阿奇霉素急性暴露對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的毒性效應(yīng)

蒲 倩,張尚祎,陳 晨,劉興成,王慧利,錢(qián)秋慧(蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215009)

阿奇霉素(AZM)屬于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素,由于AZM 的大規(guī)模生產(chǎn)和使用,導(dǎo)致其通過(guò)各種途徑排放到水環(huán)境中并持續(xù)積累.全球各國(guó)的市政污水、地表水以及地下水等介質(zhì)中都檢測(cè)到了AZM的存在[1-3].

抗生素的過(guò)量使用和不適當(dāng)?shù)呐欧欧绞娇赡軐?dǎo)致其在水環(huán)境中富集,并誘發(fā)生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)[4].抗生素進(jìn)入人體后也會(huì)對(duì)健康造成不良影響.流行病學(xué)研究表明,長(zhǎng)期接觸抗生素與兒童患特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏、哮喘、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)發(fā)育障礙的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[5].一些研究已證實(shí),抗生素對(duì)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生的影響包括氧化應(yīng)激、脂質(zhì)和葡萄糖代謝紊亂、免疫抑制以及遺傳毒性[6-9].現(xiàn)有研究表明,在小鼠中,通過(guò)喂食AZM 能降低短鏈脂肪酸和膽汁酸的含量,最終導(dǎo)致脂肪合成增加[10];斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露于梯度濃度AZM 后,會(huì)出現(xiàn)肝損傷、肝臟區(qū)域大小改變、肝組織透明度下降和肝組織脂質(zhì)堆積等病變[11],此外,AZM 的暴露還可以引起斑馬魚(yú)幼魚(yú)明顯的心臟毒性[12].關(guān)于AZM 毒理學(xué)效應(yīng)的研究較少且不夠全面.因此,本文選用斑馬魚(yú)作為模式生物,旨在全面評(píng)估AZM 急性暴露對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的潛在毒性影響.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

野生型斑馬魚(yú)(AB 系)購(gòu)自中國(guó)武漢斑馬魚(yú)研究中心,經(jīng)3 周馴化后進(jìn)行育種.將所有成年斑馬魚(yú)雌雄分開(kāi)置于斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)中,飼養(yǎng)條件為:28°C,pH(7.2±0.2).光照周期為14h/10h(光/暗),每天喂食兩次豐年蝦.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

主要試劑:阿奇霉素二水合物(CAS:83905-01-5,99.9%)購(gòu)于上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;丙酮(CAS No.67-64-1,99.9%)和無(wú)水乙醇均購(gòu)于上海聯(lián)試化工試劑有限公司;PBS 粉末和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司.

主要儀器:斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)(上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);斑馬魚(yú)行為分析儀器(Danion Vision,荷蘭 Noldus);立體熒光顯微鏡(Nikon, Tokyo,Japan);Thermo 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)及胚胎收集 斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)操作,依照先前研究所述[13].斑馬魚(yú)生長(zhǎng)3 個(gè)月齡即可性成熟,從養(yǎng)殖槽中選取成年斑馬魚(yú)4～6 對(duì),提前一天晚上將雌雄斑馬魚(yú)按照1:1 的比例置于產(chǎn)卵器中,利用插板隔開(kāi)放置一晚.第二天早上開(kāi)燈將透明插板取下,刺激斑馬魚(yú)產(chǎn)卵.挑選優(yōu)質(zhì)胚胎,6h 后分別暴露于控制組、AZM 濃度梯度組(4mg/L、8mg/L 和16mg/L).每隔24h 更換1 次暴露藥液,以確保維持所需的暴露濃度,并持續(xù)暴露胚胎直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束.

1.3.2 阿奇霉素急性暴露下斑馬魚(yú)的表觀形態(tài)學(xué)改變觀察 在亞致死濃度0,4,8 和16mg/L 下對(duì)24,48,72,96hpf 的胚胎和幼魚(yú)分別進(jìn)行觀察并拍照記錄,同時(shí)對(duì)第72hpf 斑馬魚(yú)脊索進(jìn)行觀察并拍照.

