富血小板纖維蛋白對(duì)大鼠骺板軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響

賈賽雄 利春葉 洪意俠 翁啟文 吳迪 龍海泉 陳金仁

骺板是兒童骨折的好發(fā)部位，涉及骺板的骨折存在骨橋形成的風(fēng)險(xiǎn)。為避免骨橋復(fù)發(fā)，骨橋切除后留下的空腔目前多采用脂肪、骨水泥等填塞，臨床效果不一[1]。組織工程骺板在治療骺板損傷方面雖然取得了一定的實(shí)驗(yàn)效果，但仍存在著諸多問(wèn)題，比如，支架材料的選擇仍難以滿足多方面要求，外源性的細(xì)胞因子價(jià)格昂貴限制了其實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。對(duì)此，富血小板纖維蛋白 ( platelet-rich fibrin，PRF ) 是否能滿足組織工程骺板的要求呢？PRF 具有三維結(jié)構(gòu)，它既可以作為支架材料又可以產(chǎn)生細(xì)胞因子。為此，筆者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，在 PRF 的作用下體外培養(yǎng)骺板軟骨細(xì)胞，探討了 PRF 在骺板軟骨細(xì)胞增殖、分化以及生物學(xué)行為等方面的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

icell 原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基 ( 賽百慷公司 )，二甲基砜 ( dimethyl sulfoxide，DMSO ) ( Sigma 公司 )，CCK-8 試劑 ( cell counting kit-8，CCK-8 ) ( 日本同仁 )，COL Ⅱ antibody ( Proteintech 公司 )，細(xì)胞糖胺聚糖 ( glycosaminoglycan，GAG ) 總含量二甲基亞甲基藍(lán)比色法定量檢測(cè)試劑盒 ( Genmed 公司 )，多聚甲醛 ( platelet-rich fibrin，PFA ) ( Solarbio 公司 )，胎牛血清 ( fetal bovine serum，F(xiàn)BS )、Pen Strep、胰酶 ( Gibco 公司 )，Ⅱ 型膠原酶、24 孔板專用細(xì)胞爬片、Triton X-100、山羊血清、DAPI 試劑( 4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI ) ( Solarbio 公司 )，F(xiàn)luoromount-G 熒光封片劑 ( SourthernBiotech 公司 )，低速臺(tái)式離心機(jī) ( L550，湘儀公司 )，二氧化碳培養(yǎng)箱 ( Heal Force HF151，上海力申公司 )，熒光倒置顯微鏡 ( Mshot MF53，明美公司 )，酶標(biāo)儀 ( MR-96A，Mindray 公司 )。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 骺板軟骨取材及細(xì)胞培養(yǎng)：頸椎脫臼法將大鼠 ( 2 周齡 SD 大鼠 4 只，深圳拓普生物提供 ) 處死，超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下去除四肢皮膚、肌肉、骨膜，從股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端分離骺板軟骨，將骺板軟骨組織剪碎，用磷酸鹽緩沖鹽水 ( phosphate buffered saline，PBS ) 清洗若干次，用 0.1% Ⅱ 型膠原酶與 0.25% trypsin 37 ℃ 水浴震蕩消化 1.5 h。用培養(yǎng)基 ( DMEM / F12 + 10% FBS + 1% P / S ) ( DMEM：dulbecco’s modified eagle medium ) 中和，1000 r / min離心 3 min，收集組織，加入 0.1%、4 ℃ 的 Ⅱ 型膠原酶，置于 37 ℃、5% CO2、飽和濕度 95% 的培養(yǎng)箱中過(guò)夜消化，期間每小時(shí)震蕩離心管 1 min。

取出過(guò)夜消化的組織，吹打若干次，過(guò) 100 μm篩網(wǎng)，收集濾液、離心、重懸沉淀。將細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中，加入 DMEM / F12 + 10% FBS + 1% P / S，置于37 ℃、5% CO2、95% 濕度的培養(yǎng)箱，24 h 后換液。當(dāng)生長(zhǎng)面積達(dá)培養(yǎng)皿的 80%～90% 時(shí)進(jìn)行傳代。

2. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：在倒置相差顯微鏡下觀察各代細(xì)胞的形態(tài)及貼壁情況，記錄軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化。

3. 骺板軟骨細(xì)胞熒光鑒定：原代細(xì)胞爬片后將蓋玻片取出，4% PFA 于 4 ℃ 固定 30 min，PBS 漂洗，破膜封閉液 ( 0.5% Trition X-100 與 PBS 1∶1混合，再加 10% 血清配成 ) 封閉 2 h。加入 Ⅱ 型膠原抗體 ( 與 PBS 1∶100 )，4 ℃ 濕盒孵育過(guò)夜。PBS 漂洗，加入四甲基異硫氰酸羅丹明 ( tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC ) 標(biāo)記的熒光二抗( 1∶50 )，室溫避光孵育 1 h。PBS 漂洗，滴加 DAPI染色液，避光孵育 20 min，滴加 Fluoromount-G 封片，熒光顯微鏡下觀察，采集圖像。

4. PRF 的制備：將 8 周齡的 SD 雄鼠 ( 1 只，深圳拓普生物提供 ) 麻醉，75% 酒精消毒，在超凈臺(tái)中剪開(kāi)腹腔，從腹主動(dòng)脈取血 10 ml 迅速放入離心管中，采用無(wú)菌且不添加任何抗凝或促凝劑的離心管放入離心機(jī)中，2000 rpm 離心 10 min，離心后的血液分為三層，中間層呈淡黃色凝膠狀即 PRF，取出后減去尾端帶紅細(xì)胞成分置于無(wú)菌試管中，稱重后加入 PBS，-80 ℃ 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

5. 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組在培養(yǎng)基中不加 PRF，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)基底部加入 PRF 膜。

6. CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖：取第三代細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約 90% 時(shí)棄培養(yǎng)基，加入 1 ml 0.25% 胰酶消化至細(xì)胞變圓剛要脫落時(shí)用完全培養(yǎng)基終止消化，消化計(jì)數(shù)。以每孔 1800 個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板中，用 PBS 洗滌后，添加含有 10% FBS 的DMEM ( 每孔 200 μl )。每組平行設(shè) 6 次重復(fù) ( 即 6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)鋪一塊板 )，每組每次 6 個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ( 37 ℃，5% CO2)。

細(xì)胞貼壁后記為 0 h，實(shí)驗(yàn)組更換為含 PRF 的培養(yǎng)基，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組分別于細(xì)胞貼壁后 0 h、24 h、41 h、48 h、65 h 和 72 h 進(jìn)行 CCK-8 檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)取出 96 孔板，向培養(yǎng)孔分別加入 10 μl CCK-8 溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育 1.5 h，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 ( enzymelinked immunosorbent assay，ELISA ) 讀取器測(cè)量 450 nm處的吸光度，以此計(jì)算相對(duì)增殖率。

7. 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：取第三代細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約 90% 時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入1 ml 0.25% 胰酶消化至細(xì)胞變圓剛要脫落時(shí)用完全培養(yǎng)基終止消化，消化計(jì)數(shù)。先用 marker 筆在 6 孔板背后，用直尺均勻劃?rùn)M線，每隔 0.5 cm 一道，橫穿過(guò)孔。每孔穿過(guò) 3 條線。以每孔 50 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞接種到 6 孔板中，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜( 37 ℃，5% CO2)。第 2 天，用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，保證每孔最終統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)至少 3 個(gè)缺口。

用 PBS 洗滌 3 次，去除劃下的細(xì)胞，對(duì)照組加入無(wú)血清的 DMEM / F12 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含PRF 的 DMEM / F12 培養(yǎng)基，放入 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。加入培養(yǎng)基時(shí)計(jì)為 0 h，于 0 h、24 h、48 h 拍照。用 Image J 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并進(jìn)行傷口閉合度評(píng)估。傷口閉合度 = [ 間隙面積 ( 0 h ) - 間隙面積 ( Xh ) ] /間隙面積 ( 0 h )。

