5-氟尿嘧啶溫?zé)峄煂?duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株的促細(xì)胞凋亡作用研究*
2024-03-31 12:49:24林明偉董功航張建興
黑龍江醫(yī)藥 2024年6期
徐 鵬，林明偉，董功航，張建興，郝 俊
1.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽外科，廣東 深圳 518104；2.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院體檢科，廣東 深圳 518104；3.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，廣東 深圳 518104；4.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胃腸外科，廣東 深圳 518104
胰腺癌占全部惡性腫瘤的1%～2%，早期難以發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已屬于晚期。轉(zhuǎn)移率高，手術(shù)率低，僅10%～20%的患者能做根治手術(shù)，術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)80%以上。死亡率高，1 年生存率不到10%，5 年生存率低于4%，晚期胰腺癌中位生存期僅為3 個(gè)月左右［1］。胰腺癌侵犯周圍臟器或脫落的癌細(xì)胞種植于腹膜，這是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源，治療上不僅要清除病灶及可能受侵的淋巴結(jié)，還應(yīng)完全殺滅脫落的癌細(xì)胞。持續(xù)腹腔熱灌注化療（HIPEC）是一種用于腫瘤的溫?zé)峄煼桨?，是充分混合化療藥物與熱灌注液后在恒溫狀態(tài)下持續(xù)循環(huán)地直接灌注到腹腔內(nèi)，綜合機(jī)械灌洗、化療、熱療等作用，持續(xù)一段時(shí)間后直接消除腫瘤患者在惡性腫瘤根治術(shù)后腹腔中殘留的癌性病灶，或者局部殺滅腹腔中已轉(zhuǎn)移的癌性病灶［2］。研究［3-4］表明，在惡性腫瘤根治術(shù)中實(shí)施HIPEC 化療可在極大程度上降低腹腔、盆腔中腫瘤的播散率，提升患者的總生存率。為提升HIPEC 化療在腫瘤臨床中的使用價(jià)值，需對(duì)其在腫瘤具體治療中加強(qiáng)研究，如探索在腹腔內(nèi)溫?zé)峄熤杏行Ь植考訜岬膯栴}，以求局部溫?zé)峄煾吆侠硇?、安全性。本研究建立HIPEC 化療對(duì)胰腺癌細(xì)胞體外作用模型，探究5-FU HIPEC 化療下促進(jìn)胰腺腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并探尋HIPEC 在胰腺癌Panc-1 細(xì)胞株凋亡過程中所發(fā)揮抗癌細(xì)胞協(xié)同作用的機(jī)制與熱療的最佳溫度，為胰腺癌化療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。
1 材料與方法
1.1 材料來源
本研究采用的人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1來源于中山醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。5-氟尿嘧啶（5-FU）與二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma-Aldrich公司，DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素與鏈霉素購自美國Gibco公司，Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司。器械包括臺(tái)式高速離心機(jī)（型號(hào)TGL16G）、生物潔凈工作臺(tái)（型號(hào)BCM-1OOOA 型）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)BNA-311 型）、雪花制冰機(jī)（產(chǎn)自日本三洋公司，型號(hào)SIM-F124）、超純水制造系統(tǒng)（型號(hào)Mi1i-Q）、流式細(xì)胞儀（型號(hào)Epics-XL2型）、微量加樣器（產(chǎn)自德國Eppendorf公司）。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 在無菌培養(yǎng)瓶接種人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1，后加入含有100 mg/mL 鏈霉素、100 μ/mL 青霉素、10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，之后將其放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱，提前設(shè)置培養(yǎng)溫度為恒溫37 ℃、相對(duì)濕度為95%、CO2濃度為5%，培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)48 h，達(dá)到對(duì)數(shù)生長期。使用濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，3 min后終止反應(yīng)，行吹打操作，將其制備成單細(xì)胞懸液，每毫升準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，其中細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，備用［5］。
