GNB4和Riplet基因甲基化檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的價(jià)值研究

楊玉萍,徐恩君,汪軒軒,唐宜桂,鄭美娟,王 悅,儲(chǔ)夢(mèng)真,徐家丹,王中新

原發(fā)性肝癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,是慢性肝臟疾病患者最常見(jiàn)的死因,病死率居惡性腫瘤第三位[1]。診斷原發(fā)性肝癌目前已經(jīng)確認(rèn)的一些血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物的敏感度和特異度有限,如一些肝臟良性疾病、生殖腺胚胎源性腫瘤和轉(zhuǎn)移性肝癌等也表現(xiàn)出甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)升高,部分肝癌患者AFP濃度始終保持低水平狀態(tài)[2]。有研究[3-4]表明在癌癥患者外周血的循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)中可以找到由各種類型癌癥引起的DNA碎裂產(chǎn)物,是一種可以通過(guò)檢查人體血漿中的cfDNA來(lái)鑒別正常人還是潛在危險(xiǎn)人群的方法。腫瘤相關(guān)基因發(fā)生甲基化修飾是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的早期事件[5],GNB4即鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β4亞基,是異源三聚體G蛋白的關(guān)鍵亞基,在許多種類的惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,如尿路上皮癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、胃癌等[6-9],研究[10]報(bào)道證實(shí)該基因的甲基化與肝癌的發(fā)生高度相關(guān)。Riplet是一個(gè)泛素連接酶,研究[11]表明Riplet促進(jìn)維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ介導(dǎo)的干擾素β啟動(dòng)子激活,抑制負(fù)鏈RNA病毒的增殖,該基因的甲基化作為診斷肝細(xì)胞癌的分子標(biāo)志物也有相關(guān)報(bào)道[12-13]。該研究通過(guò)對(duì)人外周血血漿cfDNA中GNB4和Riplet基因甲基化以及血清AFP的檢測(cè),探討AFP、GNB4和Riplet基因甲基化單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的診斷效能和臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2022年12月至2023年8月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的313例患者作為研究對(duì)象。78例原發(fā)性肝癌患者,其中男性62例,女性16例,年齡19～84(61.47±12.24)歲。157例良性肝臟疾病患者,其中男性89例,女性68例,年齡20～78(43.96±12.21)歲,包含肝硬化30例,乙型肝炎87例,丙型肝炎4例,自身免疫性肝炎2例,膽汁淤積性肝炎1例,脂肪肝7例,其他良性肝病(肝血管瘤、肝囊腫等)26例。41例其他消化系統(tǒng)腫瘤患者,其中男性27例,女性14例,年齡37～86(66.10±10.83)歲,包含胃部惡性腫瘤19例,結(jié)直腸惡性腫瘤14例,胰腺惡性腫瘤4例,膽管惡性腫瘤4例。17例非消化系統(tǒng)腫瘤患者,其中男性13例,女性4例,年齡42～82(67.53±12.10)歲,包含腎惡性腫瘤8例,前列腺惡性腫瘤8例,尿路上皮癌1例。20例原發(fā)性肝癌術(shù)后患者。采用甲基化熒光定量PCR(quantitative methylation-specific PCR,qMSP)法檢測(cè)所有患者血漿中GNB4和Riplet基因甲基化水平,直接化學(xué)發(fā)光法(雙抗體夾心法)檢測(cè)血清AFP水平。本項(xiàng)研究已通過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核與授權(quán)(YJ2022-09-06),所有參與者均簽署了知情同意書(shū)。

1.1.1入選標(biāo)準(zhǔn) ① 符合《原發(fā)性肝癌診療指南(2022年版)》[14]臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的原發(fā)性肝癌患者。② 干擾患者：良性肝臟疾病患者,包括肝硬化、肝炎、脂肪肝、肝腺瘤、肝囊腫等;未經(jīng)治療的其他消化系統(tǒng)腫瘤患者,包括食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、膽囊/管癌、胃癌等;未經(jīng)治療的非消化系統(tǒng)腫瘤患者,包括肺癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、尿路上皮癌、宮頸癌等。③ 行肝切除、移植的肝癌術(shù)后患者且有術(shù)前評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) ① 無(wú)術(shù)前評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)的肝癌術(shù)后患者和已接受放/化療等治療患者;② 肝癌合并患有其他惡性腫瘤;③ 未按要求保存或溶血的樣本;④ 術(shù)前術(shù)后對(duì)照研究有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌術(shù)后患者。