1.3.3 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的發(fā)育觀察 分別利用Tg(elavl3:EGFP)和Tg(kdrl:mCherry)轉(zhuǎn)基因品系評(píng)價(jià)AZM 對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)發(fā)育和血管發(fā)育的影響;利用Tg(rag2:DsRed)轉(zhuǎn)基因品系評(píng)價(jià)AZM 對(duì)胸腺T 細(xì)胞分化形成的影響,使用立體熒光顯微鏡(Nikon,Tokyo, Japan)對(duì)96hpf 幼魚(yú)腦部神經(jīng)元、6dpf 幼魚(yú)血管和120hpf 幼魚(yú)胸腺進(jìn)行成像.

1.3.4 阿奇霉素急性暴露下斑馬魚(yú)幼魚(yú)行為學(xué)分析 將暴露在AZM 梯度濃度下的斑馬魚(yú)胚胎從6hpf 培養(yǎng)至120hpf,轉(zhuǎn)移到96 孔板并放入Noldus行為分析儀中進(jìn)行觀察分析,系統(tǒng)所有設(shè)置依照我們先前的研究所述[14],設(shè)置完成后即對(duì)斑馬魚(yú)的行為進(jìn)行分析.

1.3.5 斑馬魚(yú)乙酰膽堿酯酶(AChE)的測(cè)定與分析從控制組和AZM 暴露組中分別取70 條幼魚(yú)(5dpf)于1.5mL 的EP 管內(nèi),使用去酶PBS 清洗2 次,吸凈溶液并放置電子天平秤量,根據(jù)重量(g):體積(mL)=1:9 的比例,再次加入去酶PBS 進(jìn)行超聲勻漿,在2500r/min 下低溫離心10min.蛋白濃度和AChE 酶活性測(cè)定均根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行.

1.3.6 阿奇霉素靶基因的預(yù)測(cè)及富集分析(1)使用Chemdraw20.0 軟件繪制AZM 的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖,轉(zhuǎn)成mol2 文件格式后輸入至PharmMapper 網(wǎng)站(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)進(jìn)行分析預(yù)測(cè),得到AZM 可能作用的靶基因.

(2)將從PharmMapper中獲得的284個(gè)蛋白輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org)中,獲得對(duì)應(yīng)斑馬魚(yú)目標(biāo)基因.

(3)將篩選得到的目標(biāo)基因?qū)胛⑸旁诰€(xiàn)分析網(wǎng)(https://www.bioinformatics.com.cn),根據(jù)基因標(biāo)識(shí)以分子生物學(xué)功能(MF)、生物學(xué)過(guò)程(BP)和細(xì)胞學(xué)組分(CC)進(jìn)行 GO 功能分類(lèi)和KEGG 富集分析.

1.3.7 斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞染色 將暴露完成后的斑馬魚(yú)幼魚(yú)(4dpf)以30 條/孔置于6 孔板內(nèi),加入循環(huán)水配制的中性紅工作液(2.5μg/mL),28℃避光孵育7h.棄去染液,使用PBS 清洗3 次,加入MS-222 麻醉后在體視顯微鏡下觀察.

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 本文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD;n=3)的形式表示,采用SPSS19.0 軟件(IBM,USA)進(jìn)行單因素方差分析,并在顯著性水平P<0.05、P<0.01 或P<0.001 下進(jìn)行了統(tǒng)計(jì).

2 結(jié)果與分析

2.1 阿奇霉素急性暴露誘導(dǎo)斑馬魚(yú)表觀形態(tài)改變

從圖1 可以看出,高濃度(16mg/L)暴露組的斑馬魚(yú)在72h 出現(xiàn)了明顯的畸形.隨著暴露時(shí)間的增加,暴露于AZM 的斑馬魚(yú)出現(xiàn)了脊椎彎曲現(xiàn)象.與此同時(shí),斑馬魚(yú)出現(xiàn)游囊閉合、卵黃囊腫現(xiàn)象.隨著暴露濃度的增加,上述現(xiàn)象越明顯.這表明,在該劑量下,AZM 的急性暴露以濃度依賴(lài)的方式對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)早期發(fā)育產(chǎn)生了影響.

2.2 阿奇霉素急性暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)脊索發(fā)育異常

脊索是脊椎動(dòng)物的主要結(jié)構(gòu),斑馬魚(yú)的脊索在胚胎發(fā)育階段提供結(jié)構(gòu)支撐,使得幼魚(yú)能夠進(jìn)行自主運(yùn)動(dòng)[15].同時(shí),還具有保護(hù)脊髓和主要血管的作用.通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,經(jīng)過(guò)AZM 暴露后的斑馬魚(yú)脊索出現(xiàn)了彎曲現(xiàn)象,尤其是在16mg/L 濃度組中,脊索的彎曲最為顯著,并且經(jīng)過(guò)濃度梯度暴露的斑馬魚(yú)脊索液泡出現(xiàn)了紊亂和不規(guī)則的情況(圖2(a)).斑馬魚(yú)依靠脊索實(shí)現(xiàn)自由運(yùn)動(dòng),而脊索的異常發(fā)育往往與神經(jīng)密切相關(guān),基于此展開(kāi)以下研究.

