擬南芥35S∶NAS2載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因株系的篩選

王婷婷, 曹樹青, 吳 席, 賈亞峰, 陳逸凡, 樊婷婷

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

鐵是植物生長發(fā)育所必需的元素,參與植物生長的全過程。鐵也是人們最早發(fā)現(xiàn)的植物微量元素,早在1843年發(fā)現(xiàn)生長在石灰性土壤上的葡萄葉片失綠癥與缺鐵有關(guān),后經(jīng)植物學(xué)家研究,將鐵確定為植物生長的必需微量元素。土壤中的鐵含量豐富,但可利用的鐵含量是有限的[1]。鐵在土壤中的溶解度特別低,以離子形式游離地存在于土壤中,很難與其他物質(zhì)結(jié)合,因此導(dǎo)致植物能從土壤中吸收和利用的鐵非常少[2]。在許多干旱、半干旱地區(qū)的石灰性土壤上廣泛存在植物缺鐵問題[3]。雖然植物根部吸收鐵的機制已有大量的研究,但對植物感知缺鐵機理的了解較少[4]。植物生長需要最佳水平的鐵,鐵用于能量生產(chǎn)、許多酶促過程,并且對于細胞代謝都是必不可少的[5]。植物缺鐵會導(dǎo)致生長發(fā)育受限,引發(fā)植物缺鐵性黃化病出現(xiàn),可食用植物是人類一大飲食來源,植物的鐵缺乏也會損害人類的健康[6]。

因此,運用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)對植物品系進行改良優(yōu)化顯得格外重要。在之前的研究中發(fā)現(xiàn),BZIP44和NAS2基因均參與到擬南芥的鐵穩(wěn)態(tài)中,BZIP44功能缺失突變體對缺鐵表現(xiàn)敏感,NAS2功能缺失突變體對缺鐵表現(xiàn)也敏感,且BZIP44功能缺失突變體在缺鐵脅迫下NAS2基因表達紊亂,但這2個基因在植物的鐵穩(wěn)態(tài)中的遺傳關(guān)系尚不清楚,為了進一步研究這2個基因?qū)τ谡{(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的機制,本文分別構(gòu)建35S∶NAS2/WT和35S∶NAS2/bzip44轉(zhuǎn)基因植株,為后續(xù)研究的開展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

植物是哥倫比亞(col) 遺傳背景的野生型(wild type,WT)擬南芥(Arabidopsisthaliana);T-DNA插入突變體bzip44-1(SALK-084241)從美國擬南芥種質(zhì)資源中心獲得,由合肥工業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實驗室繁殖所得;載體構(gòu)建所用質(zhì)粒pART27,大腸桿菌DH5α,農(nóng)桿菌GV3101。

1.1.2 主要試劑

Plasmid miniprep Kit (TIANGEN),T4-DNA Ligase(NEB),限制性內(nèi)切酶KpnⅠ(NEB),HinDⅢ (NEB),PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa),2×San Taq PCR Mix(Sangon Biotech),DNA loading buffer,異丙醇,無水乙醇,氯仿,SDS,Tris-HCl,RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)等。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥無菌苗的培養(yǎng)

配制MS固體培養(yǎng)基,稱取MS、瓊脂和蔗糖,待溶解后調(diào)節(jié)其pH值至 5.8,封上封口膜后用高壓滅菌鍋121 ℃、101 kPa高壓蒸汽滅菌20 min,滅菌后得到無菌固體培養(yǎng)基,并將其倒入同樣滅菌后的培養(yǎng)皿中。用0.1% 氯化汞對種子殺菌消毒后,將種子均勻點在培養(yǎng)基上。4 ℃冰箱中春化2 d,在22 ℃、16 h光照時長的培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng) 14 d。

1.2.2 擬南芥RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

實驗前將研缽洗凈烘干后,用錫箔紙包好,置于180 ℃烘箱烘4 h,待冷卻至室溫后再放到-20 ℃冰柜預(yù)冷。將樣品置于預(yù)冷的研缽中,加液氮研磨,組織充分研碎后,加入1 mLTrizol溶液,繼續(xù)研磨至完全融化。室溫放置5 min,使樣品充分裂解。離心機4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液靜置5 min。加入0.2 mL氯仿,劇烈震蕩晃動15 s后,室溫放置5 min。離心機4 ℃、12 000 r/min離心15 min,吸取500 μL含總RNA的上層無色液體至新的離心管中。加入0.5 mL異丙醇,顛倒混勻后于室溫下放置沉淀10 min。離心機4 ℃、12 000 r/min離心10 min,棄上清。加入1 mL用DEPC水配制的75%乙醇溶液,顛倒混勻。離心機4 ℃、7 500 r/min離心5 min,棄上清。待RNA晾干后加入20 μL DEPC水溶解,檢測純度及濃度,-20 ℃冰箱保存。

