型頸椎病模型大鼠微小RNA-126a-5p（miR-126a-5p）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路的影響。方法 30只健康雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法均分為假手術(shù)組、模型組和中藥組。模型組、中藥組均制備脊髓型頸椎病模型。中藥組給予益氣活血通絡(luò)方灌胃，假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水灌胃，均為12周。各組干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行大鼠行為學(xué)測試，測定機(jī)械性刺激閾值和熱刺激回縮時間。處死大鼠，HE染色觀察各組椎間盤軟骨終板結(jié)構(gòu)的差異。TUNEL染色觀察大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞變化。實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測大鼠椎間盤纖維環(huán)組織miR-126a-5p和VEGF mRNA。采用Western blot法檢測大鼠椎間盤纖維環(huán)組織VEGF蛋白表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠椎間盤血管芽數(shù)目減少，大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞破壞明顯、大量凋亡且細(xì)胞密度降低；模型組和中藥組機(jī)械性刺激閾值降低，熱刺激回縮時間縮短，miR-126a-5p水平降低，VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組大鼠椎間盤血管芽數(shù)目增加，大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞破壞減輕，大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡減少且細(xì)胞密度增加，機(jī)械性刺激閾值升高，熱刺激回縮時間延長，miR-126a-5p水平增加，VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)論 益氣活血通絡(luò)方治療脊髓型頸椎病的機(jī)制可能與上調(diào)miR-126a-5p、下調(diào)VEGF表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：頸椎?。谎軆?nèi)皮生長因子類；椎間盤；脊髓；益氣活血通絡(luò)方；miR-126a-5p

中圖分類號：R681.531.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230607

Effect of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction on miR-126a-5p and VEGF signaling pathway in cervical spondylotic myelopathy model rats

LIU Dan， TANG Zhanying， LI Pan， YUAN Weina， LI Fangfang， CHEN Qian， HU Zhijun△

Department of Rehabilitation Medicine， Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，

Shanghai 200032， China

△Corresponding Author E-mail： hzjz1062@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction on microRNA-126a-5p （miR-126a-5p） and vascular endothelial growth factor （VEGF） signaling pathway in cervical spondylotic myelopathy model rats. Methods Thirty healthy male SD rats were divided into the sham operation group， the model group and the traditional Chinese medicine （TCM） group by random number table method. Cervical spondylotic myelopathy models were prepared in the model group and the TCM group. The TCM group was given intragastric administration of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction， while the sham operation group and the model group were given intragastric administration of normal saline for 12 weeks. After intervention， the threshold of mechanical stimulation and retraction time of thermal stimulation in each group were measured by behavior tests. Rats were sacrificed to collect intervertebral disc tissue for hematoxylin-eosin （HE） staining and observe the number of vascular buds in intervertebral disc. Rat intervertebral disc annulus fibrosus cells were subjected to terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） staining. The miR-126a-5p and VEGF mRNA of rat intervertebral disc tissue were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR）. The expression of VEGF protein of rat intervertebral disc tissue was detected by Western blot assay. Results Compared with the sham operation group， the number of vascular buds in intervertebral disc was decreased in the model group and the TCM group. The cell destruction of intervertebral disc annulus was obvious in rats， and apoptosis was high and cell density decreased. Mechanical stimulation threshold decreased， and mechanical stimulation threshold decreased. The level of miR-126a-5p was decreased， and the expression levels of VEGF mRNA and protein were increased. Compared with the model group， the number of vascular buds in intervertebral disc was increased in the TCM group. The destruction of intervertebral disc annulus cells was alleviated in rats. The apoptosis of annulus fibrosus cells in intervertebral disc decreased and cell density increased. The threshold of mechanical stimulation increased， and the retraction time of thermal stimulation was prolonged. The level of miR-126a-5p increased， and the expression levels of VEGF mRNA and protein decreased （P＜0.05）. Conclusion The mechanism of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction in the treatment of cervical spondylotic myelopathy may be related to the up-regulation of miR-126a-5p expression and the down-regulation of VEGF expression.