圖2 阿奇霉素暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)幼魚(yú)脊索/神經(jīng)元損傷Fig.2 Exposure to azithromycin leads to notochord/neuronal damage in zebrafish larvae

2.3 阿奇霉素急性暴露抑制斑馬魚(yú)神經(jīng)元的發(fā)育

基于斑馬魚(yú)出現(xiàn)脊索彎曲的現(xiàn)象,為了進(jìn)一步探究AZM 是否對(duì)斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響,采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(elavl3:EGFP)品系觀察AZM暴露對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的潛在影響. Tg(elavl3:EGFP)是將發(fā)綠色熒光蛋白EGFP 被整合到elavl3 基因的啟動(dòng)子序列中,elavl3 基因是一種神經(jīng)元特異性RNA,在神經(jīng)元發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用[15].在斑馬魚(yú)幼魚(yú)的神經(jīng)元早期發(fā)育過(guò)程中,elavl3 基因發(fā)揮著重要作用.通過(guò)顯微鏡觀察,結(jié)果如圖2(b)、2(c)所示,AZM 暴露顯著降低了elavl3 的表達(dá)水平,腦部的神經(jīng)元明顯減少.同時(shí),觀察到高濃度組的熒光強(qiáng)度稍有減弱,神經(jīng)元軸突變短.上述結(jié)果表明AZM 引起斑馬魚(yú)神經(jīng)元發(fā)育異常,并可能影響斑馬魚(yú)對(duì)外界刺激的反應(yīng).

2.4 阿奇霉素急性暴露引發(fā)斑馬魚(yú)行為學(xué)改變

斑馬魚(yú)的早期神經(jīng)中樞系統(tǒng)容易受到環(huán)境干擾的影響,在明暗交替環(huán)境中,幼魚(yú)表現(xiàn)出特定的運(yùn)動(dòng)模式,運(yùn)動(dòng)行為的變化通?？梢宰鳛樯窠?jīng)毒性的終點(diǎn)指標(biāo)[16].與對(duì)照相比,AZM 暴露組(8,16mg/L)都表現(xiàn)出移動(dòng)距離變短(圖3(d))、移動(dòng)速度變慢(圖3(e))、光暗節(jié)律失衡(圖3(a)).軌跡圖和熱圖的分析結(jié)果也進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)(圖3(c)),處理組的軌跡雜亂且數(shù)量較少,熱圖顯示斑馬魚(yú)在某一區(qū)域的停留時(shí)間更長(zhǎng),尤其是在高濃度組(16mg/L)中.此外,在轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)中觀察到,8mg/L 和16mg/L 濃度組的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)角增大(圖3(b)),表明幼魚(yú)可能出現(xiàn)了焦慮、恐懼和不安的情緒.這些觀察結(jié)果表明,AZM 的急性暴露降低了斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活力和反應(yīng)敏感性,引發(fā)了斑馬魚(yú)的行為異常.

圖3 阿奇霉素暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)幼魚(yú)行為異常Fig.3 Exposure to azithromycin causes abnormal behaviors in larvae

2.5 阿奇霉素急性暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)AChE 活性降低

AChE 是膽堿能突觸中乙酰膽堿水解的關(guān)鍵酶,參與細(xì)胞發(fā)育和成熟,能促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育和再生,并被認(rèn)為是發(fā)育神經(jīng)毒性的生物標(biāo)志物[17-18].AChE 已被證明參與許多生物體的運(yùn)動(dòng)行為[19],當(dāng)AChE 活性受到抑制時(shí),乙酰膽堿會(huì)積累,最終導(dǎo)致生物體的運(yùn)動(dòng)行為異常.在本研究中,當(dāng)斑馬魚(yú)急性暴露于不同濃度的AZM 后,AChE 活性普遍呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖4).在4mg/L 濃度組中,AChE 雖有下降趨勢(shì),但其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并未達(dá)到顯著水平,在16mg/L濃度組中,對(duì)AChE活性的抑制作用更為顯著,結(jié)果顯示,AZM 對(duì)AChE 的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性特征.這些結(jié)果表明,AZM 的暴露對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)產(chǎn)生了明顯的神經(jīng)毒性效應(yīng),具體表現(xiàn)為影響其脊柱和神經(jīng)元的正常發(fā)育,改變其運(yùn)動(dòng)行為,以及對(duì)AChE 活性產(chǎn)生抑制作用.

