基于NOD2介導(dǎo)的AMPK/mTOR信號(hào)通路探討宮頸癌細(xì)胞惡性行為的機(jī)制

杜瑞亭,伍東月,郭清民,靳冬梅

宮頸癌(cervical cancer,CC)是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因,每年估計(jì)有530 000例新病例和270 000例死亡[1]。由于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),CC患者預(yù)后不良,生存率低[2]。因此,尋找CC的分子標(biāo)志物進(jìn)行早期診斷和靶向治療對(duì)于提高生存率至關(guān)重要。模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)是檢測(cè)病原體特異性分子的宿主傳感器,是抵御感染的第一道防線[3]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體2(nucleotide-binding oligomerization domain receptor 2,NOD2)是細(xì)胞上/細(xì)胞中表達(dá)的主要PRRs,能識(shí)別入侵的病原體并介導(dǎo)致癌作用[4-5]。研究[6]證實(shí)NOD2上調(diào)通過(guò)正調(diào)節(jié)人類鱗狀宮頸癌的致瘤性和轉(zhuǎn)移促進(jìn)癌癥進(jìn)展。然而,NOD2在CC中的功能在很大程度上是未知的。自噬是一種溶酶體依賴的分解代謝途徑,通過(guò)該途徑清除受損或衰老的細(xì)胞器[7]。證據(jù)[7]表明,自噬可以增強(qiáng)化療期間癌細(xì)胞的獲得性耐藥性。NOD2作為自噬的誘導(dǎo)因子[8],是否介導(dǎo)CC的病理機(jī)制仍不清楚。該研究探討了NOD2對(duì)CC細(xì)胞生物行為和相關(guān)信號(hào)通路及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)譜交互式分析(GEPIA)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析對(duì)GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//gepia.cancer-pku.cn/)的CC組織中NOD2的相對(duì)mRNA水平進(jìn)行分析,包括306例CC患者和13例非癌患者。對(duì)NOD2的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行Log2轉(zhuǎn)換,將CESC患者分為NOD2高表達(dá)和低表達(dá)兩組,建立總體生存期的Kaplan-Meier生存曲線分析。

1.2 細(xì)胞系與培養(yǎng)人CC細(xì)胞(HeLa、SiHa、CaSki和ME-180)和人宮頸上皮細(xì)胞系Ect1/E6E7來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。Ect1/E6E7細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)中培養(yǎng),HeLa、SiHa、CaSki和ME-180細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成了靶向NOD2(shNOD2)和shRNAs陰性對(duì)照(shNC)。細(xì)胞培養(yǎng)至30%～50%匯合,用siLentFect脂質(zhì)試劑(美國(guó)Bio-Rad公司)轉(zhuǎn)染shRNAs。將NOD2的全長(zhǎng)序列克隆到pcDNA3.1載體(美國(guó)Invitrogen公司)中,構(gòu)建NOD2過(guò)表達(dá)(簡(jiǎn)稱為：NOD2)質(zhì)粒,同時(shí)將空載體用作陰性對(duì)照(Vec)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到大約90%匯合時(shí),用Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。48 h后收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于隨后的實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8增殖試驗(yàn)用CCK-8法(美國(guó)APExBIO公司)測(cè)定CC細(xì)胞的增殖能力。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1 000個(gè)/孔接種到96孔板中,并將10 μl細(xì)胞CCK-8溶液添加到每個(gè)孔中,然后在37 ℃下孵育2 h。用分光光度計(jì)計(jì)算450 nm波長(zhǎng)處的吸光度,共3次。

1.5 集落形成試驗(yàn)收集CC細(xì)胞,將1×103個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中,并在37 ℃下孵育10 d。去除培養(yǎng)基后,用甲醇固定細(xì)胞,并用0.1%結(jié)晶紫染色。然后計(jì)數(shù)并記錄集落數(shù)。

