微小RNA-26a通過抑制鐵死亡減少高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成

李星月,喬云陽,鄭 輝,季嘉玲,張愛青

糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最常見的并發(fā)癥,也是終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因。腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)是腎臟損傷后主要的纖維化效應(yīng)細(xì)胞之一,包括腎小管間質(zhì)纖維化(tubular interstitial fibrosis, TIF)以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)合成,ECM的過度沉積是DKD病理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度為21～23個核苷酸的單鏈非編碼RNA,參與RNA沉默和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[2]。前期研究證實了微小RNA-26a(microRNA-26a,miR-26a)對DKD中的TIF具有緩解作用,揭示了miR-26a在DKD中的潛在機制,但其作用方式尚不完全明確。鐵死亡是一種鐵依賴性的程序性細(xì)胞死亡方式,以鐵的過量蓄積和脂質(zhì)過氧化為特征[3]。在腎臟病領(lǐng)域,有研究[4]顯示miR-20a通過靶向ACSL4依賴性鐵死亡從而緩解腎臟缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)。鐵死亡與非編碼RNA的相互作用關(guān)系提供了一個新的角度。該研究通過高糖(high-glucose,HG)誘導(dǎo)RTECs以構(gòu)建體外DKD模型,探討miR-26a在HG誘導(dǎo)的RTECs中ECM合成的作用機制,為DKD的臨床治療策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系本實驗所用的小鼠RTECs由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎臟病中心饋贈。

1.2 主要試劑和儀器細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM及胎牛血清購自美國Gibco公司;葡萄糖購自廣州賽國生物科技有限公司;miR-26a mimics購自上海吉瑪有限公司;細(xì)胞ROS檢測試劑盒、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;GPX4抗體(貨號：ab125066)、溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)抗體(貨號：ab175186)、fibronectin抗體(貨號：ab2413)、collagen Ⅰ(貨號：ab34710)抗體均購自美國Abcam公司,?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family 4,ACSL4)抗體(貨號：sc-365230)購自美國Santa Cruz公司,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor-1,TFR-1)抗體(貨號：AF5343)、β-actin抗體(貨號：AF7018)購自美國Affinity公司;增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液購自北京蘭杰柯科技有限公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國默克密理博有限公司;TRIzol購自美國Invitrogen公司。

1.3 實驗方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將RTECs接種于6孔板,鏡下觀察細(xì)胞生長到密度為30%～50%時,依實驗需要處理細(xì)胞。細(xì)胞分組如下：①對照(Control)組：以正常糖濃度(5.5 mmol/L)培養(yǎng)細(xì)胞;②HG組：以HG培養(yǎng)細(xì)胞,其中葡萄糖終濃度為30 mmol/L;③HG+miR-26a組：在HG誘導(dǎo)的RTECs中通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法過表達(dá)miR-26a;④HG+miR-NC組：在HG誘導(dǎo)的RTECs中轉(zhuǎn)染miR-26a mimic的陰性對照(negative control,NC);⑤HG+鐵死亡抑制劑 (ferrostatin-1, Fer-1)組：細(xì)胞在HG誘導(dǎo)同時添加Fer-1(溶于0.1%DMSO);⑥HG+DMSO組：細(xì)胞在HG誘導(dǎo)同時添加0.1%DMSO。以上各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集并用于后續(xù)實驗。