圖4 阿奇霉素暴露導(dǎo)致AChE 活性變化Fig.4 Exposure to azithromycin leads to changes in AChE activity

2.6 AZM 暴露作用靶基因預(yù)測(cè)及功能富集分析

由圖5 可知,靶基因富集在多個(gè)通路上,包括一個(gè)葉酸碳庫(kù)、果糖和甘露糖代謝、核苷酸代謝、丙酮酸代謝、嘧啶代謝PPAR 信號(hào)通路、C 型凝集素信號(hào)通路、Fox O 信號(hào)通路、VEGF signaling pathway、碳代謝等代謝通路(圖5(a)).GO 富集分析包含生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)3 個(gè)部分,結(jié)果顯示靶基因涉及凝血、先天免疫反應(yīng)和含嘌呤化合物代謝過(guò)程等生物過(guò)程;與質(zhì)膜的外在成分、質(zhì)膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的外在成分、細(xì)胞外空間、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)和膜的外在成分細(xì)胞組分有關(guān);在分子功能方面,主要涉及到核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類(lèi)固醇激素受體活性、蛋白酪氨酸激酶活性等方面(圖5(b)).根據(jù)上述富集分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)AZM 可能通過(guò)調(diào)控VEGF 信號(hào)通路和凝血生物過(guò)程對(duì)斑馬魚(yú)血管產(chǎn)生影響.同時(shí),AZM 還通過(guò)C 型凝集素信號(hào)通路和先天免疫反應(yīng)生物過(guò)程對(duì)斑馬魚(yú)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用.

圖5 阿奇霉素作用靶基因的KEGG 富集分析和GO 功能分類(lèi)Fig.5 KEGG enrichment analysis and GO functional classification of target genes affected by azithromycin

2.7 阿奇霉素急性暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)血管發(fā)育畸形

基于生物信息學(xué)結(jié)果, AZM 可能具有影響斑馬魚(yú)血管發(fā)育的潛在作用.使用Tg(kdrl:mCherry)品系斑馬魚(yú)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),Tg(kdrl:mCherry)中的kdrl 基因在血管形成初期表達(dá)活躍,對(duì)維持正常血管功能和修復(fù)受損血管起重要作用.如圖6 所示.AZM 暴露組出現(xiàn)血管分支異常、血管排列分布雜亂并且熒光強(qiáng)度隨暴露濃度增加而減弱.這些結(jié)果表明,AZM 的急性暴露以濃度依賴(lài)的方式加劇了斑馬魚(yú)早期血管發(fā)育的畸形,與生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致.

圖6 阿奇霉素急性暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)血管發(fā)育畸形Fig.6 Acute exposure to azithromycin causes vascular developmental malformations in zebrafish

2.8 阿奇霉素急性暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)免疫系統(tǒng)紊亂

為驗(yàn)證AZM 急性暴露對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響,從先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)兩方面進(jìn)行驗(yàn)證.巨噬細(xì)胞屬于先天性免疫系統(tǒng),是斑馬魚(yú)幼魚(yú)發(fā)育時(shí)期的第一個(gè)免疫細(xì)胞,最早在受精后22h 發(fā)育,而適應(yīng)性免疫(T 細(xì)胞)主要在幼魚(yú)后期發(fā)育過(guò)程建立.通過(guò)對(duì)4dpf 斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行中性紅染色,使用顯微鏡觀察并拍攝頭部的巨噬細(xì)胞(圖7(a)).

