運用孟德爾隨機化探索腸道微生物與非酒精性脂肪性肝病的因果關(guān)聯(lián)

吳 閔,安禎祥,2,何遠(yuǎn)利,3,何 松,2,劉 闖,2,孫 凱,2

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是臨床慢性肝病常見的病因,在沒有過量飲酒或其他慢性肝病的情況下,有5%以上肝細(xì)胞中有脂肪變性的存在,與代謝風(fēng)險相關(guān)[1],并且是肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要原因。NAFLD給患者帶來了沉重的負(fù)擔(dān),損害了與健康相關(guān)的生活質(zhì)量和工作效率。目前NAFLD的發(fā)病機制尚不清楚,但腸道微生物組與NAFLD發(fā)病有著重要關(guān)系。當(dāng)下還沒有明確NAFLD的治療方法,有研究[2]表明,腸道組織可以通過腸-肝軸途徑來參與NAFLD疾病的發(fā)生發(fā)展,通過調(diào)控腸道微生物改善NAFLD患者肝臟表型。盡管腸道微生物群與NAFLD密切相關(guān),但是其因果關(guān)系難以捉摸。孟德爾隨機化(Mendelian randomization,MR)是一種統(tǒng)計分析方法,主要采用遺傳變異為工具變量,觀察關(guān)聯(lián)結(jié)果推斷潛在的因果關(guān)系[3]。該研究采用孟德爾隨機化的思想,探討腸道微生物不同菌群之間與NAFLD風(fēng)險的潛在因果關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究設(shè)計采用兩樣本孟德爾隨機化分析腸道微生物與NAFLD之間的因果關(guān)系。以腸道微生物為暴露因素,包含211種腸道細(xì)菌性狀,結(jié)局變量為NAFLD。

1.2 數(shù)據(jù)來源使用的腸道微生物數(shù)據(jù)來自于一項多個國家的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS),該研究納入了24個隊列,18 340 例受試者,分別來自美國、加拿大、以色列、荷蘭、比利時、瑞典、韓國、德國、丹麥、芬蘭和英國,對他們進(jìn)行基因測序譜和基因分型數(shù)據(jù),通過調(diào)整年齡、性別、技術(shù)及遺傳主成分等探索腸道微生物與人類染色體遺傳變異之間的關(guān)系,課題組在5個水平(門、綱、目、科和屬)評估了211個腸道微生物群分類群。該研究基于16S rRNA基因的3個不同可變區(qū)(V4、V3-V4和V1-V2)分析了腸道微生物群的組成,并使用微生物群數(shù)量性狀基因座(microbiome quantitative trait loci,mbQTL)作圖來鑒定影響微生物分類群相對豐度的遺傳變體[4]。NAFLD基因結(jié)果關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)來自FinnGen數(shù)據(jù)庫,包括894例NAFLD病例,217 898例對照。使用數(shù)據(jù)集來源詳見表1。

表1 全基因組關(guān)聯(lián)研究的細(xì)節(jié)與分析中使用的數(shù)據(jù)集

1.3 兩樣本孟德爾隨機化的假設(shè)為了保證暴露因素與結(jié)局指標(biāo)之間因果關(guān)系的真實性和準(zhǔn)確性,MR必須符合3個重要假設(shè)： ① 工具變量(single nucleotide polymorphism,SNP)與暴露因素腸道菌群強相關(guān)聯(lián)。② 工具變量SNP與結(jié)局變量NAFLD之間和其他混雜因素沒有關(guān)聯(lián),即排除如肥胖、體重指數(shù)(body mass index,BMI)、自身免疫性疾病等混雜因素。③ 工具變量SNP僅通過影響暴露因素腸道微生物對結(jié)局變量NAFLD產(chǎn)生影響,不能通過其他途徑對NAFLD造成影響。F統(tǒng)計量一般用于評估工具變量與暴露之間的相關(guān)性強度。F統(tǒng)計量的計算公式為：