1.2 方法

1.2.1樣本的采集、制備和保存 用含EDTA抗凝劑的采血管采集不少于10 ml的全血,顛倒8～10次混勻后立刻分離成血漿。不應(yīng)放置在室溫超過(guò)3 h或在2～8 ℃超過(guò)8 h,不可冷凍全血。以離心力 3 500 r/min離心10 min后提取血漿,放入15 ml的離心管內(nèi)再次離心10 min(3 500 r/min),將血漿轉(zhuǎn)入新的15 ml離心管內(nèi)。血漿樣本可被儲(chǔ)存在2～8 ℃最多18 h,在-25～-15 ℃可穩(wěn)定28 d,在(-80±5) ℃可儲(chǔ)存12個(gè)月。選擇無(wú)抗凝劑的干燥管采集2～3 ml全血,離心5 min(轉(zhuǎn)速3 500 r/min)獲取血清檢測(cè)AFP。室溫可儲(chǔ)存8 h,2～8 ℃可保存48 h,若48 h不能完成檢測(cè)則將標(biāo)本冷凍于-20℃。

1.2.2樣本的處理 ① 核酸提?。喝? ml血漿,使用核酸提取試劑進(jìn)行核酸提取,獲取cfDNA。② 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化及純化：取獲得的核酸提取液35 μl,使用核酸純化試劑進(jìn)行快速亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,并將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行純化。獲得的純化液即可用于GNB4和Riplet基因甲基化檢測(cè)。③ PCR擴(kuò)增：根據(jù)需擴(kuò)增的樣本數(shù)量配置PCR反應(yīng)液并按10 μl/管分裝至反應(yīng)管中/板中,然后依次加入處理好的陰性對(duì)照、樣本核酸轉(zhuǎn)化液和陽(yáng)性對(duì)照各40 μl。加樣并蓋好管蓋或封膜,短暫離心30 s(2500 r/min)后,立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果的讀取 利用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀獲取數(shù)據(jù)。通過(guò)Atellica IM全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)血清中的AFP進(jìn)行精確測(cè)量。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)本實(shí)驗(yàn)使用GNB4和Riplet基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法),由武漢艾米森生命科技有限公司提供。該試劑盒能夠在體外對(duì)人的外周血血漿cfDNA中的GNB4和Riplet基因進(jìn)行甲基化定性分析。根據(jù)說(shuō)明書(shū),待測(cè)樣本內(nèi)控基因ACTB Ct值≤35(VIC通道)則樣本有效,否則判定樣本無(wú)效。陰性對(duì)照應(yīng)符合ACTB(VIC通道)、GNB4(FAM通道)、Riplet(ROX通道)Ct值>43或Unde(無(wú)擴(kuò)增);陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)符合ACTB(VIC通道)、GNB4(FAM通道)、Riplet(ROX通道)Ct值≤33。陰陽(yáng)性對(duì)照和內(nèi)控合格后,對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定：Ct值≤43(FAM通道),且呈S型擴(kuò)增曲線趨勢(shì),GNB4甲基化陽(yáng)性;Ct值≤43(ROX通道),且呈S型擴(kuò)增曲線,Riplet甲基化陽(yáng)性;Ct值>43或Unde(無(wú)擴(kuò)增)為陰性。聯(lián)合檢測(cè)采用平行聯(lián)合診斷法,當(dāng)有一個(gè)檢測(cè)結(jié)果判定為陽(yáng)性則診斷為陽(yáng)性。

