新型酸響應(yīng)聚集型金納米粒子制備與光熱性能

汪 翔, 孫天賜, 肖正昊, 王慧慶

(合肥工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,安徽 合肥 230009)

0 引 言

近紅外光熱治療腫瘤是將有光熱轉(zhuǎn)換功能的納米材料注射聚集于腫瘤組織,在外部近紅外光源的照射下材料將光能轉(zhuǎn)化為熱能來殺死癌細(xì)胞的治療方法[1]。近紅外光擁有穿透組織深度深、衰減弱和對(duì)組織損傷小等優(yōu)點(diǎn)[2]。此外,近紅外光還能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤區(qū)域照射,達(dá)到最大限度地減少副作用的效果[3]。金、銀、鉑、鈀等貴金屬材料是目前近紅外治療研究最多的材料之一。其中金納米粒子(gold nanoparticles,Au NPs)因其生物條件下穩(wěn)定性好,使其成為研究最多的光熱傳導(dǎo)材料[4],也是有前途的腫瘤光熱治療劑[5]。其光熱治療效果與尺寸有關(guān),只有尺寸大于50 nm的金納米粒子才有強(qiáng)烈的近紅外吸收。但與大顆粒相比,小尺寸金納米粒子在血液中停留時(shí)間更長,更容易進(jìn)入腫瘤組織。為了解決上述矛盾,目前已開發(fā)許多將金納米粒子組裝成新型功能材料技術(shù)[6],例如通過腫瘤局部微環(huán)境刺激響應(yīng)(氧化還原響應(yīng)[7]、pH響應(yīng)[8]或特異性酶[9])誘導(dǎo)該粒子聚集引起越來越多的研發(fā)興趣。

與正常組織相比較,腫瘤部位呈酸性微環(huán)境。本文合成了pH響應(yīng)性原酸酯親水鏈,并將其修飾到金納米粒子表面,制備新型酸性響應(yīng)聚集型金納米粒子材料。在中性環(huán)境下金納米粒子穩(wěn)定分散,而在酸性環(huán)境下,原酸酯鍵斷裂、親水鏈解離、疏水基團(tuán)暴露,引起金納米粒子的聚集,并呈更大尺寸團(tuán)簇,以提升金納米對(duì)近紅外的吸收能力。對(duì)比研究了這種酸敏感修飾和傳統(tǒng)無響應(yīng)性修飾的金納米粒子的光熱效率。本文方法可以拓展到其他腫瘤光熱治療納米材料上,為提高腫瘤光熱治療效果提供新策略。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

原甲酸三甲酯、3-氨基-1,2-丙二醇、三氟乙酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸一水合物、聚乙二醇單甲醚、氯金酸、溴代異丁酰溴均購自阿拉丁生化科技股份有限公司;碳酸氫鈉、氯化鈉、硼氫化鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

化學(xué)結(jié)構(gòu)采用安捷倫VNMR S600型核磁共振氫譜儀(proton nuclear magnetic resonance,1H NMR)進(jìn)行測試;樣品形貌結(jié)構(gòu)采用日本JEM-2100F型場發(fā)射透射電子顯微鏡(field emlssion transmission electron microscope,FETEM)分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 pH敏感原酸酯親水鏈的合成

pH敏感原酸酯親水鏈的合成是根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法稍加改動(dòng), 具體過程如圖1所示。

圖1 原酸酯親水鏈的合成過程示意圖

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下,向120 mL 3-氨基-1,2-丙二醇(18.80 g, 0.21 mol)的DCM溶液中滴加三氟乙酸乙酯(34.30 g, 0.24 mol),反應(yīng)4 h,蒸發(fā)溶劑,殘液溶解于200 mL乙酸乙酯中用飽和KHSO4和NaCl洗滌,經(jīng)MgSO4干燥獲得產(chǎn)物P1。

將P1 (13.50 g,72.15 mmol)與原甲酸三甲酯(34.89 g,0.33 mol)溶解于110 mL DCM后,加入微量對(duì)甲苯磺酸(p-TSA),室溫下反應(yīng)6 h,除去溶劑后溶于250 mL乙酸乙酯中,用飽和碳酸氫鈉和鹽水依次洗滌,用MgSO4干燥獲得產(chǎn)物P2。

將上述P2(3 g,13 mmol)溶于30 ml甲苯,加入PEG-OH (16.3 g, 3.2 mmoL),p-TSA (0.025 g, 0.13 mmol),吡啶(0.13 mL, 1.5 mmol), 110 ℃回流過夜,冷卻到室溫后與過量冷乙醚混合,過濾,真空干燥獲得產(chǎn)物P3。

