基于Nrf2-HO-1/GPX4信號軸探討中藥靛玉紅衍生物E804抑制肺癌A549細胞增殖和遷移的作用機制

袁育珺,曹華華,趙 敏,羅宇慧,張素梅

肺癌主要有兩種類型：非小細胞肺癌(non-smallcell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌,其中NSCLC約占所有新診斷肺癌的85%[1],是肺癌主要的病理類型。越來越多的臨床研究[2]證實,鐵死亡在NSCLC中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,甚至在一線抗癌藥物中能夠作為一種“催化劑”增強NSCLC的治療療效。鐵死亡是一種新型的非凋亡細胞死亡模式,其特征是鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化和活性氧(reactive oxygen species,ROS)堆積[3]。研究[4-5]表明核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)-血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)/谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)軸參與鐵死亡調(diào)控,與臨床上多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),如腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病、缺血再灌注和心臟相關(guān)疾病等。課題組前期研究顯示,中藥靛玉紅衍生物E804可通過抑制細胞的增殖、遷移和分化等多種機制發(fā)揮抗NSCLC系A(chǔ)549細胞作用,但其抑制肺癌細胞增殖和遷移是否與細胞鐵死亡有關(guān)尚不清楚。所以,該研究探討E804抑制A549細胞增殖和遷移與細胞鐵死亡的關(guān)系,并從Nrf2-HO-1/GPX4信號軸探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器SW-CJ-1F標準型凈化工作臺購自蘇州安泰公司;NBS 150型CO2培養(yǎng)箱購自美國BioTek公司;自動化酶標儀、蛋白提取儀、垂直和水平電泳槽、電泳儀、蛋白凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司;DMI3000B倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 試劑E804購自武漢遠成生物科技有限公司;肺癌A549細胞由實驗室內(nèi)部提供,其基礎(chǔ)營養(yǎng)液(如DMEM和小牛血清)均購自北京索萊寶科技有限公司;細胞壞死抑制劑(necrostatin-1,Nec-1)、細胞自噬抑制劑(chloroquine,CQ)、細胞凋亡抑制劑[Z-Val-Ala-Asp(OMe),Z-VAD]、細胞鐵死亡抑制劑(deferoxamine,DFO)、細胞鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1,Fer-1)和細胞鐵死亡抑制劑(Liproxstatin-1,Lip-1)均購自美國TargetMol公司;DCFH-DA試劑盒購自美國Sigma公司;二價鐵離子(Fe2+)檢測試劑盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒均購自合肥碧云天生物試劑公司;鐵死亡相關(guān)一抗(SLC7A11、GPX4、SLC40A1、Transferrin、Nrf2、HO-1和β-actin)購自美國Santa Cruz公司,分裝后于-70 ℃ 冰箱保存;Western blot相應(yīng)二抗(如：山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG)均購自美國Pierce公司。

1.3 方法

1.3.1MTT法檢測各組細胞增殖率 A549細胞株接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的A549細胞進行下列實驗。細胞隨機分為對照組(0 μmol/L E804)、10 μmol/L E804組和不同抑制劑組(10 μmol/L E804分別加10 μmol/L Nec-1、15 μmol/L CQ、10 μmol/L Z-VAD、10 μmol/L DFO、10 μmol/L Fer-1和1 μmol/L Lip-1)。處理72 h。MTT實驗嚴格參考文獻操作,按如下公式計算細胞增殖率：增殖率%=[對照孔(optical density,OD)570-試驗孔OD570]/對照孔OD570×100%[6],實驗重復(fù)3次。

1.3.2細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力 取對數(shù)期生長的A549細胞,按照“1.3.1”進行分組,具體方法嚴格按照參考文獻[6]。各組細胞于0 h做好標記并拍照,處理72 h后拍照。實驗重復(fù)3次。

1.3.3DCFH-DA檢測各組細胞活性氧ROS水平 取對數(shù)期生長的A549細胞,隨機分為對照組(0 μmol/L E804)、2.5、5和10 μmol/L E804組。處理72 h,室溫下各組加10 μmol/L DCFH-DA處理10 min,PBS洗滌3次,熒光顯微鏡下觀察并拍照,各組熒光含量用熒光酶標儀進行定量。實驗重復(fù)3次。