根據(jù)目前國(guó)際上普遍接受的臨界值20 ng/ml,AFP<20 ng/ml為AFP陰性組,而20≤AFP<200 ng/ml為AFP低水平組,若AFP≥200 ng/ml為AFP高水平組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPASS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用χ2檢驗(yàn),方差檢驗(yàn),二元logistics回歸分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各分組基因甲基化檢測(cè)結(jié)果不同分組基因甲基化的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1,GNB4和Riplet基因的甲基化陽(yáng)性率在原發(fā)性肝癌組中顯著超過(guò)了其他各個(gè)分組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 GNB4和Riplet在不同分組陽(yáng)性率的比較

2.2 各分組年齡、性別、AFP結(jié)果的分布情況腫瘤組患者的平均年齡高于肝良性疾病組,且男性患者比例也高于肝良性疾病組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。78例肝癌患者中AFP<20 ng/ml有33例(42.31%),而在157例肝良性疾病中AFP≥200 ng/ml有3例(1.91%),在17例非消化系統(tǒng)腫瘤患者中AFP≥200 ng/ml有1例(5.88%),各組具體分布情況見(jiàn)表2。

2.3GNB4和Riplet基因甲基化水平在不同AFP濃度中的表達(dá)情況78例原發(fā)性肝癌患者GNB4和Riplet基因甲基化的表達(dá)水平在不同血清AFP濃度的情況,見(jiàn)表3。GNB4和Riplet基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)時(shí)在3個(gè)分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.103>0.05)。

表3 GNB4和Riplet基因甲基化水平在不同 AFP 濃度分組中表達(dá)情況

2.4 AFP、GNB4基因甲基化、Riplet基因甲基化單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌中的診斷效能評(píng)價(jià)

表4 各指標(biāo)診斷肝癌多因素回歸分析結(jié)果

2.4.2構(gòu)建原發(fā)性肝癌的診斷模型并繪制ROC曲線 根據(jù)GNB4基因甲基化水平、Riplet基因甲基化水平、性別、年齡及血清AFP這些指標(biāo)創(chuàng)建6個(gè)診斷模型,見(jiàn)表5,且繪制ROC曲線,見(jiàn)圖1。其中 AFP 診斷模型曲線下面積AUC為0.775(95%CI0.706～0.844),靈敏度為51.3%,特異度為94.3%。GNB4基因甲基化診斷模型ROC曲線下面積AUC為 0.912(95%CI0.862～0.962),靈敏度為83.3%,特異度為99.4%。Riplet基因甲基化診斷模型曲線下面積AUC為0.860(95%CI0.799～0.921),靈敏度為73.1%,特異度為99.4%。GNB4和Riplet基因甲基化聯(lián)合診斷模型曲線下面積AUC為0.958(95%CI0.923～0.998),靈敏度為92.3%,特異度為98.7%。AFP、GNB4和Riplet基因甲基化三者聯(lián)合診斷模型曲線下面積AUC為0.956(95%CI0.917～0.994),靈敏度為92.3%,特異度為98.7%,當(dāng)加入年齡與性別這兩個(gè)因素后的聯(lián)合診斷模型 AUC為0.989(95%CI0.979～1.000),靈敏度為93.6%,特異度為97.5%。各模型曲線下面積結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 不同診斷模式ROC曲線分析

表5 不同診斷模式對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷效能評(píng)價(jià)

3 討論

GNB4基因編碼異源三聚體鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)的β亞基,其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用[9],Riplet基因又稱RNF135基因,作為E3泛素連接酶的作用,通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞中的Th1和CTLs來(lái)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[11],兩者甲基化均可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究中原發(fā)性肝癌GNB4基因甲基化陽(yáng)性率為82.05%,明顯高于肝良性疾病組的0.63%、其他消化系統(tǒng)腫瘤組的31.71%、其余組別的0%,同時(shí)肝癌組Riplet基因甲基化陽(yáng)性率為71.79%,明顯高于其他消化系統(tǒng)腫瘤組的2.44%和其他分組的0%,顯示相比于肝良性疾病和其他腫瘤患者,肝癌患者外周血液中有GNB4基因甲基化和Riplet基因甲基化的存在且水平明顯較高,與相關(guān)研究[15]相符,將GNB4和Riplet基因甲基化聯(lián)合檢測(cè),在原發(fā)性肝癌組的陽(yáng)性率達(dá)到92.31%,高于GNB4基因甲基化和Riplet基因甲基化單獨(dú)檢測(cè),提高了對(duì)肝癌患者的診斷效能。