圖7 阿奇霉素暴露誘導(dǎo)斑馬魚(yú)免疫系統(tǒng)紊亂Fig.7 Exposure to azithromycin induces immune system disorder in zebrafish

分析結(jié)果顯示,AZM 暴露組的斑馬魚(yú)頭部的巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組.進(jìn)一步定量分析顯示,4,8mg/L 暴露組的斑馬魚(yú)頭部巨噬細(xì)胞的數(shù)量分別為37 和45 個(gè)(圖7(c)),與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.001).而在高濃度(16mg/L)下,AZM暴露表現(xiàn)出促進(jìn)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞形成的趨勢(shì).與此同時(shí),使用轉(zhuǎn)基因Tg(rag2:DsRed)斑馬魚(yú)追蹤胸腺T細(xì)胞的發(fā)育情況,發(fā)現(xiàn)AZM 暴露下斑馬魚(yú)胸腺面積減少(圖7(b)、7(d)).隨著AZM 濃度的增加,幼魚(yú)胸腺發(fā)育的抑制效果越明顯,這也暗示AZM 可能對(duì)斑馬魚(yú)的適應(yīng)性免疫有抑制作用.綜上,在上述濃度暴露下,AZM 會(huì)激活斑馬魚(yú)幼魚(yú)的先天免疫反應(yīng),抑制其適應(yīng)性免疫,從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂.

3 討論

通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行AZM 的亞致死劑量急性暴露實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)AZM 暴露會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)生長(zhǎng)畸形、游囊發(fā)育不完整和脊椎畸形,且這種異?，F(xiàn)象隨著暴露濃度的增加而加劇.游囊是斑馬魚(yú)發(fā)育過(guò)程中的重要器官,通過(guò)充氣或放氣的方式維持斑馬魚(yú)在水中的平衡,其發(fā)育不全有可能對(duì)斑馬魚(yú)的攝食和運(yùn)動(dòng)行為造成不良影響[20].因此,推測(cè)AZM 可能具有神經(jīng)毒性效應(yīng). Coffin 等[21]研究發(fā)現(xiàn)AZM 暴露會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚(yú)側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞發(fā)育異常,同時(shí)在Mendon?a-Gomes 等[22]的研究中也觀察到AZM 暴露能夠改變AChE 的含量.

在脊椎動(dòng)物中作為生物體軸線(xiàn)的關(guān)鍵組成部分,具有支撐脊柱形成的作用.特別是在斑馬魚(yú)這一模式生物中,脊索細(xì)胞不僅為周?chē)M織提供關(guān)鍵的發(fā)育信號(hào),還引導(dǎo)著包括血管、神經(jīng)管在內(nèi)的多種組織的分化和發(fā)育[15].本研究發(fā)現(xiàn),在AZM急性暴露下,斑馬魚(yú)幼魚(yú)出現(xiàn)了一系列脊索相關(guān)的異常表現(xiàn),包括脊索彎曲,脊索液泡紊亂以及形態(tài)不規(guī)則等現(xiàn)象.這些異常狀況可能會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)和行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響.為了探究這一假設(shè),進(jìn)一步研究了AZM 暴露下elavl3 基因的表達(dá)情況,該基因在神經(jīng)元分化和維持中起到重要作用[23].通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型Tg(elavl3:EGFP),發(fā)現(xiàn)AZM 暴露確實(shí)導(dǎo)致了斑馬魚(yú)神經(jīng)元數(shù)量的顯著減少.在斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中,其行為模式逐漸受到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控,成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟的關(guān)鍵指標(biāo)[24].值得注意的是,斑馬魚(yú)在明暗交替的環(huán)境中會(huì)展示特定的運(yùn)動(dòng)模式,這一觀察進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了其運(yùn)動(dòng)行為在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的重要性[25].自主運(yùn)動(dòng)及光暗節(jié)律實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在AZM 暴露下,斑馬魚(yú)幼魚(yú)的移動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)速度顯著降低,同時(shí)還出現(xiàn)了光暗節(jié)律的失衡.這些異常行為表明斑馬魚(yú)在AZM 暴露后出現(xiàn)了類(lèi)似于焦慮和抑郁的心理狀態(tài). AChE 是評(píng)估神經(jīng)毒性的一個(gè)重要生物標(biāo)志物,主要通過(guò)降解乙酰膽堿(ACh)來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)[26].在本研究中,暴露于AZM 的斑馬魚(yú)幼魚(yú)表現(xiàn)出AChE 活性明顯降低的現(xiàn)象.綜上所述,AZM急性暴露不僅導(dǎo)致斑馬魚(yú)出現(xiàn)脊索損傷,還影響其神經(jīng)元的發(fā)育和AChE 的活性,從而對(duì)斑馬魚(yú)的行為表現(xiàn)產(chǎn)生了不良影響.