Key words： cervical spondylosis; vascular endothelial growth factors; intervertebral disc; spinal cord; Yiqi Huoxue Tongluo Decoction; miR-126a-5p

脊髓型頸椎病是頸部椎間盤突出壓迫脊髓引起的頸椎病，致殘率較高［1］。該病屬于中醫(yī)“痹證”、“項(xiàng)強(qiáng)”范疇，病機(jī)為機(jī)體正氣不足、肝腎虧虛、脈絡(luò)瘀滯。益氣活血通絡(luò)方對脊髓型頸椎病具有良好療效，但機(jī)制尚不明確。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療脊髓型頸椎病可能與促進(jìn)血管生成，改善血流動力學(xué)和微循環(huán)有關(guān)［2-3］。在椎間盤退行性病變進(jìn)展過程中，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)明顯改變，退變椎體終板血管芽顯著減少［4］。Hong等［5］研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可通過調(diào)控VEGF信號通路影響血管生成。本研究通過構(gòu)建脊髓型頸椎病大鼠模型，旨在探討益氣活血通絡(luò)方治療脊髓型頸椎病的分子作用機(jī)制，為脊髓型頸椎病治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康雄性SPF級SD大鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量（300±15）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實(shí)驗(yàn)前大鼠均在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度22～26 ℃，相對濕度50%～70%。動物使用許可證號：SYXK（滬）2020-0009，本實(shí)驗(yàn)已獲得本院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審批通過（倫理審批號：PZSHUTCM210604003）。蘇木精-伊紅（HE）染色液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；VEGF抗體購自美國Affinity公司。CWbio實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。BW-EVF2393大鼠自動足底機(jī)械刺痛儀購自美國IITC公司；JY-JX5L電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；CFX ConnectTM熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。吸水膨脹性高分子材料（規(guī)格：5 mm×3 mm×0.8 mm）購自如皋市科力化工廠。

1.2 動物模型制備 30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、中藥組，每組10只。參照文獻(xiàn)［6］，采用膨脹材料壓迫法制備脊髓型頸椎病模型。模型組、中藥組：將吸水膨脹性高分子材料置于大鼠C5—C6椎板與硬脊膜之間。假手術(shù)組：硬脊膜暴露及游離操作同模型組，但不放置吸水膨脹性高分子材料，不壓迫脊髓。各組大鼠術(shù)后紗布止血、逐層縫合，適當(dāng)給予抗生素預(yù)防感染后單籠飼養(yǎng)。造模8周后進(jìn)行斜板爬坡試驗(yàn)，將大鼠放置于墊有橡膠墊的斜板上，從0°開始每次抬高5°，觀察大鼠能在斜板上停留5 s的最大角度，若發(fā)現(xiàn)大鼠爬行掉落，說明大鼠的下肢及軀干運(yùn)動不協(xié)調(diào)，模型制備成功。

1.3 分組干預(yù) 中藥組給予益氣活血通絡(luò)方：黃芪30 g，當(dāng)歸20 g，生地20 g，熟地20 g，白芍15 g，川芎9 g，丹參9 g，仙靈脾15 g，續(xù)斷10 g，懷牛膝10 g，加水300 mL煎煮并濃縮。參照文獻(xiàn)［7］，藥物劑量按照動物和人體表面積等效劑量比率換算，湯劑含生藥量0.70 g/mL，每次灌胃3 mL，每日1次，療程12周。假手術(shù)組、模型組給予同等容量的生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)12周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠行為學(xué)觀察 12周干預(yù)結(jié)束后，參照文獻(xiàn)［8］，第13周第1天采用Up-down法測定機(jī)械性刺激閾值。測量10次至少有連續(xù)5次縮足反應(yīng)，探針的壓力值即為機(jī)械性刺激閾值。熱刺激回縮時間：將大鼠放置于紙筒中，后肢露于紙筒外，將大鼠的神經(jīng)損傷側(cè)后肢放于一塊玻璃板上，用熱輻射儀照射足底，直到大鼠產(chǎn)生踮腳、回縮、舔足、掙扎等后足收縮反應(yīng)，用秒表記錄從熱照射開始到大鼠后足收縮所需的時間即為熱刺激回縮時間。

1.4.2 大鼠椎間盤纖維環(huán)組織HE染色 參照文獻(xiàn)［9］，斷頭處死各組大鼠，剝離大鼠C5—C6椎間盤纖維環(huán)組織，一部分標(biāo)本浸泡在4%多聚甲醛4 ℃固定過夜，另一部分標(biāo)本置于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。?jīng)脫水、透明、包埋、切片等步驟，制作石蠟切片（3～4 μm），進(jìn)行HE染色。觀察椎間盤軟骨終板結(jié)構(gòu)、髓核組織、血管等病理改變。