8. 硫酸 GAG 含量檢測(cè)：以每孔 10 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞鋪6 孔板 4 個(gè)孔 ( 每組 2 個(gè)孔 )，細(xì)胞過(guò)夜貼壁后實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基加入 PRF，處理時(shí)間為 24 h 和 48 h。按照細(xì)胞 GAG 總含量二甲基亞甲基藍(lán)比色法定量檢測(cè)試劑盒的方法對(duì)待測(cè)樣品作預(yù)處理，并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱坐標(biāo) ( Y 軸 ) 為吸光度值，橫坐標(biāo) ( X 軸 ) 為標(biāo)準(zhǔn) GAG 含量。移取 50 μl 上述預(yù)處理的待測(cè)樣品到 1.5 ml 離心管。按試劑盒方法獲得樣本吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品消化液中硫酸 GAG 的含量 ( μg / ml )。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS 19.0 軟件包對(duì) CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)、硫酸 GAG 含量檢測(cè)結(jié)果采用雙因素方差分析 ( two-way ANOVA ) 進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)均用±s表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞鏡下呈球狀，繼續(xù)培養(yǎng)后可部分貼壁( 3～4 h )，1 天后大部分軟骨細(xì)胞為梭形及多角形，細(xì)胞邊緣輪廓清晰，具有折光性，當(dāng) 80%～90% 的骺板軟骨細(xì)胞貼壁后即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。隨著細(xì)胞傳代，細(xì)胞增殖速度顯著，變形明顯，梭形為主，邊緣模糊，折光性變?nèi)酢?/p>

二、細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果

免疫熒光檢測(cè)原代骺板軟骨細(xì)胞中的 COL Ⅱ 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度高，經(jīng)免疫熒光鑒定，該細(xì)胞純度達(dá) 90% 以上 ( 圖1 )。

圖1 a、b：直接免疫熒光鑒定 ( × 100 )；c、d：直接免疫熒光鑒定 ( × 200 )Fig.1 a - b: Direct immunofluorescence identification ( × 100 ); c - d: Direct immunofluorescence identification ( × 200 )

三、CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 PRF 作用 24 h 時(shí)，兩組相對(duì)增殖率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05 )，實(shí)驗(yàn)組增殖速度較慢；兩組細(xì)胞在 41 h 時(shí)相對(duì)增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05 )，但實(shí)驗(yàn)組 41 h 與24 h 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05 )，說(shuō)明 41 h比 24 h 的增殖速度有明顯提高；實(shí)驗(yàn)組 48 h，與本組 41 h 及對(duì)照組 48 h 的相對(duì)增殖率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05 )，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組 48 h 增殖速度顯著升高；實(shí)驗(yàn)組 65 h 與 72 h 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05 )，但與本組 48 h 及對(duì)照組 65 h 及 72 h比較，增殖速度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 ) ( 表1 )。

表1 CCK-8 實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞相對(duì)增殖率比較 ( % )Tab.1 Comparison of the relative cell proliferation rates between the control group and experimental group at different time points in CCK-8 experiment ( % )

四、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組 24 h 和 48 h 傷口閉合度的兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05 )，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組在 48 h 內(nèi)隨著 PRF 的持續(xù)作用時(shí)間增加，細(xì)胞遷移速度提高，且較對(duì)照組顯著升高 ( 表2 )。

表2 劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)傷口閉合度比較 ( % )Tab.2 Comparison of wound closure at different time points between the control group and experimental group by scratch test ( % )

五、硫酸 GAG 含量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組 PRF 作用 24 h 時(shí)，與對(duì)照組相比，兩組之間的 GAG 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05 )；PRF 作用 48 h，實(shí)驗(yàn)組的 GAG 含量顯著升高，與本組 24 h、對(duì)照組 24 h 和 48 h GAG 含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05 ) ( 表3 )。

