水合氧化物對(duì)抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移的影響

李曉佳,劉 思,王婷婷,秦 超,胡小婕,高彥征(南京農(nóng)業(yè)大學(xué),土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所,江蘇 南京 210095)

抗生素抗性基因(ARGs)是一種新型環(huán)境污染物,普遍存在于水、土壤、大氣中.其在環(huán)境中的廣泛傳播,易導(dǎo)致多重耐藥致病菌產(chǎn)生,進(jìn)而危害人類健康.ARGs 在環(huán)境中傳播的主要方式包括垂直基因轉(zhuǎn)移和水平基因轉(zhuǎn)移.由于水平基因轉(zhuǎn)移可以實(shí)現(xiàn)基因在同種和不同種屬菌株間的傳遞,因此對(duì)于ARGs 在環(huán)境中的擴(kuò)散與傳播具有更加重要的影響,這也是細(xì)菌獲得耐藥性的主要方式之一[1-2].ARGs水平轉(zhuǎn)移方式主要有接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo).其中,接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)針對(duì)細(xì)胞內(nèi)的DNA,而轉(zhuǎn)化則允許細(xì)菌同化胞外的DNA.與胞內(nèi)DNA 相比,胞外DNA 更易受到外部環(huán)境影響,因此,了解ARGs 的轉(zhuǎn)化過程對(duì)于控制它在環(huán)境中的傳播具有重要意義.

土壤是人類生產(chǎn)、生活的重要資源,也是ARGs主要受納體之一.ARGs 在土壤中的傳播與擴(kuò)散受到多種生物和非生物因素影響.現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的污染物如離子液體[3]、重金屬[4]、有機(jī)化合物[5]等均能對(duì)ARGs 的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響.金屬氧化物是土壤礦物的重要組成部分,主要包括鐵氧化物、鋁氧化物、錳氧化物等,水合形式是其存在的重要形式.在高度風(fēng)化的土壤中,水合氧化物最高可占據(jù)土壤總重的50%[6].這些土壤氧化物在不斷變換的地表環(huán)境中長久地經(jīng)歷各種復(fù)雜過程,通常具有比表面積大、表面性質(zhì)活潑、帶有兩性電荷等性質(zhì),對(duì)于許多物質(zhì)具有很強(qiáng)的吸附能力,擁有與土壤中重金屬離子、有機(jī)污染物、DNA、細(xì)菌等多種生物和非生物物質(zhì)相互作用的潛能,這也為其影響ARGs 水平轉(zhuǎn)移提供了可能.

一方面,土壤水合氧化物能夠與DNA 發(fā)生結(jié)合.由于脫氧核糖-磷酸鏈處于DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)外側(cè),環(huán)境中DNA 分子表面通常呈現(xiàn)負(fù)電性.而土壤水合氧化物多攜帶正電荷,其具有與DNA 相互結(jié)合的可能.現(xiàn)今,學(xué)者們?cè)诖朔矫嬉呀?jīng)有所發(fā)現(xiàn).Cai等[7]和Saeki 等[8]分別發(fā)現(xiàn)針鐵礦和三水鋁石對(duì)鮭魚精DNA 具有不同程度的吸附能力,吸附量分別達(dá)到3.5mg/g與5.4mg/g.另一方面,土壤水合氧化物活潑的表面性質(zhì),使其具有易吸附于細(xì)菌表面的特性.其可通過靜電作用、化學(xué)成鍵、配位鰲合、離子交換等方式結(jié)合于宿主細(xì)胞包膜上,引起細(xì)菌生理生化改變,具體表現(xiàn)為細(xì)菌胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)水平、細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞形態(tài)、相關(guān)mRNA表達(dá)情況等發(fā)生變化.已有研究表明,三水鋁石可通過靜電作用、化學(xué)成鍵作用黏附于細(xì)菌表面[9];針鐵礦能夠促使致病菌胞內(nèi)ROS 大量生成,不僅抑制了其蛋白質(zhì)合成,還破壞了細(xì)胞膜完整性,進(jìn)而顯著抑制細(xì)菌生長[10].由此可見,土壤中水合氧化物可與細(xì)菌相互作用并影響其生理生化與存活.結(jié)合土壤水合氧化物與DNA 的相互作用,不難窺見土壤水合氧化物充分具有影響ARGs 以轉(zhuǎn)化形式進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移的可能性.