F應(yīng)>10,如果F<10,則說明工具變量與暴露之間的關(guān)聯(lián)較弱。

1.4 工具變量選擇與腸道微生物組明顯相關(guān)的SNPs作為工具變量,參照千個全基因組項目的全基因組信息,將全基因組統(tǒng)計顯著性閾值參數(shù)設(shè)置為P<5×10-8。將連鎖不平衡參數(shù)設(shè)置為r2<0.001,聚集距離=10 000 kb,從腸道微生物數(shù)據(jù)中挑選出無連鎖效應(yīng)的SNP,再從已選出的SNP中剔除與NAFLD有意義的SNP(P<0.05),系統(tǒng)收集SNPs的主要信息,包括效應(yīng)等位基因、其他等位基因、β、SE和P值,用于進(jìn)一步分析[5]。

1.5 孟德爾隨機化分析孟德爾隨機化方法是一種基于遺傳變異的隨機化方法,用于評估因果關(guān)系。它利用自然界中存在的基因變異,將個體分為不同的基因型,從而模擬隨機化試驗的效果,以評估某個因素對某種疾病的影響是否具有因果性。這種方法可以避免傳統(tǒng)流行病學(xué)研究中的混雜因素和反向因果關(guān)系,從而提高因果推斷的可信度。常使用包括逆方差加權(quán)(inverse-variance weighted,IVW)、MR-Egger、加權(quán)中位數(shù)法(weighted median, WM)、Simple Mode法、Weighted Mode法在內(nèi)的高效統(tǒng)計方法來推斷人類腸道微生物組對NAFLD風(fēng)險是否存在因果效應(yīng)。使用IVW方法作為主要分析,因為它提供了最精確的效應(yīng)估計,幾乎所有MR分析都將其作為主要分析。采用MR-Egger回歸檢驗潛在的水平多效性,如果截距的P<0.05,則可能存在SNP的水平多效性。MR-PRESSO檢測多效性偏差的異常值并糾正水平多效性。此外,Cochran的Q統(tǒng)計量用于量化所選SNP之間的異質(zhì)性。為確定是否存在潛在的強影響SNP,采用留一敏感度分析法驗證因果效應(yīng)估計的可靠性和穩(wěn)定性。使用R軟件(版本4.0.2,TwoSampleMR、MR-PRESSO包)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 孟德爾隨機化分析結(jié)果IVW分析結(jié)果表明,丙型變形菌綱(OR=0.621,95%CI=0.412～0.934,P=0.022)、普氏菌屬7(OR=0.834,95%CI=0.714～0.974,P=0.021)、脫硫弧菌目(OR=0.714,95%CI=0.519～0.982,P=0.038)3種腸道細(xì)菌性狀與NAFLD風(fēng)險負(fù)相關(guān)。腸桿菌科(OR=1.481,95%CI=1.069～2.053,P=0.018)、毛螺菌科(OR=1.405,95%CI=1.036～1.904,P=0.029)、普氏菌屬9(OR=1.251,95%CI=1.025～1.527,P=0.027)、腸桿菌目(OR=1.481,95%CI=1.069～2.053,P=0.018)4種腸道細(xì)菌性狀與NAFLD風(fēng)險正相關(guān)。并且篩選出來SNP的F均>10,說明工具變量與暴露之間存在較強的關(guān)聯(lián)?？紤]到NAFLD易受生活方式、飲酒的影響,本實驗使用PhenoScanner查詢了陽性結(jié)果的SNP,并排除了與上述混雜因素相關(guān)的SNP。詳見表2。IVW結(jié)果森林圖見圖1。

圖1 IVW結(jié)果森林圖

表2 孟德爾隨機化分析主要結(jié)果

2.2 敏感性分析Cochran Q檢驗結(jié)果顯示7種腸道細(xì)菌性狀Cochran Q檢驗P均>0.05,提示SNP間不存在異質(zhì)性;多效性分析MR-Egger結(jié)果顯示7種腸道細(xì)菌性狀的P值均>0.05,因此,以上腸道細(xì)菌性狀不存在多效性水平的情況。本研究的敏感性分析采用Leave-one-out檢驗并繪制圖,留一圖表明在去除其中任何一個SNP,剩下的SNPs均在無效線的同一側(cè),去掉任何一個SNP后對結(jié)果產(chǎn)生的影響均較小,則提示該MR研究結(jié)果比較穩(wěn)健。散點圖則提示7種腸道菌群不同的統(tǒng)計方法的趨勢基本一致,說明其偏差較小。漏斗圖顯示IVW左右兩邊的點大致對稱,說明發(fā)病偏移較小。敏感性分析見表3,留一圖見圖2,散點圖見圖3,漏斗圖見圖4。