表3 硫酸 GAG 含量檢測(cè)比較 ( μg / ml )Tab.3 Comparison of GAG content in sulfuric acid ( μg / ml )

討 論

骺板是兒童骨折的好發(fā)部位，涉及骺板的骨折存在生長(zhǎng)停滯和成角畸形的風(fēng)險(xiǎn)。骺板損傷后期如果出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯、骨橋形成、成角畸形，則需要手術(shù)解決生長(zhǎng)停滯及成角畸形的問(wèn)題。為避免骨橋復(fù)發(fā)，骨橋切除后留下的空腔該如何處理，國(guó)內(nèi)外對(duì)填充物材料的選擇包括組織工程骺板進(jìn)行了較多研究，效果都不盡如人意。PRF 作為一種天然生物材料引起了廣泛的關(guān)注，它可以提供生長(zhǎng)因子 ( growth factor，GF )、細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞及干細(xì)胞樣細(xì)胞，用于免疫調(diào)節(jié)和組織愈合[2]。

PRF 所含的白細(xì)胞不僅在免疫和抗炎中起關(guān)鍵作用，而且在傷口愈合過(guò)程中也起關(guān)鍵作用[3-4]。與一代血小板濃縮物富血小板血漿 ( platelet-richplasma，PRP ) 相比，PRF 為固態(tài)，PRP 為液態(tài)，PRF 制備簡(jiǎn)單、離心過(guò)程無(wú)需添加其它試劑，很好地避免了過(guò)敏反應(yīng)、免疫排斥、交叉感染等。PRF 的 GF 持續(xù)釋放速率較 PRP 慢，至少持續(xù)釋放 7 天，長(zhǎng)者能達(dá)到28 天左右[5]。PRF 均勻的三維網(wǎng)格組織通過(guò)緩慢釋放細(xì)胞因子，而對(duì)組織愈合產(chǎn)生長(zhǎng)期影響[6]。Kang 等[7]發(fā)現(xiàn) PRF 的蜂窩結(jié)構(gòu)包含許多小空間，可以容納移植細(xì)胞，作為細(xì)胞增殖和分化的支架[8]。外源性的細(xì)胞因子價(jià)格昂貴，PRF 來(lái)自于自體，成本低，其血小板濃度高于血液基本水平，在血小板 α 顆粒儲(chǔ)存和釋放的生物活性分子中，包含以下最常用于組織再生的 GF：血小板源性生長(zhǎng)因子 ( platelet-derived growth factor，PDGF )，胰島素樣生長(zhǎng)因子 ( insulin-like growth factor 1，IGF-1 )，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1 ( transforming growth factor-β1，TGF-β1 )，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( vascular endothelial growth factor，VEGF )，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ( basic fibroblast growth factor，BFGF )和表皮生長(zhǎng)因子 ( epidermal growth factor，EGF )[9]。除了富集血小板和白細(xì)胞外，還發(fā)現(xiàn)在纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)內(nèi)具有高再生潛力的干細(xì)胞樣細(xì)胞[10-11]。國(guó)外有研究還證實(shí)了血小板來(lái)源的 GF 可以刺激軟骨細(xì)胞的體外增殖和分化[12-14]，亦可促進(jìn)軟骨的體內(nèi)愈合[15-17]。

本研究采用 CCK-8 檢測(cè) PRF 作用下骺板軟骨細(xì)胞的增殖情況，由結(jié)果可知，24 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖速度比對(duì)照組較慢 (P＜ 0.05 )，實(shí)驗(yàn)組 24 h 之后增殖速度開(kāi)始加快，兩組細(xì)胞在 41 h 的增殖速度達(dá)到一致水平 (P＞ 0.05 )，在 48 h 實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組增殖速度顯著變快，之后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度更快，在 65 h 達(dá)到增殖頂峰，實(shí)驗(yàn)組 72 h 與 65 h 增殖速度無(wú)顯著差異 (P＞ 0.05 )。結(jié)果表明，PRF 可促進(jìn)骺板軟骨細(xì)胞的增殖，該結(jié)果與先前文獻(xiàn)一致[13]。