將檢測好純度和濃度的總RNA,根據(jù)Thermo Scientific公司提供的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)合成cDNA。反應(yīng)總體系為20 μL,在冰上進行操作,產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 擬南芥DNA的提取

取出于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的擬南芥,置于預(yù)冷的研缽中,加入液氮研磨至粉碎后,加入400 μL SDS DNA提取液繼續(xù)研磨,待充分研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中,12 000 r/min、4 ℃離心10 min后,取上清液200 μL于另一新的離心管中,再加入200 μL異丙醇,12 000 r/min離心10 min,離心后棄去管中的上清液,加入800 μL體積分數(shù)為70%的乙醇,12 000 r/min離心5 min。離心后去上清,將沉淀置于通風櫥15 min,待乙醇蒸發(fā)后,加入30 μL的無菌雙蒸水,獲得DNA溶液,置于-20 ℃冷凍保存。

1.2.4NAS2的CDS區(qū)域基因片段的克隆

利用Oligo 7.0軟件設(shè)計以下引物進行NAS2的CDS區(qū)域基因片段克隆。上游引物FP為:

3’-GAGAACACGGGGGACGGTACCATGGCT

TGCGAAAACAACCTC-5’;

下游引物RP為:

5’-GGGGAAATTCGAGCTAAGCTTTTACTCGA

TGGCACTATACTCCTCG-3’。

以野生型擬南芥RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為擴增模板進行克隆。

1.2.5 大腸桿菌和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

從-80 ℃冰箱中取出存儲的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,放置于冰上自然溶解。吸取 5 μL連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中,吹打混勻,冰上放置30 min,在42 ℃金屬浴中熱激 60 s,再放置于冰上冷激 2 min。在熱激和冷激后的感受態(tài)中加入無抗性的600 μL LB 液體培養(yǎng)基,放在 37 ℃恒溫搖床中低速振蕩培養(yǎng)1～2 h。待培養(yǎng)完成后,涂布于加有壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上。平板倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日挑取培養(yǎng)基上的單菌落,接種于加入壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)6 h后進行聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)鑒定,選取陽性克隆進行測序,并對結(jié)果分析比對,正確后得到具有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。

取出存儲于-80 ℃冰箱中的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞(GV3101),置于冰上解凍。取2 μL重組質(zhì)粒加入到感受態(tài)細胞中,混勻,吸取至已預(yù)冷的1 cm電擊杯中,在電轉(zhuǎn)儀中電擊后迅速加入600 μL無抗性的LB 液體培養(yǎng)基,28 ℃搖床培養(yǎng)2～3 h,涂布于同時添加有壯觀霉素和慶大霉素的固體LB培養(yǎng)基上,置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)皿上挑取單菌落接種于添加有壯觀霉素和慶大霉素的液體培養(yǎng)基中,28 ℃搖床培養(yǎng)至指數(shù)增長期,然后進行PCR鑒定。

1.2.6 浸花侵染法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥

將陽性農(nóng)桿菌接種于添加有壯觀霉素和慶大霉素的液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至A600為1.2～1.4,離心去上清,用侵染緩沖液重懸至溶液A600為0.8～1.2,最后加入一定量的表面活性劑SilwettL-77 混勻,侵染花序,黑暗處理12 h。第1次侵染后隔8 d,進行第2次侵染。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定

將獲得的擬南芥種子置于含有卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基中進行抗性篩選,培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d,將具有根且子葉顏色嫩綠的幼苗移栽至土質(zhì)培養(yǎng)基中,再提取DNA,經(jīng)PCR鑒定正確后,即獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAS2的CDS區(qū)域的克隆結(jié)果

為了確定NAS2基因在擬南芥突變體bzip44響應(yīng)缺鐵脅迫中的作用,本文構(gòu)建35S∶NAS2/bzip44載體。以擬南芥野生型的cDNA作為模板,采用PCR技術(shù)擴增片段,得到NAS2的CDS區(qū)域,且片段大小與NAS2的實際大小963 bp一致,如圖1所示。圖1中,M代表Marker,下同。

2.2 目的片段和質(zhì)粒雙酶切

使用KpnⅠ、HindⅢ 2種限制性內(nèi)切酶對NAS2的CDS區(qū)域以及pART27質(zhì)粒進行酶切,如圖2所示,得到具有相同黏性末端的片段和質(zhì)粒,且片段大小與NAS2的實際大一致,質(zhì)粒大小與pART27質(zhì)粒的實際大小一致。