基于此,本文以負(fù)載于pUC19 質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因?yàn)榇硇园釧RGs,以大腸桿菌作為受體細(xì)胞,研究土壤中比較常見、具有代表性的兩種水合氧化物(水合鋁氧化物與水合錳氧化物)對(duì)ARGs轉(zhuǎn)化的影響.同時(shí),分別分析了水合氧化物與DNA及受體細(xì)胞的相互作用,以揭示其影響ARGs 轉(zhuǎn)化的機(jī)制.該研究將有助于增進(jìn)人們對(duì)環(huán)境中抗生素耐藥性傳播的認(rèn)識(shí).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

四水硝酸錳( Ⅱ)、無水氯化鋁購于南京晶格化學(xué)科技有限公司.抗性質(zhì)粒pUC19 購于Takara 生物科技(中國)有限公司,濃度為0.5μg/μL,被溶解于含有10mmol/L Tris-HCl(pH 為8)及1mmol/L EDTA 溶液中.革蘭氏陰性菌大腸桿菌E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(Trelief? 5α Chemically Competent Cell)購于擎科生物科技(北京)有限公司.氯化鈉(NaCl)、蛋白胨、酵母提取物(生物可用級(jí)別)購自于Oxoid(英國)有限公司.瓊脂粉、氨芐西林鈉鹽購自于Solarbio 科技(中國)有限公司.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)購自凱基生物技術(shù)股份(南京)有限公司.超純水通過Milli-Q 梯度系統(tǒng)獲得(電導(dǎo)率18.2M?×cm)(貝德福德,MA,美國),此水被用于本文所有實(shí)驗(yàn).

1.2 研究方法

1.2.1 水合氧化鋁與水合氧化錳合成 分別將5g NaOH、5.56g AlCl3固體加入250mL 水中制得0.5mol/L NaOH 溶液和0.5mol/L AlCl3溶液.然后將NaOH 溶液加入AlCl3溶液中,快速攪拌,并調(diào)節(jié)pH=7.0.室溫陳化48h,離心,棄去上層清液.用去離子水反復(fù)漂洗離心6 次,至上層清液pH=7.0,沉淀透析16h 以除去多余離子.洗滌后的沉淀物在25℃風(fēng)干,用研缽和研杵輕輕研磨,過60 目篩并收集粉末.

分別將18.83g Mn(NO3)2·4H2O、7.95g KMnO4、4g NaOH 固體溶解于250mL 水中配成0.3mol/L Mn(NO3)2溶液、0.2mol/L KMnO4溶液和0.4mol/L NaOH 溶液.將KMnO4溶液緩緩加入NaOH 溶液中制得堿性KMnO4溶液,再將Mn(NO3)2溶液與堿性KMnO4溶液充分混合,此時(shí)Mn(NO3)2、KMnO4和NaOH 混合的摩爾比為3:2:4.所得沉淀清洗數(shù)次并重新分散于NaNO3溶液中,調(diào)節(jié)pH 值等于7,老化16h.用去離子水反復(fù)漂洗離心,沉淀透析16h,以除去多余離子.洗滌后的沉淀物在25℃風(fēng)干,用研缽和研杵輕輕研磨,過60 目篩并收集粉末.

1.2.2 水合氧化物組成及表面性質(zhì) 本實(shí)驗(yàn)采用X 射線衍射儀(XRD;布魯克D2PHASER)對(duì)樣品進(jìn)行分析.實(shí)驗(yàn)采用銅靶,掃描速度2°/min,掃描角度0～80°.采用掃描電鏡(SEM)觀察樣品的表面形貌和顆粒尺寸.將樣品置于銅網(wǎng)并做噴金處理,后用SEM(S-3400N,Hitachi,日本)進(jìn)行觀察.以水為分散劑,采用納米粒度及 Zeta 電位分析儀(Malvern Zetasizer Nano ZS90 )測定兩種水合氧化物的粒徑大小及Zeta 電位.