1.4.3 TUNEL染色觀察椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡 參照文獻(xiàn)［10］，各組取部分椎間盤纖維環(huán)組織切片，制備TUNEL反應(yīng)混合液：用50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；每個切片上加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，在37 ℃濕盒避光反應(yīng)1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；滴加DAPI染色液，恒溫孵育盒避光室溫孵育20 min。PBS清洗，加入DAB顯色液，孵育10 min，光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL陽性（凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光）細(xì)胞數(shù)目并拍照。

1.4.4 RT-PCR檢測miR-126a-5p和VEGF mRNA 參照文獻(xiàn)［11］，取10 mg大鼠椎間盤纖維環(huán)組織，使用Trizol提取組織樣本中總RNA。使用CWbio RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系：2×增強(qiáng)版熒光定量預(yù)混試劑10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.6 μL，下游引物（10 μmol/L）0.6 μL，cDNA 100 ng，加入ddH2O補(bǔ)足至20 μL。miR-126a-5p引物：上游5'-CCGGGCGCATTATTACTTTTGGTACGCG-3'，下游5'-CCGGGCGTTAATGCTAATTGTGATAGGGGT-3'；VEGF引物：上游5'-GATCCTGCCCTGTCTCTCTG-3'，下游5'-GACTCGCCCTCATCCTCTT-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，53～58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-??Ct法計(jì)算miR-126a-5p和VEGF mRNA的相對表達(dá)量。

1.4.5 Western blot法檢測椎間盤纖維環(huán)組織VEGF蛋白表達(dá) 取-20 ℃冷凍保存的大鼠椎間盤纖維環(huán)組織，剪碎后于液氮中研磨至細(xì)粉末狀，分裝于離心管中，加入500 μL裂解液，充分混勻，4 ℃過夜裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。參照文獻(xiàn)［12］，以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件測定條帶灰度值，計(jì)算VEGF蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[[x] ±s

]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組和中藥組的機(jī)械性刺激閾值降低，熱刺激回縮時間縮短（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組的機(jī)械性刺激閾值增加，熱刺激回縮時間延長（P＜0.05），見表1。

2.2 各組大鼠椎間盤纖維環(huán)組織及細(xì)胞變化 （1）HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組椎間盤軟骨終板結(jié)構(gòu)完整，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)清晰，髓核組織未見明顯皺縮，關(guān)節(jié)軟骨較薄，軟骨下分布有較大血管。與假手術(shù)組相比，模型組椎間盤纖維環(huán)軟骨表面粗糙腫脹，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂，髓核組織明顯皺縮，椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞大量凋亡，髓核突出，關(guān)節(jié)軟骨鈣化層增厚，軟骨下血管曲張，椎間盤軟骨出現(xiàn)明顯的退行性改變，血管芽數(shù)目顯著減少。中藥組椎間盤纖維環(huán)組織相比模型組有一定改善，其纖維環(huán)結(jié)構(gòu)輕微紊亂，髓核組織輕微皺縮，纖維環(huán)軟骨厚度比模型組增大，軟骨下血管充血擴(kuò)張改善，血管芽數(shù)目多于模型組。見圖1A。（2）TUNEL染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞幾乎無凋亡。與假手術(shù)組相比，模型組椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞大量凋亡，凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光，細(xì)胞密度明顯降低。中藥組椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡數(shù)目相比模型組有一定改善，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞密度增加。見圖1B。

2.3 各組大鼠椎間盤纖維環(huán)組織miR-126a-5p表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組和中藥組椎間盤纖維環(huán)組織miR-126a-5p表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組椎間盤纖維環(huán)組織miR-126a-5p表達(dá)水平增加（P＜0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠椎間盤纖維環(huán)組織VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組和中藥組VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見表2、圖2。

3 討論

機(jī)械性刺激閾值和熱刺激回縮時間是評價大鼠行為學(xué)特征的常用指標(biāo)。研究顯示，脊髓型頸椎病模型大鼠在接受治療后，其機(jī)械性刺激閾值和熱刺激回縮時間明顯上升［13］。本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的機(jī)械性刺激閾值和熱刺激回縮時間低于假手術(shù)組，提示脊髓受壓和椎間盤退變可誘發(fā)大鼠痛覺過敏。在應(yīng)用益氣活血通絡(luò)方灌胃后，大鼠的機(jī)械性刺激閾值和熱刺激回縮時間提高，提示益氣活血通絡(luò)方治療有效，促進(jìn)了脊髓功能恢復(fù)，原因可能是益氣活血通絡(luò)方激活了脊髓VEGF信號通路，觸發(fā)了脊髓損傷大鼠神經(jīng)病理性痛的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，從而提高了脊髓后角對神經(jīng)性疼痛的興奮性［14］。本研究HE染色、TUNEL染色結(jié)果顯示，模型組較假手術(shù)組椎間盤血管芽數(shù)目減少，纖維環(huán)細(xì)胞大量凋亡，細(xì)胞密度明顯降低，中藥組較模型組上述指標(biāo)均有改善，表明益氣活血通絡(luò)方有助于促進(jìn)大鼠血管生成，減少椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡，增加椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞密度，提示益氣活血通絡(luò)方治療有效，促進(jìn)了椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞生長和恢復(fù)，具有一定的臨床應(yīng)用價值。

