蟾毒靈抑制M2型巨噬細胞介導的結直腸癌遷移和上皮間質轉化

唐東豪,陳進寶,賈琳琳,沈東曉,尚 靖,馮月嬌,盧佳豪,肖增友,何鈺潔,王 杰

結直腸癌 (colorectal cancer, CRC)是世界第三大常見的惡性腫瘤,大多數結直腸癌患者的死亡是由于腫瘤轉移至肝臟。全球范圍內,每年診斷出約 140 萬例新增結直腸癌病例,約 25% 的患者在診斷時出現肝轉移[1]。 控制結直腸癌轉移對于改善預后至關重要。很多報道[2]表明腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用是結直腸癌轉移的重要因素。巨噬細胞作為腫瘤微環(huán)境的主要成分,其中M2型巨噬細胞高表達細胞因子白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)等,通常以促進腫瘤的發(fā)展為導向[3]。IL-6是一種重要的促炎細胞因子,高表達的 IL-6 與 CRC 的不良預后相關[4]。有研究[5]表明M2型巨噬細胞釋放IL-6可以促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。越來越多研究[6]表明蛋白激酶B (threonine-specific protein kinase, AKT)/ 磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphoinositide 3-Kinase, PI3K)是腫瘤發(fā)生上皮間質轉化、促進腫瘤轉移的重要因素之一。但關于M2型腫瘤相關巨噬細胞來源的IL-6對于AKT/PI3K信號通路的激活報道還比較少[7]。蟾毒靈(bufalin,BU)是臨床用藥華蟾素的主要活性成分,有促腫瘤細胞凋亡,抗血管生成,抑制轉移的作用[8]。該文旨在研究BU對于M2型巨噬細胞介導結直腸癌轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株人急性白血病單核細胞THP-1、結直腸癌HCT116細胞株,從中國科學院上海細胞生物學研究所購買。

1.2 試劑及耗材RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗、胰酶(Trypsin-EDTA)、胎牛血清購自美國Gibco公司;佛波酯(美國SIGMA公司);ELISA 試劑盒(BOSTER,武漢);蟾毒靈購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)結直腸癌HCT116細胞、人急性白血病單核細胞THP-1均含有1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于細胞培養(yǎng)箱中進行恒溫培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。取生長狀態(tài)良好(對數生長期)的細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 條件培養(yǎng)基(condition medium, CM)收集取對數生長期的THP-1細胞鋪板于6 孔板,每孔種植1×106個細胞,加入IL- 4 和 IL-13。待分化為M2型巨噬細胞后棄去培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)基添加2 ml/孔, 48 h后收取上清液,離心800 r/min,10 min,獲得CM。

1.5 熒光定量PCR實驗提取細胞RNA根據艾科瑞生物試劑盒說明書去操作,逆轉錄按照試劑盒的說明書。PCR反應組分：2×SYBR 5 μl Template 1μl,Primer F 0.2 μl, Primer R 0.2 μl RNase free water 3.6 μl;參照儀器操作手冊設置反應條件。見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 CCK-8實驗HCT116到對數生長期,胰酶消化,計數板計數后調整細胞濃度為105個/ml,100 μl細胞懸液加入到96孔板的每個孔中。第二天細胞貼壁后,去除培養(yǎng)基,根據實驗需要對細胞進行不同濃度的BU或條件培養(yǎng)基處理,培養(yǎng)箱中孵育48 h。配制對CCK-8反應液,具體條件為CCK-8 ∶無血清培養(yǎng)基=1 ∶9(避光條件下)。去掉原先孔中培養(yǎng)基,將100 μl 配制好的反應液加入到每孔中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1～2 h。通過酶標儀進行吸光值檢測,一般為 450 nm波長處,進而計算細胞存活率,采用 Graphpad8軟件作圖。

1.7 單核細胞誘導分化對人急性白血病單核細胞THP-1進行細胞計數,接種 1×106個單核細胞于6孔板中,加入 IL- 4 和 IL-13 刺激。IL- 4 和 IL-13 濃度均為 20 μg/ml。確定 IL- 4 和 IL-13 刺激時間2 d 時用ELISA、熒光定量PCR檢測表面分子標志物的表達。結果顯示,單核細胞表面IL-10 和 TFG-β的表達在 IL- 4 和 IL-13 刺激2 d 后明顯增加。