圖2 NAS2和pART27的雙酶切

2.3 連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化后陽性克隆鑒定

用T4連接酶將酶切后的目的片段和質(zhì)粒在16 ℃的條件下進行過夜連接,得到的連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中,將菌涂布于加有壯觀霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,挑取單克隆菌落置于加有壯觀霉素的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁。將得到的單克隆菌液進行PCR鑒定,如圖3所示,選擇2號菌送去測序,經(jīng)測序后選擇測序正確的2號菌液進行后續(xù)實驗。圖3中,1～7號表示在培養(yǎng)基中隨機挑取的大腸桿菌單克隆菌落培養(yǎng)的菌液。

圖3 大腸桿菌PCR鑒定結(jié)果

2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化分析

將重組質(zhì)粒用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)中,鑒定結(jié)果如圖4所示,選取3號菌進行擴大培養(yǎng)。圖4中,1～7號表示在培養(yǎng)基中隨機挑取的農(nóng)桿菌單克隆菌落培養(yǎng)的菌液。

圖4 農(nóng)桿菌PCR鑒定結(jié)果

2.5 擬南芥bzip44突變體鑒定及花序侵染分析

為了確保實驗的成功,需要鑒定被侵染的擬南芥株系是否為純合的bzip44突變體植株,分別用bzip44的FP和RP以及SALK BP和bzip44的RP進行鑒定,用bzip44的FP和RP鑒定,如圖5a所示,1～6號沒有條帶,野生型有大小為1 500 bp的條帶,說明被檢測的擬南芥株系中沒有BZIP44基因,用SALK BP和bzip44的RP鑒定,如圖5b所示。圖5中,1～7號表示土培的bzip44純合體植株。

圖5 bzip44突變體鑒定結(jié)果

由圖5b可知,野生型沒有條帶,但1～6號有大小為600 bp的條帶,說明SALK BP有插入到擬南芥的這些株系中,因此1～6號都為純合體。接著采用浸花浸染法分別侵染野生型(WT)擬南芥和bzip44突變體植株,反復(fù)侵染3遍得到侵染后的種子。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選分析

將侵染后收到的種子撒在加有卡那霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基中,得到的陽性植株如圖6所示。

圖6 陽性植株篩選結(jié)果

2.7 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定結(jié)果分析

提取陽性植株的DNA進行鑒定,結(jié)果如圖7所示。

圖7 陽性植株鑒定圖

圖7中,1～7號表示抗性篩選出的疑似陽性植株,且片段大小與NAS2的實際大小一致,根據(jù)鑒定結(jié)果選擇1號植株作為陽性35S∶NAS2/WT植株,并選擇1號植株作為陽性35S∶NAS2/bzip44植株,進一步通過抗性分離純合得到陽性植株。

2.8 純合體篩選結(jié)果分析

將鑒定正確的陽性植株進行土培繁殖,每一代植株都采用抗性分離比篩選,如圖8所示,在第3代得到純合的35S∶NAS2/WT和35S∶NAS2/bzip44植株。

圖8 轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比

3 討 論

土壤缺鐵問題在全球都很普遍,大約有1/3的可耕種土壤存在缺鐵問題[7]。與此同時,土壤缺鐵問題帶來的副作用也會接踵而至,如植物缺鐵性黃化病、缺鐵嚴重時還會出現(xiàn)葉片灰白的現(xiàn)象等,甚至會危及到人類的健康[8],因此解決土壤缺鐵引發(fā)的植物缺鐵問題至關(guān)重要。

本研究涉及到的轉(zhuǎn)錄因子為bZIP家族中的BZIP44基因,bZIP轉(zhuǎn)錄因子是所有真核生物都具有的轉(zhuǎn)錄因子[9]。有報道稱bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物干旱脅迫響應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用,并在水稻中發(fā)現(xiàn)了一種新型的干旱脅迫相關(guān)bZIP轉(zhuǎn)錄因子OsbZIP62,該基因參與ABA信號通路,通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達正向調(diào)控水稻的耐旱性[10]。

本研究所用種子從擬南芥種子資源中心獲得,分別為擬南芥哥倫比亞背景的野生型和BZIP44基因功能缺失型突變體。前期研究結(jié)果顯示,BZIP44基因參與植物對缺鐵脅迫的響應(yīng),且其可以通過調(diào)控NAS2基因的表達參與植物對缺鐵脅迫的響應(yīng),為了進一步研究基因NAS2和BZIP44在擬南芥缺鐵脅迫響應(yīng)中的遺傳關(guān)系,通過基因工程技術(shù)構(gòu)建35S∶NAS2重組載體,分別將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥和BZIP44基因功能缺失型突變體中,從而獲得35S∶NAS2/WT及35S∶NAS2/bzip44轉(zhuǎn)基因植株。本文為研究NAS2基因和BZIP44基因在植物體中響應(yīng)缺鐵脅迫的遺傳關(guān)系奠定了良好的基礎(chǔ)。