1.3.2miR-26a過表達(dá)轉(zhuǎn)染 將RTECs接種于6孔板,鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)到50%時,按照riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時棄去舊培養(yǎng)基,用PBS洗2次,每孔加入1 866 μl培養(yǎng)基。用120 μl riboFECTTMCP Buffer稀釋2 μl、20 μmol/L miR-26a mimic(正向序列：UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU;反向序列：CCUAUCCUGGAUUACUUGAAUU)或mimic NC(正向序列：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT;反向序列：ACGUGACACGUUCGGAGAATT),混勻后室溫孵育5 min,隨后加入3 μl轉(zhuǎn)染Reagent,室溫孵育15 min后形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物,以134 μl/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3.3實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR) 使用TRIzol提取細(xì)胞內(nèi)總的RNA,隨后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,檢測各組細(xì)胞中mRNA和miRNA表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計算各組細(xì)胞中mRNA相對表達(dá)水平;以U6作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計算各組細(xì)胞中miR-26a相對表達(dá)水平。本研究所用的mRNA引物均購自上海捷瑞生物工程有限公司,miR-26a及其陰性對照引物購自上海吉瑪有限公司,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.4Western blot 使用RIPA裂解液收集細(xì)胞并于冰上裂解1 h,在4℃、12 000 r/min條件下離心30 min,取上清液,使用BCA法測定蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液并于沸水中煮沸5 min,-80℃冰箱保存樣品。加載制備好的蛋白樣品并經(jīng)過SDS-PAGE電泳,分離后的蛋白凝膠通過400 mA恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,使用TBST和脫脂奶粉按照20 ∶1配置封閉液,在室溫下將PVDF膜封閉2 h,隨后加入配置好的collagen Ⅰ、fibronectin、TFR-1、ACSL4、SLC7A11和GPX4抗體(1 ∶1 000),于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。次日,TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1 ∶2 000),室溫下將PVDF膜孵育2 h,再次洗膜,加入ECL顯色液顯影并于凝膠成像儀曝光。Image J軟件分析光密度值,以β-actin為內(nèi)部參照計算目的蛋白表達(dá)量。

1.3.5細(xì)胞ROS水平檢測 采用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行RTECs中ROS水平檢測。具體操作按照ROS檢測試劑盒進(jìn)行。按1 ∶3 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,去除細(xì)胞培養(yǎng)液,加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻,使探針和細(xì)胞充分接觸,用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA,使用熒光顯微鏡觀察,ROS水平與熒光強度成正比。

2 結(jié)果

2.1 miR-26a在HG誘導(dǎo)的RTECs中的表達(dá)水平通過RT-qPCR和Western blot檢測HG誘導(dǎo)的RTECs中ECM合成相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示fibronectin和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)量較對照組升高(圖1B、C),提示DKD細(xì)胞模型構(gòu)建成功,同時使用RT-qPCR方法檢測miR-26a的表達(dá)量,結(jié)果顯示與Control組相比,HG組miR-26a表達(dá)量降低(圖1A)。

圖1 miR-26a在HG誘導(dǎo)的RTECs中的表達(dá)水平

2.2 過表達(dá)miR-26a對RTECs中ECM合成的影響為了探究miR-26a對HG誘導(dǎo)的RTECs中ECM合成的影響,在HG誘導(dǎo)的RTECs中過表達(dá)miR-26a,通過RT-qPCR驗證過表達(dá)效果(圖2A),同時檢測ECM合成相關(guān)指標(biāo)fibronectin和collagen Ⅰ表達(dá)水平。RT-qPCR結(jié)果顯示,與HG組相比,HG+miR-26a組細(xì)胞中miR-26a表達(dá)上調(diào),提示miR-26a過表達(dá)成功(圖2A)。在ECM合成方面,RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,與HG組比較,HG+miR-26a組fibronectin和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降,HG+miR-NC組細(xì)胞中表達(dá)水平無明顯差異(圖2B、C)。

圖2 過表達(dá)miR-26a對RTECs中ECM合成的影響

2.3 抑制鐵死亡對RTECs中ECM合成的影響為明確鐵死亡對HG處理的RTECs中ECM合成的影響,使用鐵死亡抑制劑Fer-1處理RTECs。使用RT-qPCR和Western blot檢測鐵死亡相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平以明確Fer-1對鐵死亡的抑制效果。結(jié)果顯示,與Control組相比,HG組細(xì)胞中SLC7A11和GPX4表達(dá)降低, TFR-1和ACSL4表達(dá)升高(圖3A、B),提示DKD模型中鐵死亡的發(fā)生;與HG組相比,HG+DMSO處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示Fer-1溶劑對細(xì)胞無明顯毒性,HG+Fer-1組鐵死亡相關(guān)指標(biāo)表達(dá)量改變(圖3A、B)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步檢測RTECs中ECM合成相關(guān)指標(biāo)fibronectin和collagen Ⅰ的表達(dá)水平。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,與HG組相比,HG+Fer-1組ECM合成相關(guān)指標(biāo)表達(dá)量降低(圖3C、D)。