1.8 ELISA實驗根據ELISA試劑盒的說明,用人源IL10、 TGF-β的試劑盒,測出巨噬細胞TGF-β、IL10的水平。

1.9 Western blot實驗棄掉培養(yǎng)皿的上清液,加入PBS溶液清洗,加入裂解液,于冰上靜置15 min后,使用細胞刮刀收取懸液放入EP管,使用超聲振蕩后進行定量,再進行金屬浴。之后上樣、電泳和轉膜。封閉后將抗體進行稀釋Beta Actin(鼠 1 ∶3 000) 、PI3K(兔 1 ∶1 000) 、P-PI3K(兔 1 ∶1 000)、 AKT(兔 1 ∶1 000) 、P-AKT(兔1 ∶2 000) 、MMP9(兔 1 ∶1 000)、MMP2(兔1 ∶1 000)、E-Cadherin(兔 1 ∶1 000)、 N-Cadherin(兔 1 ∶1 000)。4 ℃過夜,次日用二抗孵育1 h,最后去顯影。

1.10 劃痕實驗將細胞消化后離心,按照1×106個/ml放入6孔板中,待細胞貼壁占據90%面積。取6孔板內最大直徑,用200 μl槍頭沿著直尺快速劃下,清洗2次,在倒置顯微鏡下進行拍照。

1.11 Transwell實驗將細胞制成懸液,并計數2.5×105個/ml。在24孔板的下方加入700 μl含有20%FBS的培養(yǎng)基,用槍頭將小室放入培養(yǎng)基上方。加入300 μl細胞懸液到小室。2 d后,將上清液吸出,在空白孔內加入500 μl結晶紫,將小室放入后清洗3次,清洗完畢使用固定液固定20 min,用棉簽輕輕擦拭掉小室內壁的細胞,在倒置顯微鏡下進行拍照。

2 結果

2.1 M2型巨噬細胞的鑒定THP-1 細胞被 PMA 誘導 48 h成為 M0型腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages, TAM),然后被 IL-4 和 IL-13 誘導 48 h成為 M2-TAM,可以觀察到細胞由圓餅形狀轉變成梭形(圖1A、B),RT-qPCR實驗檢測巨噬細胞中M2型巨噬細胞相關標志物表達,結果表明,與M0巨噬細胞相比,誘導的M2型巨噬細胞極化標志物IL10、TGF-β升高(圖1C,tIL-10=19.39,P<0.01;tTGF-β=17.13,P<0.01)。此外,ELISA實驗檢測巨噬細胞上清液中M2型巨噬細胞相關標志物也發(fā)生了同樣改變。(圖1D,tIL-10=42.56,P<0.01;tTGF-β=16.87,P<0.001)。

圖1 M2型巨噬細胞的鑒定

圖2 兩組細胞分泌IL-6水平

2.2 M2型巨噬細胞的IL-6分泌在腫瘤微環(huán)境中,M2型巨噬細胞通常會分泌IL-6, ELISA實驗表明了HCT116和M2型巨噬細胞的IL-6水平(圖3,t=42.69,P<0.05)。

圖3 M2型巨噬細胞上清液通過AKT/PI3K磷酸化促進HCT116遷移

2.3 M2型巨噬細胞上清液促進HCT116遷移,促進結直腸癌細胞AKT/PI3K磷酸化表達將HCT116分為兩組,一組普通培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照,另外一組加M2型巨噬細胞上清液培養(yǎng)。Transwell實驗、Western blot實驗、劃痕實驗、RT-qPCR實驗顯示M2型巨噬細胞上清液培養(yǎng)的HCT116遷移能力增強(圖3A、B,t劃痕=113.8,P<0.01;tTranswell=30.13,P<0.05),Western blot實驗顯示條件培養(yǎng)基作用于HCT116后 MMP9、MMP2、N-Cadherin 蛋白水平上升,E-Cadherin蛋白水平下降(圖3C)。MMP9、MMP2、N-Cadherin mRNA水平上升,E-Cadherin mRNA水平下降(圖3D,tMMP9=9.356,P<0.05;tMMP2=11.45,P<0.01;tE-Cadherin=12.00,P<0.05;tN-Cadherin=5.973)。此外,Western blot實驗顯示條件培養(yǎng)基作用于HCT116激活了AKT/PI3K磷酸化表達。這部分的實驗結果證明了M2型巨噬細胞上清液可以促進HCT116的遷移,在這個過程中激活了AKT/PI3K的磷酸化(圖3E)。