為了探究AZM 潛在的神經(jīng)毒性機(jī)制,采用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)了AZM 作用的目標(biāo)基因,并對(duì)這些基因進(jìn)行了通路富集分析.然而,結(jié)果并未顯示與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)的通路,而是更多地富集在血管形成和免疫系統(tǒng)相關(guān)通路上.研究表明,血管和神經(jīng)系統(tǒng)在功能和解剖學(xué)上存在著密切的聯(lián)系,例如軸突引導(dǎo)信號(hào)與血管模式的相互調(diào)節(jié)[27].進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)AZM 有可能通過(guò)調(diào)控VEGF/Notch 信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)斑馬魚(yú)的神經(jīng)毒性[28].此外,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞形成一個(gè)協(xié)調(diào)的網(wǎng)絡(luò)來(lái)維持體內(nèi)平衡和限制神經(jīng)炎癥.因此,免疫系統(tǒng)在保持正常腦功能方面也起著不可忽視的作用[29].基于此,推測(cè)AZM 可能通過(guò)調(diào)控血管生成和影響免疫系統(tǒng)從而誘發(fā)神經(jīng)毒性.

為了驗(yàn)證這一假設(shè),進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.通過(guò)觀察Tg(kdrl:mCherry)血管轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú),發(fā)現(xiàn)AZM 急性暴露組斑馬魚(yú)尾部血管分支異常且排布雜亂.這一現(xiàn)象與上述AZM 暴露下斑馬魚(yú)幼魚(yú)行為學(xué)異常、神經(jīng)元減少及AChE 活性降低的結(jié)果一致,進(jìn)一步說(shuō)明AZM 急性暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)幼魚(yú)出現(xiàn)血管和神經(jīng)毒性.

免疫系統(tǒng)在細(xì)胞層面主要由先天免疫(如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)和適應(yīng)性免疫(如T 細(xì)胞和B 細(xì)胞)組成.在斑馬魚(yú)幼魚(yú)的發(fā)育過(guò)程中,巨噬細(xì)胞是首個(gè)出現(xiàn)的免疫細(xì)胞類(lèi)型,主要負(fù)責(zé)損傷修復(fù)和炎癥反應(yīng)的調(diào)控[30].在適應(yīng)性免疫中,T 細(xì)胞負(fù)責(zé)識(shí)別特異性抗原,激活和調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞,在維持免疫平衡和抵抗病原體方面起著關(guān)鍵作用[31].隨著急性暴露AZM 濃度增加至8mg/L 時(shí),我們觀察到斑馬魚(yú)幼魚(yú)先天免疫細(xì)胞(即巨噬細(xì)胞)數(shù)量明顯增加,而適應(yīng)性免疫細(xì)胞(即T 細(xì)胞)數(shù)量則出現(xiàn)下降,相應(yīng)的胸腺面積也顯著減少.表明AZM 暴露會(huì)造成斑馬魚(yú)先天免疫和適應(yīng)性免疫的損傷.這一系列觀察結(jié)果進(jìn)一步印證了AZM 急性暴露不僅會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)的血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒性效應(yīng),而且還可能通過(guò)血管與神經(jīng)系統(tǒng),以及神經(jīng)與免疫系統(tǒng)之間的相互作用和串?dāng)_,進(jìn)一步誘發(fā)神經(jīng)毒性.當(dāng)然,這些推斷還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以強(qiáng)化其科學(xué)性和準(zhǔn)確性.

4 結(jié)論

4.1 AZM 急性暴露造成斑馬魚(yú)幼魚(yú)脊柱彎曲、卵黃囊水腫和游囊發(fā)育異常,并且異常程度隨濃度梯度增加而增加.

4.2 AZM 急性暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)脊索損傷、腦部神經(jīng)元減少、AChE 活性下降、自主運(yùn)動(dòng)活力減少和光暗節(jié)律失衡,上述指標(biāo)均反映了AZM 對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性效應(yīng).

4.3 利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出AZM 對(duì)斑馬魚(yú)作用靶基因的功能與血管和免疫相關(guān).進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察顯示,在AZM 暴露下,斑馬魚(yú)幼魚(yú)出現(xiàn)血管分支異常、巨噬細(xì)胞數(shù)量增加和胸腺T 細(xì)胞發(fā)育被抑制的現(xiàn)象,從而確證了AZM 具有誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血管和免疫毒性的潛力.