血清AFP是診斷肝癌與療效監(jiān)測(cè)常用且重要的腫瘤標(biāo)志物,但其敏感度較低,在部分肝癌中呈現(xiàn)低水平,尤其在腫瘤直徑小于2 cm的早期微小肝癌患者中。分析本研究中各分組AFP水平,在原發(fā)性肝癌組中AFP<20 ng/ml占42.31%,20≤AFP<200 ng/ml占25.64%,而在肝良性疾病中20≤AFP<200 ng/ml有10.19%,AFP≥200 ng/ml有1.91%,顯示在原發(fā)性肝癌中仍有相當(dāng)一部分患者血清AFP呈現(xiàn)低水平,甚至陰性,一些良性肝病、其他惡性腫瘤中也表現(xiàn)出 AFP 升高,AFP靈敏度和特異度存在局限性,與相關(guān)研究[2]基本一致。當(dāng)前研究將其它不同的腫瘤指標(biāo)與AFP聯(lián)合檢測(cè)以提高診斷的敏感度。

為進(jìn)一步探討GNB4基因甲基化和Riplet基因甲基化在肝癌診斷中的應(yīng)用,將78例原發(fā)性肝癌患者作為實(shí)驗(yàn)組,157例肝良性疾病患者作為對(duì)照組,以進(jìn)行更深層次的分析。對(duì)兩組年齡和性別進(jìn)行比較,肝癌患者的平均年齡大于肝良性疾病患者,肝癌患者男性占比高于肝良性疾病患者,與文獻(xiàn)[2]報(bào)道一致,這可能與男性性激素和x相關(guān)的遺傳因素有關(guān)[2]。通過(guò)多因素回歸分析,年齡、性別、GNB4基因甲基化、Riplet基因甲基化均與肝癌的發(fā)生顯著相關(guān)。關(guān)于GNB4和Riplet基因甲基化水平在不同AFP濃度中的表達(dá)情況的分析顯示：GNB4和Riplet基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)在不同AFP濃度中的表達(dá)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.103),顯示在AFP低水平和AFP陰性的肝癌患者中仍有較好的診斷效能,同時(shí)該結(jié)果也證實(shí)了無(wú)論血清AFP的表達(dá)情況如何,都可以采用GNB4和Riplet基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行篩查,這為肝癌的診斷提供了更多的參考指標(biāo)。最后,本研究將GNB4基因甲基化水平、Riplet基因甲基化水平、年齡、性別以及血清AFP指標(biāo)建立6個(gè)診斷模型繪制了ROC曲線。結(jié)果顯示,對(duì)于原發(fā)性肝癌的診斷,GNB4和Riplet基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)診斷的靈敏度顯著高于單獨(dú)AFP,也高于GNB4和Riplet基因甲基化單獨(dú)診斷的靈敏度;同時(shí),GNB4基因甲基化診斷的靈敏度較Riplet基因甲基化高。聯(lián)合年齡、性別、AFP、GNB4和Riplet基因甲基化的診斷靈敏度最高,達(dá)到93.6%。各檢測(cè)指標(biāo)及組合診斷模型中,AFP的特異度94.3%相對(duì)稍低一點(diǎn),其余特異度均較高,且基本無(wú)差異。

本研究因時(shí)間有限,納入研究的原發(fā)性肝癌患者數(shù)量不夠多,其他納入研究的惡性腫瘤種類及患者數(shù)量均有限,存在一定局限,后續(xù)可擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)于原發(fā)性肝癌術(shù)后患者,本研究在手術(shù)3 d后采集患者血液,未能做到術(shù)后連續(xù)監(jiān)測(cè)AFP、GNB4和Riplet基因甲基化水平的變化,且因樣本量較少未做更多研究和探討,后續(xù)可進(jìn)一步做補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。