2.4 BU對HCT116細胞活性的增殖影響CCK-8實驗觀察BU對HCT116細胞作用48 h后增殖活性的影響,BU對HCT116細胞的增殖活性具有抑制作用,且有濃度依賴性,本實驗采用BU的非殺傷濃度12.5 nmol/L (IC30)(圖4,F=922.1,P<0.001)。

圖4 BU對HCT116的增殖活性影響

2.5 BU可以調節(jié)AKT/PI3K蛋白磷酸化抑制HCT116遷移能力將HCT116分為2組,一組加M2型巨噬細胞上清液作為對照,另外一組M2型巨噬細胞上清液加BU(12.5 nmol/L)培養(yǎng)。Transwell實驗、Western blot實驗、劃痕實驗、RT-qPCR實驗顯示BU可以抑制M2型巨噬細胞上清液促進HCT116遷移的效應(圖5A、B,t劃痕=72.63,P<0.01;tTranswell=26.38,P<0.05),Western blot實驗從蛋白水平驗證BU可以減弱HCT116的上皮間質化能力, MMP9、MMP2、N-Cadherin 蛋白水平降低,E-Cadherin蛋白水平上升(圖5C)。同時RT-qPCR實驗表明MMP9、MMP2、N-Cadherin 基因水平下降,E-Cadherin基因水平升高(圖5D,tMMP9=100.01,P<0.000 1;tMMP2=11.45,P<0.01;tE-Cadherin=32.98,P<0.001;tN-Cadherin=5.973,P<0.01;)。設置普通培養(yǎng)基培養(yǎng)、巨噬細胞上清液、M2型巨噬細胞上清液加BU組驗證BU抑制AKT/PI3K的磷酸化的作用。這部分的實驗結果證明BU可以抑制HCT116遷移,抑制AKT/PI3K磷酸化。(圖5E)。

圖5 BU通過AKT/PI3K磷酸化抑制HCT116遷移

3 討論

CRC是全世界癌癥相關死亡的主要原因之一,CRC作為一種常見的惡性腫瘤,雖然治療上有很大的進步,但CRC遠處轉移仍是患者病死率居高不下的罪魁禍首。腫瘤微環(huán)境主要是指成纖維細胞、巨噬細胞等非腫瘤細胞之間相互影響的場所,是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的局部病理環(huán)境[9]。大量研究顯示,腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與M2型巨噬細胞等腫瘤微環(huán)境密切相關。腫瘤細胞通?？梢酝ㄟ^重塑其腫瘤微環(huán)境,從而避開免疫系統,侵入底層間質,在惡劣的循環(huán)環(huán)境中存活,滲入其他人體的器官,塑造適合腫瘤生長的微環(huán)境,最后,長成臨床可檢測的轉移病灶,而M2型巨噬細胞就參與了這一過程[10]。BU是我國已臨床使用的華蟾素注射液的主要功效成分,目前臨床上已經使用華蟾素來全身治療多種腫瘤[11]。 研究[12]顯示BU在抑制遷移和侵襲、逆轉多藥耐藥、誘導細胞凋亡、抑制血管生成等抗腫瘤作用中發(fā)揮著至關重要的作用。

本研究中,將THP-1用試劑誘導成M2型巨噬細胞, Transwell、劃痕實驗和RT-qPCR實驗顯示結直腸癌細胞遷移和上皮間質轉化能力增加。IL-6通過其受體 IL-6R對許多細胞發(fā)揮作用,在維持慢性炎癥中起主要作用[13],此外,有研究[14]表明 IL-6作為一種促癌因子,促進腫瘤發(fā)展,并有助于CRC中慢性炎性和致瘤性微環(huán)境的形成。另外有研究[15]報道IL-6參與了AKT/PI3K信號通路的磷酸化過程 。ELISA實驗顯示M2型巨噬細胞分泌IL-6水平顯著高于HCT116。Western blot實驗中,M2巨噬細胞上清液可以激活HCT116中AKT/PI3K蛋白磷酸化,促進HCT116遷移和上皮間質轉化。將BU加入M2巨噬細胞上清液培養(yǎng)HCT116,結果BU逆轉了M2型巨噬細胞誘導的結直腸癌細胞遷移和上皮間質轉化,并且減少了AKT/PI3K蛋白磷酸化。

綜上所述,M2型巨噬細胞可以通過分泌IL-6使結直腸癌細胞HCT116遷移和上皮間質轉化,并促進AKT/PI3K通路磷酸化,而BU能夠抑制M2型巨噬細胞誘導的 HCT116 AKT/PI3K通路磷酸化。