微小RNA是參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的非編碼RNA。目前，脊髓損傷相關(guān)疾病與微小RNA信號通路已成為研究熱點(diǎn)。微血管紊亂、過度炎癥和膠質(zhì)增生是脊髓損傷相關(guān)疾病的關(guān)鍵病理生理變化，且與VEGF表達(dá)密切相關(guān)［15］。彭程等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-126沉默組大鼠的脊髓組織出血水腫、神經(jīng)纖維消失，脊髓損傷嚴(yán)重，而miR-126過表達(dá)組脊髓結(jié)構(gòu)較好，組織水腫減輕；并且miR-126過表達(dá)與VEGF mRNA表達(dá)量密切相關(guān)，miRNA-126可作用于靶基因VEGF并調(diào)節(jié)VEGF蛋白表達(dá)。Alhasan［17］研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-A基因是miR-126的靶基因，miR-126高表達(dá)可以阻斷乳腺癌細(xì)胞上的VEGF-A受體功能發(fā)揮。本研究結(jié)果顯示，相比假手術(shù)組，模型組miR-126a-5p水平降低，VEGF mRNA及蛋白表達(dá)增加，提示脊髓受壓和頸椎椎間盤退變可能通過下調(diào)miR-126a-5p，從而促進(jìn)VEGF表達(dá)。在給予益氣活血通絡(luò)方灌胃后，中藥組大鼠的miR-126a-5p水平增加，VEGF mRNA及蛋白表達(dá)降低，證實(shí)了益氣活血通絡(luò)方通過上調(diào)miR-126a-5p來抑制VEGF表達(dá)?？紤]分子機(jī)制為：miR-126a-5p定位于第9號染色體表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白7基因，該結(jié)構(gòu)域可調(diào)控血管內(nèi)皮抑制素的分泌，能夠特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而抑制新生血管的生成。有研究顯示miR-126過表達(dá)可抑制血管生成，認(rèn)為這可能與miR-126低表達(dá)導(dǎo)致VEGF表達(dá)上調(diào)、血管內(nèi)皮抑制素分泌減少有關(guān)［16］。另外，從中醫(yī)理論角度分析，益氣活血通絡(luò)方含有黃芪、當(dāng)歸、生地、熟地、白芍、川芎、丹參等成分，可補(bǔ)氣升陽、生津養(yǎng)血、行滯通痹。藥理學(xué)研究已證實(shí)，黃芪、當(dāng)歸等藥物具有明顯的益氣活血作用并影響血管生成［18］。黃芪的化學(xué)成分主要為黃芪多糖、黃芪總皂苷、三萜類化合物。黃芪總皂苷可通過抑制VEGF信號通路活化下調(diào)表皮生長因子受體、磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、缺氧誘導(dǎo)因子-1、VEGF等相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成［19］。黃芪可顯著下調(diào)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子和VEGF的陽性表達(dá)量，降低關(guān)節(jié)滑膜中的血管密度，抑制大鼠胸主動脈環(huán)微血管的生成［20］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參可改善微循環(huán)，減輕炎性滲出，保護(hù)神經(jīng)功能，活血化瘀通絡(luò)［21］。在不同疾病中，丹參提取物丹酚酸B對VEGF信號通路具有雙向調(diào)節(jié)作用，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮可下調(diào)VEGF表達(dá)從而抑制血管生成，丹參酮ⅡA磺酸鈉可上調(diào)VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成［22］。

綜上所述，益氣活血通絡(luò)方治療脊髓型頸椎病的機(jī)制與上調(diào)miR-126a-5p表達(dá)、下調(diào)VEGF表達(dá)有關(guān)，該方劑可改善終板內(nèi)血管芽損傷，從而修復(fù)椎間盤退變。然而，本研究未能分析中藥不同劑量對干預(yù)結(jié)果的影響，后續(xù)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（2023-04-23收稿 2023-06-08修回）

（本文編輯 陸榮展）