1.6 細(xì)胞遷移和侵襲分析使用Transwell測(cè)定評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲。將轉(zhuǎn)染后的HeLa、SiHa細(xì)胞重懸于不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中并調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/200 μl。然后,將100 μl細(xì)胞懸浮液加入Matrigel基質(zhì)膠包被或未包被的Transwell上室(美國(guó)BD Biosciences公司)中,并將含有10%血清的500 μl培養(yǎng)基加入到下室中。在37 ℃孵育48 h后,Transwell小室用PBS洗滌3次,細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min,然后用結(jié)晶紫染色30 min,用棉簽輕輕去除室上表面的基質(zhì)膠和細(xì)胞。在顯微鏡下計(jì)數(shù)滲入Transwell室膜的腫瘤細(xì)胞數(shù)。

1.7 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)分析將HeLa細(xì)胞或SiHa細(xì)胞接種到6孔板中,培養(yǎng)24 h。加入EdU溶液(瑞士Roche公司),將細(xì)胞培養(yǎng)2 h。用多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,加入甘氨酸溶液5 min。加入DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。將細(xì)胞固定并在熒光顯微鏡下拍照。

1.8 Western blot試驗(yàn)用冷PBS洗滌細(xì)胞,然后在冰上用裂解緩沖液孵育30 min,將細(xì)胞刮下并收獲。離心后,收集含有裂解物的上清液并于-80 ℃下儲(chǔ)存。通過(guò)BCA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品變性,隨后通過(guò)SDS-PAGE分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(瑞士Roche Life Sciences公司)上。在脫脂牛奶中孵育1 h后,使用以下一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)在4 ℃下處理膜過(guò)夜：NOD2、AMPK、p-AMPK(Thr172)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)、LC3、p62和GAPDH(均1 ∶1 000)。洗滌3次后,將膜與山羊抗小鼠或抗兔HRP偶聯(lián)二抗(1 ∶2 000,美國(guó)Cell Signaling Technology公司)一起孵育。通過(guò)ECL檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce Biotechnology公司)檢測(cè)信號(hào)。

1.9 RNA測(cè)序(RNA sequence,RNA-Seq)由上海其明信息技術(shù)有限公司進(jìn)行RNA-Seq分析。提取來(lái)自用shNC和shNOD2轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的總RNA(n=3)。將高質(zhì)量的RNA樣品轉(zhuǎn)化成cDNA文庫(kù)。純化后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)12～15輪的PCR擴(kuò)增,形成最終的cDNA文庫(kù)。然后按照制造商的方案在Illumina Hiseq X Ten上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。倍數(shù)變化>1.5和P<0.05代表差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。

1.10 GFP-mRFP-LC3檢測(cè)自噬體使用GFP-mRFP-LC3慢病毒[和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司]評(píng)估自噬體。然后在LSM710共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)下觀察自噬體的定位和定量。自噬體被標(biāo)記為紅色和綠色(黃色熒光),而自噬溶酶體被標(biāo)記為紅色。

1.11 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)24只雌性BALB/c裸鼠(6～8周齡,18～20 g)由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,并在無(wú)特定病原體條件下飼養(yǎng)。將小鼠隨機(jī)分為4組,每組6只：載體組(Vec組)、NOD2過(guò)表達(dá)組(NOD2組)、shNC組和shNOD2組。Vec組和NOD2組小鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)染Vec或NOD2的SiHa細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞),shNC組和shNOD2組小鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)染shNC和shNOD2的HeLa細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞),以構(gòu)建遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型。通過(guò)Xenogen IVIS光譜體內(nèi)成像系統(tǒng)(美國(guó)PerkinElmer公司)監(jiān)測(cè)肺轉(zhuǎn)移的熒光強(qiáng)度。8周后,解剖裸鼠的肺,計(jì)數(shù)肉眼可見的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 NOD2與宮頸癌的不良結(jié)局相關(guān)采用基因表達(dá)譜交互式分析(GEPIA,http：//gepia.cancer-pku.cn/)結(jié)合了基因型-組織表達(dá)(GTEx)數(shù)據(jù)集,包括306例宮頸癌患者和13例非癌患者,用于檢測(cè)NOD2的mRNA表達(dá),并證明NOD2在CC組織中表達(dá)明顯高于正常組織,并且不同分期的CC中NOD2的mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A、B)。使用TCGA數(shù)據(jù)集對(duì)生存數(shù)據(jù)的分析揭示,在宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸腺癌(cervical squamous cell carcinoma,CESC)中,NOD2的高表達(dá)與較差的總生存期和無(wú)病生存期相關(guān)(圖1C、D)。為了確定NOD2的功能作用,課題組檢測(cè)了NOD2在CC細(xì)胞(HeLa、SiHa、CaSki和ME-180)和人宮頸上皮細(xì)胞系Ect1/E6E7中的表達(dá),結(jié)果顯示NOD2在CC細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào),其中與Ect1/E6E7細(xì)胞相比,NOD2在HeLa細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較高,在SiHa細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較低(圖1E)。