圖3 抑制鐵死亡對RTECs中ECM合成的影響

2.4 過表達(dá)miR-26a對RTECs鐵死亡的影響上述實驗中,過表達(dá)miR-26a和抑制鐵死亡有著減少ECM合成這一共同作用,課題組提出miR-26a抑制鐵死亡進(jìn)而減少了HG誘導(dǎo)的RTECs中ECM合成,為了驗證這一假設(shè),在轉(zhuǎn)染了miR-26a的RTECs中通過RT-qPCR和Western blot檢測鐵死亡相關(guān)指標(biāo)TFR-1、ACSL4、SLC7A11和GPX4表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與HG組相比,HG+miR-26a組SLC7A11和GPX4表達(dá)升高,TFR-1和ACSL4表達(dá)降低,HG+miR-NC組相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A、B),HG+miR-26a組ROS熒光強度的降低同樣提示了miR-26a對鐵死亡的抑制作用(圖4C)。

圖4 過表達(dá)miR-26a對RTECs鐵死亡的影響

3 討論

TIF被廣泛認(rèn)為是DKD進(jìn)展至ESRD的必經(jīng)途徑。RTECs是腎小管結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,缺血、感染和中毒可引起RTECs變性和壞死,從而導(dǎo)致腎功能障礙[5]。在所有腎細(xì)胞中,RTECs是啟動和介導(dǎo)腎纖維化的主要細(xì)胞。因此,保護(hù)RTECs免受損傷對于預(yù)防DKD的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。

越來越多的研究表明,miR-26a與各種器官的纖維化過程有關(guān)。例如,miR-26a在過敏性哮喘小鼠模型中被證明可以通過調(diào)節(jié)靶基因影響支氣管組織肺纖維化,從而影響哮喘小鼠的氣道重塑[6]。另一項研究[7]表明過表達(dá)miR-26a不僅可以有效減輕鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型的心肌纖維化,而且在體外能抑制HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。此外,miR-26a可以緩解特發(fā)性肺纖維化,并且抑制小鼠晶狀體纖維化[8]。有研究[9]結(jié)果表明在心肌細(xì)胞中過表達(dá)miR-26a可以緩解慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)中發(fā)生的尿毒癥性心肌病。在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)小鼠模型中,miR-26a可靶向結(jié)締組織生長因子,抑制CKD腎臟纖維化[10]。本研究中,HG誘導(dǎo)的RTECs中miR-26a表達(dá)降低,HG誘導(dǎo)RTECs中ECM合成;相比之下,過表達(dá)miR-26a顯著抑制ECM合成。這與課題組前期研究miR-26a可以抑制DKD中TIF結(jié)果相一致。這些結(jié)果表明,miR-26a可能在緩解RTECs中ECM合成發(fā)揮重要作用。

鐵死亡主要特征是鐵超載和細(xì)胞內(nèi)ROS的持續(xù)積累,是一種由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化作用介導(dǎo)的新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡[3]。SLC7A11和GPX4被認(rèn)為是鐵死亡的重要標(biāo)志物,是細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分,缺乏它們可能導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生和GSH合成障礙[11-12],TFR-1參與細(xì)胞內(nèi)鐵代謝,鐵代謝異常是鐵死亡的必要過程[13],ACSL4是調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化的關(guān)鍵酶,參與氧化細(xì)胞膜磷脂的合成,從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[14]。本研究顯示,在HG培養(yǎng)的RTECs中,ROS積聚增加,鐵死亡相關(guān)指標(biāo)顯著改變,驗證了鐵死亡的發(fā)生,進(jìn)一步過表達(dá)miR-26a顯著抑制鐵死亡相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平,這提示miR-26a可能參與調(diào)控鐵死亡過程。另有研究[15]表明,在UUO小鼠和IRI小鼠模型中,抑制鐵死亡可以在很大程度上減輕 UUO和 IRI后小鼠的腎損傷、ECM和炎癥細(xì)胞積聚,提示鐵死亡和TIF的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究表明使用鐵死亡抑制劑后,ECM合成減少,過表達(dá)miR-26a后,ECM合成增加,鐵死亡相關(guān)指標(biāo)改變,提示miR-26a可能通過抑制RTECs鐵死亡從而減少HG誘導(dǎo)的ECM合成。

本研究尚有不足之處,miR-26a在鐵死亡中的作用機制或作用靶點仍需進(jìn)一步探討,課題組擬在后續(xù)實驗中補充糖尿病腎病小鼠模型,為DKD臨床診治提供更堅實的理論基礎(chǔ)。