1.3.4試劑盒檢測各組細胞中Fe2+、MDA和GSH水平 取對數(shù)期生長的A549細胞,按照“1.3.3”進行分組。用Fe2+檢測試劑盒(比色法)、MDA檢測試劑盒(分光光度法)和GSH檢測試劑盒(微量法)分別檢測各組細胞中的Fe2+、MDA和GSH含量,嚴格按照相應(yīng)說明書操作。

1.3.5Western blot檢測各組細胞中蛋白表達水平 取對數(shù)生長的A549細胞,按照“1.3.3”進行批量分組。按參考文獻[6]方法：提取細胞總蛋白、蛋白濃度定量和蛋白加熱變性。每孔上樣30 μg相應(yīng)蛋白樣品,采用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳,將相應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移置PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫下結(jié)合2 h,PBS洗膜3次,分別加入目標蛋白濃度SLC7A11(1 ∶800)、GPX4(1 ∶1 100)、SLC40A1(1 ∶500)、Transferrin(1 ∶800)、β-actin(1 ∶2 000)、Nrf2(1 ∶1 000)和HO-1(1：1 500),置于4 ℃搖床過夜;次日PBS洗膜3次,加入相應(yīng)目標蛋白二抗SLC7A11(1：1 000)、GPX4(1：800)、SLC40A1(1 ∶1 500)、Transferrin(1 ∶1 000)、β-actin (1 ∶2 000)、Nrf2(1 ∶1 500)和HO-1(1 ∶1 000)室溫下孵育2 h,PBS洗膜3次,暗室內(nèi)ECL顯影并拍照,實驗重復(fù)3次。本次實驗采用β-actin作為參照,運用Image Pro 4.5 軟件掃描目標條帶灰度值,根據(jù)灰度值計算目標蛋白表達水平,目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 特異性抑制劑對各組細胞增殖影響本實驗使用特異性抑制劑處理72 h, MTT檢測結(jié)果顯示：與10 μmol/L E804組比較,細胞壞死抑制劑(Nec-1)組和細胞自噬抑制劑(CQ)組對A549細胞的增殖影響較小(P>0.05);而細胞凋亡抑制劑(Z-VAD)組和細胞鐵死亡抑制劑(DFO、Fer-1和Lip-1)組A549細胞的增殖有提升(P<0.01)。見圖 1。

圖1 MTT法檢測各組細胞增殖率

2.2 各組細胞遷移情況本實驗使用特異性抑制劑處理72 h, 細胞劃痕結(jié)果顯示,與10 μmol/L E804組比較,細胞壞死抑制劑(Nec-1)組和細胞自噬抑制劑(CQ)組對A549細胞的遷移影響較小(P>0.05);而細胞凋亡抑制劑(Z-VAD)組和細胞鐵死亡抑制劑(DFO、Fer-1和Lip-1)組A549細胞的遷移距離有提升(P<0.01)。見圖2、3。

圖2 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力(×100)

圖3 各組細胞遷移距離

2.3 各組細胞中ROS水平不同濃度 E804處理A549細胞72 h,熒光染色結(jié)果顯示：與對照組比較,2.5、5和10 μmol/L E804組熒光強度逐漸增強,即各組ROS水平逐漸增強(F=102.3,P<0.01)。見圖4、5。

圖4 E804對A549細胞內(nèi)ROS的影響 ×400

圖5 各組細胞熒光相對含量

2.4 各組細胞中Fe2+、MDA和GSH水平不同濃度E804處理A549細胞72 h,試劑盒檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,2.5、5和10 μmol/L E804組Fe2+和MDA水平逐漸增強(F=71.21、65.02,P<0.01),而GSH水平逐漸減弱(F=76.54,P<0.01)。見圖6。

圖6 E804對A549細胞鐵死亡的影響

2.5 各組細胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達水平不同濃度 E804處理A549細胞72 h,Western blot檢測結(jié)果顯示：與對照組比較,2.5、5和10 μmol/LE804組SLC7A11、GPX4和SLC40A1表達水平逐漸降低(F=25.21、45.13、29.33,P<0.01);而Transferrin表達水平均逐漸升高(F=51.24,P<0.05)。見圖7。

圖7 Western blot法檢測各組細胞鐵死亡相關(guān)蛋白電泳圖(A)和直條圖(B)

2.6 各組細胞Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達水平不同濃度E804處理A549細胞72 h,Western blot檢測結(jié)果顯示：與對照組比較,2.5、5和10 μmol/L E804組Nrf2和HO-1蛋白表達水平逐漸降低(F=34.58、44.71,P<0.01)。見圖8。