將P3(6.0 g, 1.0 mmol)溶解于30 mL THF,在0 ℃下逐滴加入30 mL 4% NaOH水溶液,常溫下反應(yīng)過夜,蒸發(fā)除去THF后用DCM萃取,用K2CO3干燥后過濾、濃縮,得到產(chǎn)物P4。

將P4 (3 g,0.6 mmol)和三乙胺(200 mg,2 mmol)在溶于25 mL DCM中,0 ℃條件下逐滴加入溴乙酰溴(0.37 g,1.8 mmol)后反應(yīng)4 h,反應(yīng)產(chǎn)物過濾后用CHCl3萃取剩余有機(jī)溶液,并用無水K2CO3干燥后濃縮得到P5。

將P5(2.3 g,0.1 mmol)和硫代乙酸鉀(45.7 mg,0.4 mmol)溶于20 mL DMF,反應(yīng)24 h后過濾、濃縮、干燥得到P6。

將P6(2.3 g,0.1 mmol)溶于6 mL DMF為溶劑, 在避光條件下加入3 mL哌啶進(jìn)行切斷反應(yīng),反應(yīng)24 h后,過濾、濃縮、干燥得到末端為巰基的原酸酯親水鏈P7(POE-SH)。

1.2.2 POE-Au NPs和PEG-Au NPs的制備

用去離子水將2.5 mL HAuCl4溶液(2.2 mg/mL) 稀釋至50 mL,在強(qiáng)力磁攪拌下加熱至沸騰。隨后將2 mL 1%檸檬酸鈉溶液快速加入混合物中,繼續(xù)煮沸直到溶液變?yōu)榫萍t色獲得 Au NPs。將1 mL Au NPs與5 mL PEG-SH (1 mg/mL)或POE-SH (1 mg/mL)在 37 ℃以150 r/min攪拌速度下孵育8 h以上,獲得PEG-Au NPs或POE-Au NPs。合成過程如圖2所示。

圖2 POE-Au NPs的合成

1.2.3 光熱性能測試

取上述 1 mL POE-Au NPs和PEG-Au NPs溶液置于石英皿粒度池中,并將溶液pH值調(diào)整為5.5左右,靜置1 h后,用近紅外 808 nm 激光器,并以2 W/cm2的功率分別照射,用紅外熱成像儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測溶液的溫度,每隔 30 s 記錄1次相應(yīng)溫度。

1.2.4 細(xì)胞安全性測試

新型金納米材料的生物安全性采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法[11]評(píng)估。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVECs)以5×104個(gè)/孔接種于含有細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中,孵化24 h后,加入不同濃度的PEG-Au NPs和 POE-Au NPs后共培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌3次后在每個(gè)孔板中加入50 μL MTT(1 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除上清液后加入100 μLDMSO搖勻,用Elx800分光光度酶標(biāo)儀(BioTek,USA)測定570 nm處的吸光值,計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH敏感原酸酯親水鏈的1H NMR譜圖

本文設(shè)計(jì)合成的新型pH敏感原酸酯親水鏈合成過程中系列產(chǎn)物的1H NMR譜圖如圖3所示。

圖3 新型原酸酯親水鏈合成系列產(chǎn)物的1HNMR譜圖

P1的1H NMR譜圖如圖3a所示,由圖3a可知:δ=9.24×10-6為仲胺的質(zhì)子峰;δ=4.87×10-6、4.62×10-6為2個(gè)羥基質(zhì)子峰;δ=3.62×10-6為次甲基吸收峰;δ在3.04×10-6～3.34×10-6間為2個(gè)亞甲基吸收峰。

P2的1H NMR譜圖如圖3b所示,由圖3b可知:δ在5.60×10-6～5.64×10-6間為五元環(huán)上原酸酯特征吸收峰;δ在4.29×10-6～4.36×10-6間為五元環(huán)上次甲基吸收峰;δ在3.59×10-6～4.04×10-6間為五元環(huán)外亞甲基吸收峰;δ在3.36×10-6～3.54×10-6間為五元環(huán)上亞甲基吸收峰;δ在3.16×10-6～3.24×10-6間為甲基吸收峰。

P3的1H NMR譜圖如圖3c所示,由圖3c可知:δ=8.16×10-6為仲胺質(zhì)子峰,δ在5.84×10-6～5.92×10-6間為五元環(huán)上原酸酯特征峰,表明五元環(huán)未被破壞;δ在3.52×10-6～3.78×10-6間為五元環(huán)外OCH2CH2O—質(zhì)子峰,表明成功接上PEG鏈段。

P4的1H NMR譜圖如圖3d所示,由圖3d可知:δ在5.84×10-6～5.87×10-6間為五元環(huán)上原酸酯特征峰;δ在3.49×10-6～3.69×10-6間為五元環(huán)外OCH2CH2O—的質(zhì)子峰。

