液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉及其制品中游離氨基酸的研究進(jìn)展

◎ 吳 丹，蘇 敏，吳彥蕾，周純潔

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（調(diào)味品監(jiān)管技術(shù)），重慶 401121）

茶葉及代用茶是人們餐桌上的重要飲品，最初以藥用為主，后因其特有的風(fēng)味特征帶來(lái)的適宜口感，且含有生物活性物質(zhì)，具有保健功能，被廣泛應(yīng)用于日常飲食中[1-2]。茶葉及代用茶特有的香氣、滋味、生物活性與其游離氨基酸組成和含量密切相關(guān)[3-4]。氨基酸普遍具有很強(qiáng)的極性，且無(wú)紫外或熒光信號(hào)，因此需衍生化后再進(jìn)行測(cè)定，主要檢測(cè)方法有分光光度法、氣相色譜法、液相色譜（Liquid Chromatography，LC）法及毛細(xì)管電泳法等[5-6]。衍生化技術(shù)雖然可以解決色譜分離度和檢測(cè)器的限制，但衍生化預(yù)處理操作復(fù)雜，容易出現(xiàn)衍生不完全、雜質(zhì)干擾大、重現(xiàn)性差等問(wèn)題，且現(xiàn)有的衍生化試劑適用范圍較窄、毒性較大。因此，近年來(lái)科研工作者將游離氨基酸檢測(cè)的重點(diǎn)集中在非衍生化直接檢測(cè)方面。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)結(jié)合了LC 強(qiáng)大的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS/MS）的高選擇性、高靈敏度、高準(zhǔn)確性等優(yōu)勢(shì)，可直接測(cè)定食品中的游離氨基酸，已成為非衍生化氨基酸的理想分析手段[7-8]。本文對(duì)近年來(lái)LC-MS/MS 技術(shù)在直接檢測(cè)茶葉及代用茶中非衍生化的游離氨基酸組成及含量方面的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為游離氨基酸檢測(cè)方法的開發(fā)和研究提供理論參考。

1 LC-MS/MS 概述

1.1 LC 技術(shù)

LC 以液體為流動(dòng)相，通過(guò)裝有固定相的色譜柱分離各成分后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[9]。反相色譜法是LC 中應(yīng)用最廣泛的一種分離方法，利用各成分在非極性固定相和極性更強(qiáng)的流動(dòng)相中溶解、分配、吸附等相互作用的差異實(shí)現(xiàn)分離。氨基酸普遍具有很強(qiáng)的極性，若不經(jīng)過(guò)衍生化預(yù)處理直接測(cè)定，難以在反相色譜柱上獲得理想的保留效果和分離度。親水作用色譜（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography，HILIC）是一類新型色譜分離技術(shù)，采用極性固定相和水-水溶性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，可為強(qiáng)極性和離子型化合物提供理想的保留效果和分離選擇性，在非衍生化氨基酸檢測(cè)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注[10]。

1.2 MS/MS 技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)是一種測(cè)量離子質(zhì)荷比的分析技術(shù)，常用的質(zhì)量分析器有低分辨的四極桿質(zhì)譜和線性離子阱質(zhì)譜，以及高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜和靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜[11-12]。四極桿質(zhì)譜具有優(yōu)良的離子過(guò)濾能力，將其串聯(lián)或與其他質(zhì)量分析器串聯(lián)，可有效提高分析的靈敏度和準(zhǔn)確性，因此常用的MS/MS 均以四極桿質(zhì)譜作為第一級(jí)質(zhì)量分析器。三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜是目前應(yīng)用最廣泛的一類低分辨MS/MS，通過(guò)其特有的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描離子對(duì)，可有效降低背景噪音的干擾，在復(fù)雜基質(zhì)中痕量物質(zhì)定量分析方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。與三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜相比，四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜具有離子儲(chǔ)存能力，可獲得多級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息，定性能力更強(qiáng)。四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜和四極桿串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜均屬于高分辨MS/MS，具有更快的掃描速度和更高的質(zhì)量分辨率，在非靶向的未知物鑒定和高通量篩查方面更具優(yōu)勢(shì)。