1.2.2 5-FU 工作濃度的設(shè)定 5-FU 工作濃度使用既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果，濃度為500 μg/mL。
1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 本次共劃分為4 組，即空白對(duì)照組、化療組、熱療組、溫?zé)峄熃M。通過嵌套式的設(shè)計(jì)，設(shè)置每組的處理方式。空白對(duì)照組以37 ℃處理，但不使用5-FU化療藥，化療組使用5-FU 處置，藥物濃度為500 μg/mL，熱療組則使用不同溫度進(jìn)行溫?zé)崽幹?，而溫?zé)峄熃M既使用5-FU處置，濃度500 μg/mL，又使用不同溫度進(jìn)行溫?zé)崽幹?。其中，熱療組與溫?zé)峄熃M不同溫度均為40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃。
1.2.4 實(shí)驗(yàn)各組處理方法 在6 孔無菌培養(yǎng)板中接種Panc-1細(xì)胞，達(dá)到對(duì)數(shù)生長期后，在培養(yǎng)板上設(shè)立空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，其中3 孔作為一個(gè)平行樣本。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前將原有的培養(yǎng)基除去，據(jù)實(shí)際情況分組，并實(shí)施相對(duì)應(yīng)的處置方案。不同組別處置方式不同。（1）空白對(duì)照組：將2 mL 培養(yǎng)液加入至每個(gè)培養(yǎng)孔中，并使用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，其中37 ℃為生理溫度。（2）化療組：每個(gè)培養(yǎng)孔中加入2 mL 含5-FU 培養(yǎng)液，其中化療藥濃度500 μg/mL，后放置在培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。Panc-1 細(xì)胞與5-FU 的接觸時(shí)間是24 h。（3）熱療組：每個(gè)培養(yǎng)孔中加入2 mL 培養(yǎng)液，之后分別放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為相對(duì)濕度95%、CO2濃度5%，而溫度為40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃（由CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行溫控調(diào)節(jié)，且允許有±0.1 ℃的誤差），均孵育60 min。熱療完畢后，將其繼續(xù)放置在培養(yǎng)體系中培養(yǎng)23 h。（4）溫?zé)峄熃M：每個(gè)培養(yǎng)孔中加入2 mL 含5-FU 培養(yǎng)液，其中，化療藥濃度500 μg/mL，即刻將其分別放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為相對(duì)濕度95%、CO2濃度5%，而溫度為40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃，均孵育60 min。熱療完畢后，將其繼續(xù)放置在培養(yǎng)體系中培養(yǎng)23 h。
1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)
（1）細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。處置完畢后，4 組的細(xì)胞均使用Annexin V/PI 雙標(biāo)記法及配套細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)得的散點(diǎn)圖中，右上的第一象限為晚期壞死細(xì)胞與凋亡細(xì)胞，表示（＋＋）；左上的第二象限為死亡細(xì)胞，表示（—＋）；左下的第三象限為活細(xì)胞，表示（——）；右下的第四象限為早期凋亡細(xì)胞，表示（＋—）。胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1 細(xì)胞凋亡率取第一象限與第四象限檢測(cè)到的凋亡率之和。上述實(shí)驗(yàn)組均為3 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞凋亡率的最終結(jié)果是3 個(gè)復(fù)孔的平均值。