圖2 兩樣本MR結(jié)果留一圖

圖3 兩樣本MR結(jié)果散點圖

圖4 兩樣本MR結(jié)果漏斗圖

表3 敏感性分析

3 討論

本研究采用兩樣本孟德爾隨機化方法對211種腸道細(xì)菌性狀與NAFLD的GWAS數(shù)據(jù)進(jìn)行因果關(guān)聯(lián)分析,共確定了7種細(xì)菌性狀與NAFLD存在因果關(guān)系,其中丙型變形菌綱、普氏菌屬7、脫硫弧菌目3種細(xì)菌性狀與NAFLD的風(fēng)險成負(fù)相關(guān),腸桿菌科、毛螺菌科、普氏菌屬9、腸桿菌目4種腸道細(xì)菌性狀是NAFLD發(fā)病的風(fēng)險因素。

人類身體的胃腸道黏膜表面被數(shù)以萬計的腸道微生物所定植,這些腸道微生物組參與宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和維持。因腸道微生物群的差異,涉及了免疫、能量、脂質(zhì)和葡萄糖代謝等多種途徑,并參與了全身多種疾病的發(fā)生。近年來腸道微生物組在NAFLD中得到了廣泛的研究,有證據(jù)[6]表明,腸道微生物組-肝臟軸在NAFLD中發(fā)生作用,尤其是在纖維化和進(jìn)展到晚期的疾病階段,并且該研究證明腸道微生物組中腸桿菌科的改變會影響NAFLD疾病的發(fā)展。

丙型變形菌綱是腸道微生物主要類之一,丙型變形菌綱與NAFLD等疾病有關(guān)[7],并且在NAFLD中丙型變形菌綱豐度增加。普氏菌屬是常見且豐富的專性厭氧菌,該屬的成員屬于胃腸道和呼吸道的微生物群落,并與糖尿病、心血管疾病和NAFLD等疾病高度相關(guān),其共同特征是低度全身炎癥[8]。在非糖尿病隊列中[9],普氏菌屬豐度增加可能與胰島素抵抗有關(guān)。有研究[7]指出,患有NAFLD的兒童攜帶的普氏菌屬豐度較健康兒童高。并且使用富含普氏菌屬的生態(tài)失調(diào)微生物群從具有缺陷的炎癥小體途徑的小鼠轉(zhuǎn)移到野生型小鼠中,研究富含普氏菌屬的生態(tài)失調(diào)在NAFLD和肥胖中的作用,且該菌還加劇了蛋氨酸膽堿缺乏型飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎,使肝臟脂肪變性和炎癥增加以及肝功異常[10]。而另一項研究[11]則提示普氏菌屬豐度水平的降低可能對患有NAFLD的成年人有害,但毛螺菌科水平升高可能是NAFLD疾病進(jìn)展的主要因素。腸道微生物中腸桿菌科是變形桿菌門的重要成員,該菌群包括許多已知在哺乳動物的大腸和小腸中定植,并且在NAFLD及結(jié)直腸癌中該細(xì)菌水平升高[12]。脫硫弧菌目菌多與神經(jīng)類疾病[13]、消化系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[14]。而在NAFLD疾病中脫硫弧菌目菌與瘦的NAFLD患者成負(fù)相關(guān),與肥胖NAFLD患者呈正相關(guān),兩者表現(xiàn)出相反的趨勢,但與總NAFLD呈負(fù)相關(guān)[15]。這說明腸道微生物群與疾病的發(fā)生密切相關(guān),尤其是腸內(nèi)外疾病,但其對腸內(nèi)外疾病產(chǎn)生有益或有害作用的機制仍有待進(jìn)一步研究。

雖然本研究分析了腸道微生物群,但腸道微生物群太大且異質(zhì),因此數(shù)據(jù)有限;其次,本研究雖然單獨分析了腸道微生物群與NAFLD之間的遺傳因果關(guān)系,但未進(jìn)一步探索腸道微生物與NAFLD之間的生物學(xué)關(guān)系。