P5的1HNMR譜圖如圖3e所示,由圖3e可知,δ=4.15×10-6為溴乙酰溴亞甲基峰,δ在5.89×10-6～5.97×10-6間為原酸酯特征峰。P6的1H NMR譜圖如圖3f所示,由圖3f可知,δ=5.82×10-6原酸酯的特征峰仍然存在,δ=2.3×10-6為羰基處的甲基峰。P7的1HNMR譜圖如圖3g所示,由圖3g可知,δ=5.82×10-6原酸酯特征峰保留,δ=2.3×10-6處的甲基峰消失,證明目標(biāo)原酸酯親水鏈的成功制備。

2.2 金納米的形貌與pH響應(yīng)性

用TEM觀察PEG-Au NPs和 POE-Au NPs 2種金納米粒子在不同pH值下的形貌和尺寸,如圖4所示。

圖4 不同pH值條件下PEG-Au和 POE-Au 的TEM照片

由圖4可知, pH=7.4時(shí)PEG-Au NPs和POE-Au NPs金納米粒子呈單分散的球形,尺寸在5 nm左右;而置于模擬腫瘤酸性(pH=5.5)微環(huán)境下1 h后,觀察到PEG-Au NPs形態(tài)未發(fā)生改變(圖4c),POE-Au NPs聚集成幾百納米的團(tuán)簇,其原理如圖5所示。在酸性條件下,金納米表面修飾鏈從原酸酯鍵處斷裂、親水鏈段被切斷,使得疏水性基團(tuán)暴露出來,金納米體從而聚集成更大尺寸的金納米團(tuán)簇。

圖5 POE-Au NPs酸響應(yīng)聚集示意圖

2.3 酸性下金納米粒子的光熱效應(yīng)

將PEG-Au NPs和 POE-Au NPs 2種金納米水溶液(200 μg/mL)調(diào)節(jié)pH=5.5,1 h后用808 nm激光照射(輻照劑量2 W/cm2),并記錄照射時(shí)間與光熱轉(zhuǎn)化后的溶液升溫和降溫結(jié)果,如圖6所示。從圖6可以看出,在相同質(zhì)量濃度、相同激光功率下,隨著照射時(shí)間延長PEG-Au NPs和 POE-Au NPs均發(fā)生升溫現(xiàn)象,在照射15 min后PEG-Au NPs水溶液溫度升到峰值50.5 ℃,而POE-Au NPs水溶液溫度能達(dá)58.7 ℃,根據(jù)公式[11]計(jì)算出光熱轉(zhuǎn)換效率從47.6% 提高到了58.8%。從而證實(shí)經(jīng)原酸酯親水鏈修飾后的金納米粒子因酸響應(yīng)性聚集對(duì)近紅外區(qū)的吸收能力更強(qiáng),表現(xiàn)出更加優(yōu)異的光熱性能。

圖6 POE-Au NPs與PEG-Au NPs水溶液的升降溫曲線

2.4 生物安全性分析

本文進(jìn)一步用MTT法評(píng)估了新型酸響應(yīng)性金納米材料的細(xì)胞安全性。將不同質(zhì)量濃度(0、50、100、150、200 μg/mL)的PEG-Au NPs和 POE-Au NPs 2種金納米粒子與HUVECs細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞活性如圖7所示。

圖7 PEG-Au NPs和 POE-Au NPs的細(xì)胞毒性

由圖7可知,當(dāng)金納米粒子的質(zhì)量濃度高達(dá)200 μg/mL時(shí),PEG-Au NPs和 POE-Au NPs 2種金納米粒子的相對(duì)細(xì)胞活性仍然高于92%,表明2種金納米粒子均具有很高的細(xì)胞安全性。

3 結(jié) 論

本文合成了一種表面修飾了含酸敏感原酸酯基親水鏈的金納米粒子POE-Au NPs。TEM顯示,POE-Au NPs在pH=5.5條件下會(huì)因表面原酸酯鍵斷裂、親水鏈的解離、疏水基團(tuán)暴露而從5 nm單分散體聚集成幾百納米的團(tuán)簇。光熱效果測試表明,酸響應(yīng)聚集后的POE-Au NPs顯示出比單分散性PEG-Au NPs更高的光熱轉(zhuǎn)換效率,此外細(xì)胞安全性評(píng)估結(jié)果證實(shí)POE-Au NPs具有良好的生物安全性。這種新型酸響應(yīng)聚集性金納米粒子的設(shè)計(jì)制備為開發(fā)高效抗腫瘤光熱治療材料提供了新策略。