1.2.3 ARGs 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 將兩種水合氧化物配制為1g/L 儲(chǔ)備液并超聲、分散1h,后將儲(chǔ)備懸浮液稀釋至系列濃度以備后續(xù)實(shí)驗(yàn).將25ng pUC19 質(zhì)粒加入上述水合氧化物稀釋液中,并將混合物轉(zhuǎn)移至裝有100μL E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞的離心管中(水合氧化物終濃度為0～200mg/L),25℃、200r/min 條件下反應(yīng)5h.每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行.隨后將所有裝有質(zhì)粒-感受態(tài)細(xì)胞混合物的離心管輕輕搖勻,取出后將其置于37℃水浴中5min,并即刻放入冰水浴5min.最后向離心管中加入LB 液體培養(yǎng)基,使最終體積為1mL,在37℃、轉(zhuǎn)速150r/min 條件下復(fù)蘇培養(yǎng)1h.

采用抗生素篩選平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化效率/頻率測定.將100μL 上述菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基平板上,以確定轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù).將另一份100μL 上述菌液涂布于未含任何抗生素平板上,以確定宿主細(xì)胞存活個(gè)數(shù).涂布完成后,將平板正向放置30min,隨后倒置放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h.最后,計(jì)算平板菌落數(shù)以確定轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù).

為考察水合氧化物析出離子的影響,將 0～200mg/L 水合氧化物懸液加入無菌水,避光、置于25℃、200r/min 搖床中5h,離心使水合氧化物與上清液分離.利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)檢測上清液中離子種類及濃度.取上清液與25ng 質(zhì)?；旌?并轉(zhuǎn)移至感受態(tài)細(xì)胞懸液,作用5h 后,按上述步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).

按下列公式計(jì)算ARGs 轉(zhuǎn)化效率、轉(zhuǎn)化頻率:

將所得數(shù)據(jù)通過Origin 軟件作圖以表明可存活的大腸桿菌數(shù)、轉(zhuǎn)化子、轉(zhuǎn)化效率、轉(zhuǎn)化頻率隨水合氧化物濃度增加的變化.并采用SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、LSD多重比較法和Duncan新復(fù)極差法對(duì)各變量進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),以0.05 為顯著性水平,比較各組不同濃度的水合氧化物作用下存活的大腸桿菌數(shù)、轉(zhuǎn)化子、轉(zhuǎn)化效率、轉(zhuǎn)化頻率與對(duì)照組之間的顯著性差異,并在圖中進(jìn)行標(biāo)注.

1.2.4 水合氧化物與DNA 的相互作用 利用原子力顯微鏡(AFM)觀察質(zhì)粒與兩種水合氧化物結(jié)合前后的形態(tài).將100ng質(zhì)粒與200mg/L的水合氧化物混合制成200μL 混合體系,在25℃條件下反應(yīng)5h 后,將10uL 樣品溶液滴至云母片表面,并在25℃下使其自然干燥.質(zhì)粒樣品圖片通過 Multimode 8AFM(Bruker,德國)原子力顯微鏡獲得.

分析水合氧化物與質(zhì)粒DNA 結(jié)合位點(diǎn).將2mg質(zhì)粒DNA 與100mg/L 水合氧化物混合制成5mL 混合體系,在25℃條件下反應(yīng)5h后,放入冷凍干燥儀進(jìn)行干燥.所獲樣品利用Nicolet NEXUS870 傅里葉紅外光譜(FTIR)儀獲取其對(duì)應(yīng)光譜,并通過譜圖分析兩者結(jié)合位點(diǎn).

1.2.5 水合氧化物對(duì)宿主細(xì)胞膜通透性的影響大腸桿菌-水合氧化物(0～200mg/L)混合液在25℃條件下反應(yīng)5h 后,與PI 染料進(jìn)行混合,隨后在25℃、黑暗環(huán)境中孵育30min.最后,細(xì)菌發(fā)出的紅色熒光由流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6)進(jìn)行測定,測量時(shí)激發(fā)波長設(shè)定為480nm,每組共檢測10000 個(gè)細(xì)胞,并使用Flowjo 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