劃痕實(shí)驗(yàn)是研究細(xì)胞遷移的首選方法，它的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)成本低且簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件可控。劃痕實(shí)驗(yàn)涉及在多孔試驗(yàn)板中培養(yǎng)單層細(xì)胞以使其融合。在單層中創(chuàng)建一個(gè)“傷口”( 無(wú)細(xì)胞區(qū)域 )，細(xì)胞可以遷移到其中，并可以監(jiān)測(cè)劃痕區(qū)域的重新定殖以量化細(xì)胞遷移。本研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) PRF 對(duì)于骺板軟骨細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組在 48 h 內(nèi)隨著 PRF 的持續(xù)作用時(shí)間增加，細(xì)胞遷移速度提高，且較對(duì)照組顯著升高。說(shuō)明 PRF 可以明顯促進(jìn)骺板軟骨細(xì)胞的遷移。

GAG 是由重復(fù)雙糖組成的線狀多糖，根據(jù)其雙糖單位可分為硫酸軟骨素 ( chondroitin sulfate，CS )、硫酸皮膚素 ( dermatan sulfate，DS )、硫酸肝素 ( heparin sulfate，HS ) 和肝素。這種結(jié)構(gòu)多樣性在骨骼組織的發(fā)育、生長(zhǎng)和穩(wěn)態(tài)等一系列生物學(xué)功能中起著重要作用，是評(píng)價(jià)軟骨功能的重要指標(biāo)[18]。本研究采用二甲基亞甲藍(lán)比色法對(duì) GAG 進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果說(shuō)明在24 h 內(nèi) PRF 并沒(méi)有對(duì) GAG 的產(chǎn)生起到明顯作用，但在之后明顯促進(jìn)了 GAG 的產(chǎn)生，在 PRF 的作用下 48 h 時(shí)實(shí)驗(yàn)組的 GAG 含量明顯增多。

由以上結(jié)果可見(jiàn)，細(xì)胞 24 h 的增殖與遷移趨勢(shì)結(jié)果不太一致，在增殖實(shí)驗(yàn)中，24 h 對(duì)照組的增殖速度快，實(shí)驗(yàn)組 24 h 增殖速度反而沒(méi)有那么快；而在遷移實(shí)驗(yàn)中，24 h 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移速度更快。可能原因：一是實(shí)驗(yàn)組 24 h PRF 暫時(shí)只影響到了細(xì)胞遷移，對(duì)增殖影響不明顯，細(xì)胞增殖快并不代表遷移也快；二是遷移實(shí)驗(yàn)用的血清濃度和增殖實(shí)驗(yàn)的血清濃度不一樣，高血清濃度使得對(duì)照組的細(xì)胞增殖速度加快。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，PRF 不僅可以促進(jìn)骺板軟骨細(xì)胞增殖分化，還可以促進(jìn) GAG 的產(chǎn)生。但本研究也存在其缺陷，CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)由于實(shí)驗(yàn)組 65 h與 72 h 細(xì)胞增殖速度無(wú)顯著差異，那么 72 h 后細(xì)胞增殖速度是怎樣變化的呢？劃痕實(shí)驗(yàn)及 GAG 測(cè)定的時(shí)間太短，僅有 48 h，在 48 h 后 PRF 起到的作用如何也尚不確定。故仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，自體 PRF 具有良好的生物降解性和相容性，富含高濃度的血小板、多種 GF、纖維蛋白原和免疫細(xì)胞，在組織工程中既含有細(xì)胞因子，又可作為生物支架材料。本研究旨在 PRF 作用下對(duì)大鼠骺板軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，為進(jìn)一步探討構(gòu)建組織工程骺板軟骨做準(zhǔn)備，為骺板損傷治療提供新的思路。