2 在游離氨基酸檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 茶葉

茶葉中的氨基酸種類豐富，目前已發(fā)現(xiàn)的有20 多種，其中游離氨基酸總含量占茶葉干重的1%～4%，是決定茶葉品質(zhì)的重要因素[13-14]。茶氨酸是茶葉中特有的氨基酸，占茶葉中游離氨基酸總量的50%左右，具有降血壓、抗疲勞、增強(qiáng)記憶力的功效，是茶葉鮮爽滋味的主要來(lái)源[15-16]。杜穎穎等[17]采用ACE EXCEL 2U AQ 色譜柱建立了茶葉中20 種氨基酸的LC-QqQ 檢測(cè)方法，實(shí)際樣品分析結(jié)果顯示黃化品種綠茶（九凝飛黃）中茶氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和絲氨酸的含量明顯高于白茶（白牡丹）和紅茶（英德紅茶），游離氨基酸總量為九凝飛黃＞白牡丹＞英德紅茶。戴明等[18]采用LC-QqQ建立了鐵觀音茶中21 種游離氨基酸的檢測(cè)方法，對(duì)比了21 種氨基酸在HILIC 模式的BEH HILIC、BEH AMIDE、CAPCELL PAK CR 1 ∶4 ST 色譜柱上的分離效果，發(fā)現(xiàn)CAPCELL PAK CR 1 ∶4 ST 色譜柱分離效果最好，選取的8 個(gè)安溪鐵觀音茶樣品檢測(cè)結(jié)果表明，茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸為鐵觀音中主要氨基酸，其中茶氨酸占游離氨基酸總量的40%～60%。李東芹等[19]采用LC-Q-Trap 建立了茶葉中18 種游離氨基酸的檢測(cè)方法，通過(guò)反相Shim-pack VP-ODS 色譜柱進(jìn)行梯度洗脫分離，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量，對(duì)福鼎大白茶、浙農(nóng)117、迎霜3個(gè)茶樹品種的一芽一葉、第二葉、老葉3 個(gè)部位樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，一芽一葉內(nèi)氨基酸含量最高。王忠合等[20]采用高分辨的LC-Q-TOF技術(shù)建立了單叢烏龍茶中22 種氨基酸的直接測(cè)定方法，對(duì)比了SB-C18柱、EC-C18柱、HILIC-Z 柱對(duì)22 種氨基酸的分離效果，發(fā)現(xiàn)HILIC-Z 柱對(duì)22 種氨基酸的分離效果優(yōu)于其他2 種反相色譜柱，對(duì)5 種單叢烏龍茶中游離氨基酸分析結(jié)果表明，單叢烏龍茶中茶氨酸、谷氨酸、精氨酸、絲氨酸及天冬氨酸含量較高。劉藝靜等[21]采用高分辨的LC-Q-Orbitrap技術(shù)，基于OTCML 中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和m/zCloud、Pub Chem、Chem Spider 在線數(shù)據(jù)庫(kù)，在白茶和普洱生茶中分別鑒定出7 種和9 種氨基酸。

2.2 代用茶

代用茶是一種茶葉替代品，又名花草茶，是指采用除茶以外的可用于食品的植物的葉、花、果（實(shí)）及根莖等為原料加工制作的，采用類似茶葉沖泡（浸泡）方式供人們飲用的產(chǎn)品[1,22]。我國(guó)代用茶品種已有100 多種，由于代用茶本身具有一些保健功能，年輕的消費(fèi)者逐漸增多，成為茶葉制品中一類新增長(zhǎng)的消費(fèi)產(chǎn)品。孫慧娟等[23]采用HILIC 模式的XBridge Amide 色譜柱建立了薄荷中21 種氨基酸的LC-QqQ檢測(cè)方法，通過(guò)主成分分析和優(yōu)劣解距離法對(duì)3 個(gè)不同產(chǎn)地樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示亳州產(chǎn)薄荷的氨基酸總量最高，阜陽(yáng)次之，商丘最低，其中谷氨酸平均含量最高，脯氨酸最低。王從成等[24]采用HILIC模式的BEH Amide 色譜柱建立了玫瑰花中20 種氨基酸的LC-QqQ 檢測(cè)方法，對(duì)7 個(gè)產(chǎn)地50 批次玫瑰花進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)顯示玫瑰花中谷氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及絲氨酸等含量較高，四川雙流和河北圍場(chǎng)的玫瑰花品質(zhì)較好。趙珊等[25]采用BEH HILIC 色譜柱建立了代用茶茶湯中21 種游離氨基酸的LC-QqQ 檢測(cè)方法，選取的18 種代用茶中共檢出18 種游離氨基酸，以精氨酸、天冬酰胺、脯氨酸為主，以玫瑰花中游離氨基酸總量最高。

3 結(jié)語(yǔ)

茶葉及代用茶中游離氨基酸組成和含量豐富，對(duì)茶湯的鮮爽特征風(fēng)味和生物活性功能的形成具有顯著影響，是茶葉的重要品質(zhì)指標(biāo)。隨著LC-MS/MS 技術(shù)的不斷發(fā)展，游離氨基酸檢測(cè)方法正在向無(wú)須衍生、操作簡(jiǎn)便、選擇性好、靈敏度和準(zhǔn)確性高的方向發(fā)展。HILIC 分離模式結(jié)合MS/MS 技術(shù)將會(huì)使茶葉中游離氨基酸分析在靈敏度、準(zhǔn)確度、選擇性和實(shí)用性方面均提高到一個(gè)嶄新的水平。