采用 SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、LSD 多重比較法和Duncan 新復(fù)極差法對(duì)各變量進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),以0.05 為顯著性水平,比較不同水合氧化物濃度下細(xì)胞膜通透性水平的顯著性差異,并采用 Origin 軟件作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 水合氧化物材料表征

2.1.1 XRD 表征 對(duì)實(shí)驗(yàn)制得的水合氧化鋁和水合氧化錳進(jìn)行XRD 表征,XRD 譜圖如圖1(a)所示.水合氧化鋁分別在衍射角為40.0°和65.6°處顯示了兩個(gè)較為明顯的衍射峰,該譜圖與文獻(xiàn)報(bào)道的水合氧化鋁出峰位置一致[11].水合氧化錳在衍射角為37.3°和66.7°時(shí)均出現(xiàn)了衍射峰,該樣品的衍射峰峰形完整、窄而尖銳、相對(duì)強(qiáng)度較高,未觀察到其它明顯雜質(zhì)衍射峰出現(xiàn),該譜圖符合水合氧化錳(δ-MnO2)特征[12].

圖1 水合氧化物表征Fig.1 Characterization of hydrous oxides

2.1.2 水合氧化物基本形貌表征 現(xiàn)有研究表明,環(huán)境溫度、作用時(shí)間和pH 值等多種因素均能夠?qū)λ涎趸X的形成速度和種類產(chǎn)生影響[13-17].已有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度上升至150℃時(shí),其水合產(chǎn)物中薄水鋁石(AlOOH)比三水鋁石更加穩(wěn)定[17].不同水熱條件下合成的水合氧化鋁類型相異,即亞穩(wěn)態(tài)的氧化鋁多晶在水介質(zhì)中可發(fā)生相變[18-21],目前已知的水合氧化鋁結(jié)晶相至少有7 種[22].類似地,水合氧化錳的形成也與不同的反應(yīng)時(shí)間和環(huán)境條件密切相關(guān).李娜[23]指出,氧化錳存在至少30 種不同的晶體結(jié)構(gòu),不同的反應(yīng)條件下可制備出晶格結(jié)構(gòu)、表面形貌、比表面積不同的氧化錳類型.其中,δ-MnO2是典型的水合氧化錳晶體,其層間距中除了堿金屬離子之外,還含有封閉的水層.由此可見,不同水合方式與水合條件下形成的水合氧化物形貌也各有不同.在本實(shí)驗(yàn)條件下,水合氧化鋁多為較小塊狀,具有一定的不規(guī)則性;而水合氧化錳則呈現(xiàn)為較為均勻的顆粒狀(圖1(b)).

2.1.3 粒徑及Zeta 電位表征 對(duì)實(shí)驗(yàn)制得的水合氧化物進(jìn)行粒徑及Zeta 電位表征,結(jié)果如表1 所示.水合氧化鋁的粒徑為(449.43±13.86)nm,水合氧化錳的粒徑為(350.27±2.38)nm.此外,Zeta 電位反映了顆粒表面電荷種類和密度,是衡量懸浮液體系中膠粒凝聚穩(wěn)定性的重要指標(biāo).兩種水合氧化物均顯示為正電位,Zeta電位相近且均不超過30mV,這表明顆粒間電荷排斥力較小,在水中較易發(fā)生團(tuán)聚.多分散系數(shù)(PDI)可反映粒徑分布的均一程度,PDI 指數(shù)越小,則樣品粒度分布越均勻.通過分析PDI 數(shù)據(jù)可知(表1),實(shí)驗(yàn)所制的水合氧化鋁PDI 較高(PDI>0.3),即分子量分布較寬,均勻性較差;相反,水合氧化錳的分子量分布較為均勻,均一性更好,這與SEM 表征結(jié)果一 致.