（2）熱療和化療聯(lián)合作用的觀察。選取熱療組、化療組與溫?zé)峄熃M，按照Veleriote 法對(duì)熱療聯(lián)合化療的相互作用進(jìn)行判定。其中，［C］=［E］為相加作用，［C］＞［E］為協(xié)同作用，［D］＞［C］＞［H］為干擾作用，［E］＞［C］＞［D］或者［E］＞［C］＞［H］為次加作用。上述符號(hào)釋義：熱療組細(xì)胞凋亡率為［H］，化療組細(xì)胞凋亡率為［D］，溫?zé)峄熃M細(xì)胞凋亡率為［C］，熱療與化療聯(lián)合預(yù)估細(xì)胞凋亡率為［E］。計(jì)算公式為［E］=［H］+［D］-［H］×［D］［6］。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 熱化療增敏效應(yīng)情況
5-FU 促胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1 細(xì)胞凋亡時(shí)，對(duì)溫度有較強(qiáng)的依賴性，在溫度為40～45 ℃時(shí)，促凋亡作用會(huì)伴隨溫度升高而增強(qiáng)。促凋亡作用在溫度為43～45 ℃時(shí)驟然增強(qiáng)，且在溫度為45 ℃時(shí)，促凋亡作用達(dá)到最大。在溫度為43～45 ℃時(shí)，溫?zé)峄熃M相比于化療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在溫度為40～42 ℃時(shí)，溫?zé)峄熃M相比于化療組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1、圖1～4。
圖1 對(duì)照組（37 ℃）凋亡流式細(xì)胞散點(diǎn)圖
圖2 5-FU化療組（500 μg/mL）凋亡流式細(xì)胞散點(diǎn)圖
圖3 溫?zé)峤M（45 ℃）凋亡流式細(xì)胞散點(diǎn)圖
圖4 溫?zé)峄熃M（43 ℃、500 μg/mL）凋亡流式細(xì)胞散點(diǎn)圖
表1 溫?zé)峄煂?duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞的促凋亡作用（±s）
表1 溫?zé)峄煂?duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞的促凋亡作用（±s）
注：P1值為溫?zé)峄熃M與熱療組相比較，P2值為溫?zé)峄熃M與化療組相比較。
組別化療組溫?zé)峄熃MP2值37 ℃0 13.6±0.52 40 ℃0.50±0.32 16.54±0.67＞0.05 41 ℃0.54±0.32 16.67±1.18＞0.05 42 ℃0.82±0.14 17.83±1.26＞0.05 43 ℃2.10±0.33 20.12±0.32＜0.05 44 ℃5.07±0.32 23.34±1.31＜0.05 45 ℃13.52±0.40 28.10±2.67＜0.05 P1值＜0.05
2.2 促人胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡率情況
溫?zé)峄熃M人胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡率大于預(yù)估凋亡率，溫?zé)峄煶蕝f(xié)同作用，見表2。
表2 促人胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡率情況 %
3 討論
目前，胰腺癌化療、放療是臨床除去手術(shù)之外療效顯著的兩大手段。有研究［7］表明，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是化療藥遏制癌癥病灶生長的作用機(jī)制之一，但誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡與否已成為抑制癌生長能力判斷的重要指標(biāo)。胰腺癌化療的常用藥物5-FU 可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制。HIPEC 結(jié)合溫?zé)岑煼ㄅc腹腔化療的優(yōu)勢(shì)，在治療胰腺癌及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面療效獨(dú)特，溫?zé)峄煏?huì)影響胰腺癌腫瘤細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜、大分子合成及DNA修復(fù)機(jī)制，同時(shí)，溫?zé)峄熯€會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞產(chǎn)生大量的溶酶體，激活溶酶體酶的活性，從而抑制癌生長能力，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡率加快［8］。
3.1 溫?zé)峄煂?duì)癌細(xì)胞具殺傷作用