圖8 Western blot法檢測各組細胞Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)

3 討論

腫瘤細胞群體是一個高度異質(zhì)性的群體,盡管醫(yī)學(xué)在腫瘤治療領(lǐng)域取得了突破性進展,但腫瘤依然是全球第二大致死因素[7]。對于NSCLC,盡管傳統(tǒng)藥物治療、抗血管生成治療、免疫治療和靶向治療等新興療法都取得了重大突破,但治療仍然存在難點。因此,迫切需要開發(fā)用于肺癌患者的新型藥物。天然產(chǎn)物是藥用化合物的寶庫,也是新型抗腫瘤活性成分的重要資源[8]。本課題組前期研究顯示從傳統(tǒng)中藥靛玉紅中分離的有效成分E804能有效抑制A549細胞的增殖和遷移,是具有開發(fā)前景的天然抗腫瘤藥物。

耐藥性仍舊是腫瘤患者治愈的主要限制因素,目前多數(shù)抗癌藥物主要通過觸發(fā)腫瘤細胞凋亡發(fā)揮作用,然而,腫瘤細胞對凋亡的內(nèi)在性、獲得性抵抗,使治療效果受限[9]。因此,利用其他形式的非凋亡性細胞死亡為腫瘤清除提供新的治療策略,如鐵死亡。鐵死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與凋亡和壞死及自噬不同的程序性細胞死亡方式,特點是細胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧的增加速度超過細胞自身抗氧化系統(tǒng)的代償,繼而誘導(dǎo)細胞發(fā)生死亡[3]。鐵死亡發(fā)生時,分子層面主要表現(xiàn)為：細胞內(nèi)鐵超載、ROS的水平增加、GSH的水平降低以及線粒體發(fā)生特征性變化[10];蛋白層面主要表現(xiàn)為：溶質(zhì)載體家族(如SLC7A11,SLC40A1等)表達降低,GPX4表達降低,Transferrin表達升高,其中GPX4表達降低是鐵死亡中最重要的分子事件[11-12]。本次研究采用不同濃度E804刺激A549細胞,結(jié)果顯示細胞內(nèi)鐵死亡被激活,表現(xiàn)為ROS、Fe2+和MDA水平呈上升趨勢,GSH含量呈下降趨勢;同時,SLC40A1、GPX4和SLC7A11蛋白表達水平呈下降趨勢,Transferrin表達水平呈上升趨勢。進一步的結(jié)果顯示,細胞凋亡抑制劑(Z-VAD)和細胞鐵死亡抑制劑(DFO、Fer-1和Lip-1)均能夠部分逆轉(zhuǎn)E804對細胞的增殖和遷移抑制作用。這些結(jié)果提示,E804誘導(dǎo)A549細胞出現(xiàn)氧化損傷,推測E804對A549細胞的增殖和遷移抑制作用可能與鐵死亡有關(guān)。

鐵死亡是一個嚴謹并且復(fù)雜的過程,受多種轉(zhuǎn)錄因子和通路調(diào)控。Nrf2是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,通過上調(diào)SLC7A11和GPX4抑制細胞鐵死亡,也參與調(diào)節(jié)細胞的GSH合成、鐵代謝和中間代謝物,被認為是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子[13]。HO-1是最典型的誘導(dǎo)型酶,受Nrf2基因調(diào)控。氧化應(yīng)激條件下,轉(zhuǎn)錄因子Nrf2啟動內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)元件,并激活若干下游抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄,如HO-1[14]。最近研究[15]表明,在癌旁組織和腫瘤組織中Nrf2-HO-1/GPX4軸異常激活,高表達于不同類型的人類惡性腫瘤中。Western blot結(jié)果顯示：E804能明顯降低Nrf2、HO-1和GPX4表達水平,抑制A549細胞內(nèi)Nrf2-HO-1/GPX4抗氧化軸,增加脂質(zhì)過氧化和ROS積累,進一步加重細胞鐵死亡。

綜上所述,E804可能通過抑制A549細胞內(nèi)Nrf2-HO-1/GPX4抗氧化軸,下調(diào)SLC7A11、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表達水平,上調(diào)Transferrin蛋白表達水平,使細胞內(nèi)ROS、脂質(zhì)過氧化水平和二價鐵離子濃度升高,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA積累也增多,GSH含量降低,誘導(dǎo)細胞鐵死亡,并且抑制A549細胞增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示E804對A549細胞株具有良好的抗腫瘤活性,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。