表1 水合氧化物的粒徑及Zeta 電位Table 1 Particle sizes and Zeta potentials of hydrous oxides

2.2 水合氧化物對(duì)ARGs 水平轉(zhuǎn)移的影響

為探究水合氧化物對(duì)ARGs 水平轉(zhuǎn)移的影響,將土壤礦物材料配置成系列濃度(0～200mg/L)溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖2 所示.總體上,兩種水合氧化物均未顯著抑制大腸桿菌存活,可培養(yǎng)的大腸桿菌個(gè)數(shù)僅在100 和200mg/L 水合鋁氧化物處理下略有降低.兩種水合氧化物均導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)、轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化頻率降低.與對(duì)照組ARGs轉(zhuǎn)化頻率相比,50mg/L 水合氧化鋁處理下轉(zhuǎn)化頻率開始出現(xiàn)顯著變化,而≥2.5mg/L 水合氧化錳即可顯著抑制ARGs 轉(zhuǎn)化.在200mg/L 水合氧化鋁處理下,轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化頻率分別降至 3.39×104CFU/μg 和0.006,其中轉(zhuǎn)化頻率相比于對(duì)照組降低了79.44%.在200mg/L 水合氧化錳處理下,轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化頻率分別降至33.11×104CFU/μg 和0.014,其中轉(zhuǎn)化頻率相比于對(duì)照組降低了57.64%.這表明,水合氧化鋁和水合氧化錳均抑制了ARGs轉(zhuǎn)化過程.

圖2 水合氧化物對(duì)ARGs 轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 The effect of hydrous oxides on the transformation of ARGs

2.3 水合氧化物析出金屬離子及其對(duì)ARGs 水平轉(zhuǎn)移的影響

現(xiàn)有研究表明,土壤水合氧化物溶于水時(shí),可能會(huì)析出一定量的金屬離子.而土壤中游離態(tài)金屬離子會(huì)對(duì)同一環(huán)境中的ARGs 污染產(chǎn)生影響.一方面,重金屬(Cu2+、Ag+、Cr6+、Zn2+、Cd2+)[4,24-25]等可通過導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生、增加細(xì)胞膜通透性、改變mRNA 基因表達(dá)等機(jī)制促進(jìn)ARGs 水平轉(zhuǎn)移;另一方面,重金屬可以通過協(xié)同選擇和交叉選擇使ARGs 豐度提升[26].

為明確水合氧化物析出的金屬離子是否是其抑制ARGs 轉(zhuǎn)化的原因,本實(shí)驗(yàn)首先測定了0～200mg/L 水合氧化物析出的離子濃度.結(jié)果表明(圖3(a)),在供試范圍內(nèi),隨著水合氧化鋁濃度的升高,其析出的Al(III)呈現(xiàn)明顯上升趨勢,200mg/L 水合氧化鋁析出的Al(III)高達(dá)3299.38μg/L.而對(duì)于水合氧化錳,隨著其濃度升高,溶液中Mn(II)濃度總體上在0～4μg/L 區(qū)間內(nèi)上下浮動(dòng),幾乎可以忽略不計(jì).

圖3 水合氧化物析出離子及其對(duì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Metal cations released from hydrous oxides and its impact on transformation of ARGs

有學(xué)者指出,水溶液中Al(III)可引起DNA 團(tuán)聚[27],這可能會(huì)降低游離ARGs 進(jìn)入受體細(xì)菌胞內(nèi)的效率.為進(jìn)一步探查析出Al(III)對(duì)ARGs 轉(zhuǎn)化的影響,收集0～200mg/L 水合氧化鋁析出的Al(III)溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).如圖3(b)所示,隨著Al(III)濃度的升高,可培養(yǎng)大腸桿菌數(shù)增加;相反的,ARGs 轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)、轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化頻率呈現(xiàn)下降趨勢.在200mg/L 水合氧化鋁析出的Al(III)處理下,轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化頻率由18.72×104CFU/μg 和0.010 分別降至2.83×104CFU/μg 和0.001,其中轉(zhuǎn)化頻率相比于對(duì)照組降低了88.15%.由此可見,水合氧化鋁析出的Al(III)是其抑制ARGs 水平轉(zhuǎn)移的因素之一.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Al(III)并未抑制大腸桿菌存活,其對(duì)ARGs轉(zhuǎn)化的影響并非通過抑制大腸桿菌細(xì)胞活性導(dǎo)致,具體機(jī)理仍需結(jié)合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析.