本研究結(jié)果表明，溫?zé)峄熓歉纳漂熜А⒋偌?xì)胞凋亡的有效方案。但單一熱療仍存在一定問題，即溫度過高會(huì)導(dǎo)致人體正常細(xì)胞受損，且極易導(dǎo)致部分癌細(xì)胞出現(xiàn)耐熱性，因而不適合單一應(yīng)用。因此，在胰腺癌患者化療配合體內(nèi)熱療時(shí)，既需要關(guān)注溫度過低導(dǎo)致療效受影響的問題，又需要避免過高的溫度導(dǎo)致人體正常細(xì)胞受損，或?qū)е掳┘?xì)胞出現(xiàn)耐熱性的問題［9］。
3.2 溫?zé)峄煂?duì)化療具增敏效果
本研究分析發(fā)現(xiàn)，在5-FU 藥物濃度相同的情況下，在溫度為40～45 ℃時(shí)，各組促凋亡作用均高于37 ℃空白對(duì)照組。促凋亡作用在溫度為43～45 ℃時(shí)驟然增強(qiáng)，且在溫度為45 ℃時(shí)促凋亡作用達(dá)到最大，結(jié)果表明熱療對(duì)化療具增敏效果。當(dāng)熱療溫度超過40～45 ℃時(shí)，人體難以耐受，會(huì)損傷正常細(xì)胞。在5-FU 藥物濃度相同的情況下，溫?zé)峄熃M殺傷胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1細(xì)胞的作用明顯強(qiáng)于熱療組，究其原因?yàn)闊岫燃饶軐⒁认侔┘?xì)胞直接殺傷，又可進(jìn)一步提升癌細(xì)胞胞漿中5-FU 的藥物濃度，以此強(qiáng)化5-FU 的促細(xì)胞凋亡作用［10］。熱化療增強(qiáng)化療藥殺傷效果的這一特點(diǎn)在腫瘤臨床上具有顯著意義，一是熱化療可增強(qiáng)癌細(xì)胞或耐藥癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，改善療效；二是熱化療可明顯降低化療藥物的實(shí)際用量，大幅度減弱因化療所產(chǎn)生的毒副作用［11］。
3.3 溫?zé)峄熢雒舫潭?/h3>
本研究依據(jù)Veleriote 法對(duì)溫?zé)峄煹淖饔眠M(jìn)行判定發(fā)現(xiàn)，在溫度為41～45 ℃時(shí)，其呈現(xiàn)為協(xié)同作用，且相比于熱療加化療的促細(xì)胞凋亡作用，溫?zé)峄煹淖饔酶@著。在溫度為43～45 ℃時(shí)，相比于化療組，溫?zé)峄熃M的促細(xì)胞凋亡作用更強(qiáng)，在溫度為40～43 ℃時(shí)，溫?zé)峄煹臒嵩雒粜Ч用黠@，且在溫度為43～45 ℃時(shí)，溫?zé)峄煹膮f(xié)同作用明顯，證實(shí)在溫度為43～45 ℃時(shí)，5-FU HIPEC 的促胰腺癌細(xì)胞凋亡的效果佳。因此，對(duì)臨床實(shí)際情況充分考慮后，建議43 ℃可作為最佳溫度［12］。
3.4 溫?zé)峄熥饔迷?/h3>
（1）胰腺癌屬于厭氧腫瘤，因其對(duì)放療、化療的敏感性偏低，但臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)溫?zé)岬拿舾行云撸鳫IPEC 化療正是利用胰腺癌細(xì)胞、正常組織細(xì)胞兩者間溫度耐受性的差異而實(shí)施的［13］。正常組織細(xì)胞可耐受高溫，溫度為45 ℃，而在溫度為40～43 ℃時(shí)，癌細(xì)胞或癌癥病灶會(huì)受溫度影響導(dǎo)致相關(guān)功能缺乏，難以散熱，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞被滅活、凋亡［14］。（2）熱療與腹腔灌注化療的作用相互協(xié)同。HIPEC 的化療方式能在極大程度上催化5-FU 與胰腺癌細(xì)胞DNA 兩者間的加聚反應(yīng)，進(jìn)一步提升癌細(xì)胞對(duì)5-FU 的敏感性，強(qiáng)化5-FU 促胰腺癌細(xì)胞的凋亡傷作用，且溫?zé)峄熢跇O大程度上對(duì)化療后癌細(xì)胞的DNA修復(fù)加以抑制。除此之外，在溫度為43 ℃時(shí)，能進(jìn)一步將腫瘤細(xì)胞膜的穩(wěn)定狀態(tài)破壞，增加5-FU 的滲透深度，從既往的1～2 mm 延伸至5 mm，以此大幅度提升腫瘤細(xì)胞中化療藥物的濃度［15］。（3）在藥代動(dòng)力學(xué)方面HIPEC化療的優(yōu)勢(shì)明顯。腹腔內(nèi)化療的給藥方式可促使腹腔中5-FU 的血藥濃度維持在較高水平，減低外周血藥濃度。故而，HIPEC 化療既可強(qiáng)化5-FU 對(duì)腹膜表面轉(zhuǎn)移癌的直接細(xì)胞毒性作用，又可大大降低胰腺癌患者的全身毒副作用［16-18］。（4）高濃度5-FU 經(jīng)過肝門靜脈吸收后進(jìn)入肝臟，對(duì)于晚期胰腺癌患者已轉(zhuǎn)移至肝臟的癌細(xì)胞及癌栓具有較強(qiáng)的殺傷作用［19］。（5）胰腺癌患者HIPEC 過程中，利用灌注液子阿腹腔中持續(xù)流動(dòng)循環(huán)效果，對(duì)腹腔中游離的胰腺癌細(xì)胞、腹膜上種植轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞發(fā)揮機(jī)械性沖刷的作用，以此進(jìn)一步清除胰腺癌患者腹腔中微小轉(zhuǎn)移灶及殘留的癌細(xì)胞。
綜上所述，5-FU HIPEC 化療具有促胰腺癌Panc-1 細(xì)胞株凋亡的作用，43 ℃是溫?zé)峄焻f(xié)同作用的最佳溫度。