2.4 水合氧化物與抗性質(zhì)粒的相互作用

為進(jìn)一步探究水合氧化物與DNA 的相互作用,通過AFM 觀察質(zhì)粒DNA 與高濃度(100mg/L)水合氧化物溶液作用前后形態(tài)變化.如圖4(a)所示,未添加水合氧化物的對(duì)照組中DNA 呈絲狀、以獨(dú)立個(gè)體形式存在.而在添加100mg/L 水合氧化物的處理組中,質(zhì)粒與水合氧化物發(fā)生交纏,形成大尺寸結(jié)合物(直徑約為60～80nm;圖4(a)中的亮白點(diǎn)),難以觀察到單個(gè)絲狀DNA.這些大尺寸質(zhì)粒-水合氧化物結(jié)合體導(dǎo)致抗性質(zhì)粒及其攜帶的ARGs 難以進(jìn)入胞內(nèi),進(jìn)而阻礙了ARGs 的水平轉(zhuǎn)移.除水合氧化物本身與DNA 的結(jié)合外,水合氧化鋁析出的Al(III)也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒發(fā)生團(tuán)聚(圖3(a))[27].

圖4 水合氧化物與質(zhì)粒DNA 的相互作用Fig.4 Interaction between hydrous oxides and plasmid DNA

通過分析水合氧化物暴露前后pUC19 質(zhì)粒的紅外光譜變化,確定水合氧化物在質(zhì)粒上的結(jié)合位點(diǎn).圖4(b)中的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了DNA 與水合氧化物之間發(fā)生了相互作用.對(duì)于未與水合氧化物反應(yīng)的質(zhì)粒DNA,可識(shí)別的紅外光譜特征峰對(duì)應(yīng)于磷酸基團(tuán)中P-O 拉伸振動(dòng)位于1061.3cm-1,PO2-不對(duì)稱拉伸振動(dòng)位于 1228.7cm-1[28].位于 1481.9,1604.1,1653.5,1688.9cm-1的振動(dòng)峰分別歸屬為質(zhì)粒堿基胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)[28].與對(duì)照組相比,加入水合氧化鋁后的 DNA,在1061.3cm-1處的吸收峰偏移到了1058.5cm-1,而加入水合氧化錳后的DNA 在該處則沒有發(fā)生吸收峰的偏移;水合氧化鋁和水合氧化錳加入后,DNA 在1228.7cm-1處的振動(dòng)峰分別偏移到了1223.0 和1230.1cm-1,這表明兩種水合氧化物都可通過磷酸基團(tuán)與DNA 結(jié)合.

而加入水合氧化物后的DNA 在1481.9,1604.1,1653.5,1688.9cm-1這4 處的振動(dòng)峰也發(fā)生了不同程度的偏移.其中,加入水合氧化鋁后 DNA 在1481.9cm-1處的振動(dòng)峰沒有偏移;而在1604.1,1653.5,1688.9cm-1處的振動(dòng)峰則分別偏移到了 1601.6,1646.4,1686.4cm-1.這表明,pUC19 質(zhì)粒還可通過堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶和鳥嘌呤與水合氧化鋁發(fā)生結(jié)合,而胞嘧啶與水合氧化鋁未發(fā)生結(jié)合.而加入水合氧化錳后的 DNA, 在 1481.9,1604.1,1653.5,1688.9cm-1處的振動(dòng)峰分別偏移到了1483.3,1601.6,1650.6,1693.8cm-1,這表明,pUC19 質(zhì)?？赏ㄟ^4 種堿基與水合氧化錳發(fā)生結(jié)合.

2.5 大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的變化

除了與DNA 發(fā)生相互作用外,水合氧化物也具有與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用的潛能.現(xiàn)有研究表明,金屬氧化物以及金屬離子可通過改變宿主細(xì)胞膜通透性、引起細(xì)胞膜損傷、影響胞內(nèi)ROS生成等,使ARGs 轉(zhuǎn)化頻率發(fā)生不同程度的改變.例如,納米Al2O3可造成大腸桿菌E. coli DH5α 細(xì)胞膜形成納米孔洞,有助于攜帶ARGs 的質(zhì)粒pBR322 進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)其抗性[29].在本實(shí)驗(yàn)中,水合氧化物及其析出的金屬離子具有影響宿主細(xì)胞膜通透性的理論可能.因此,本實(shí)驗(yàn)采用PI 染色法、借助流式細(xì)胞儀進(jìn)一步探究了水合氧化物作用下宿主細(xì)胞膜發(fā)生的變化.

熒光染料PI 是一種可對(duì)DNA 染色的細(xì)胞核染色試劑,當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞通透性發(fā)生改變,PI 染料可穿過細(xì)胞膜嵌入胞內(nèi)DNA 雙鏈釋放紅色熒光,該紅色熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞膜通透性的大小.在本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性提升時(shí),細(xì)菌發(fā)出的熒光強(qiáng)度則更強(qiáng),其對(duì)應(yīng)的出峰位置向右偏移;當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性減弱時(shí),其對(duì)應(yīng)的出峰位置向左偏移.不同濃度水合氧化物作用下細(xì)胞膜通透性變化如圖5 所示.在0～100mg/L 水合氧化鋁作用下,隨著水合氧化鋁濃度升高,宿主細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度并未出現(xiàn)顯著變化,對(duì)應(yīng)出峰位置未發(fā)生明顯偏移,即細(xì)胞膜的通透性未顯著改變,僅在200mg/L 的水合氧化鋁作用下宿主細(xì)胞的熒光強(qiáng)度有所上升.然而,水合氧化錳暴露下細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著下降,對(duì)應(yīng)出峰位置左移,細(xì)胞膜通透性變?nèi)?減弱的細(xì)胞膜通透性將降低宿主對(duì)ARGs 的攝入,進(jìn)而使ARGs 水平轉(zhuǎn)移頻率降低(圖2(b)).

圖5 水合氧化物對(duì)宿主細(xì)胞膜通透性的影響Fig.5 The effect of hydrous oxides on the membrane permeability of recipient cells

值得注意的是,水合氧化錳對(duì)宿主細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生抑制效應(yīng)的原因可能與其在水溶液中的團(tuán)聚有關(guān),這些團(tuán)聚體易包裹細(xì)菌,阻礙細(xì)菌與外界環(huán)境的有效接觸,增強(qiáng)細(xì)胞膜的屏障作用,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性減弱.對(duì)于水合氧化鋁顆粒,盡管其團(tuán)聚體也在一定程度上占據(jù)了細(xì)胞膜的部分位置,但其析出的濃度較高的Al(III)被證明可以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS 過量產(chǎn)生[30],這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性提升,進(jìn)而可能抵消了由水合氧化鋁團(tuán)聚體包裹引發(fā)的對(duì)宿主膜通透性的抑制效應(yīng).因此,對(duì)于水合氧化鋁,未觀察到顯著的膜通透性變化.

3 結(jié)論

3.1 水合氧化鋁與水合氧化錳對(duì)胞外ARGs 水平轉(zhuǎn)移均具有抑制作用,且抑制程度受其濃度調(diào)控.200mg/L 水合氧化鋁處理下,轉(zhuǎn)化頻率相比于對(duì)照組降低了79.44%;在200mg/L 水合氧化錳處理下轉(zhuǎn)化頻率相比于對(duì)照組降低了57.64%.

3.2 水合氧化鋁析出的Al(III)是其抑制ARGs 水平轉(zhuǎn)移的因素之一.200mg/L 水合氧化鋁析出Al(III)高達(dá)3299.38 μg/L,該濃度的Al(III)作用下,轉(zhuǎn)化頻率相比于對(duì)照組降低了88.15%.而水合氧化錳未有明顯Mn(II)析出.

3.3 兩種水合氧化物均對(duì)質(zhì)粒DNA 具有吸附作用,能夠引發(fā)大尺寸DNA-水合氧化物結(jié)合體的形成,這是其抑制ARGs 水平轉(zhuǎn)移的原因之一. pUC19 質(zhì)?？赏ㄟ^磷酸基團(tuán)以及堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶和鳥嘌呤與水合氧化鋁發(fā)生結(jié)合;通過磷酸基團(tuán)以及4種堿基與水合氧化錳發(fā)生結(jié)合.

3.4 水合氧化錳顯著降低了宿主細(xì)胞膜通透性,這也是其抑制ARGs 水平轉(zhuǎn)移的因素之一.