2.2 NOD2正向調(diào)節(jié)CC細(xì)胞增殖根據(jù)NOD2在CC細(xì)胞系中的表達(dá)譜,將NOD2高表達(dá)的HeLa細(xì)胞用于沉默NOD2,和低NOD2表達(dá)的SiHa細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NOD2(圖2A)。增殖分析結(jié)果表明,與shNC組相比,shNOD2組HeLa細(xì)胞活力(F=9.14,P<0.01)、集落數(shù)、EdU陽(yáng)性細(xì)胞率均顯著降低(t=8.77、10.32,均P<0.01)(圖2B～D);與Vec組相比,NOD2組SiHa細(xì)胞活力(F=11.29,P<0.01)、集落數(shù)、EdU陽(yáng)性細(xì)胞率均增加(t=4.81、4.61,均P<0.01)(圖2E～G)。

圖2 NOD2正向調(diào)節(jié)CC細(xì)胞增殖 ×50

2.3 NOD2對(duì)CC細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的抑制作用Transwell侵襲試驗(yàn)顯示,與shNC組相比,shNOD2組HeLa細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)均降低(t=4.70、5.54,P=0.003、<0.01)(圖3A);與Vec組相比,NOD2組SiHa細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)均增加(t=4.66、4.73,P=0.003、0.003)(圖3B)。為了評(píng)估NOD2在CC細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移中的功能作用,通過(guò)尾靜脈將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CC細(xì)胞注射到裸鼠中以產(chǎn)生肺轉(zhuǎn)移模型。8周后,與shNC組相比,shNOD2組中HeLa細(xì)胞的肺定殖、肺轉(zhuǎn)移灶減少(t=4.36、4.52,P=0.009、0.007)(圖3C、D);與Vec組相比,NOD2組中SiHa細(xì)胞的肺定殖、肺轉(zhuǎn)移灶增加(t=4.38、3.81,P=0.009、0.015)(圖3E、F)。

圖3 NOD2對(duì)CC細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的抑制作用

2.4 NOD2調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路為進(jìn)一步探索NOD2抑制CC進(jìn)展的機(jī)制,用shNC和shNOD2轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中,通過(guò)高通量RNA測(cè)序(RNA-Seq)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。在NOD2下調(diào)的HeLa細(xì)胞中,451個(gè)差異表達(dá)的基因(DEGs)上調(diào),892個(gè)DEGs下調(diào)。隨后,基因集合富集分析(GSEA )結(jié)果顯示NOD2的表達(dá)與AMPK信號(hào)激活和mTOR信號(hào)抑制顯著相關(guān),表明NOD2在AMPK/mTOR信號(hào)中的潛在調(diào)節(jié)作用(圖4A、B)。Western blot試驗(yàn)分析顯示,與shNC組相比,shNOD2組磷酸化AMPK蛋白的表達(dá)水平降低(t=9.05,P<0.01),磷酸化mTOR蛋白的表達(dá)水平增加(t=11.59,P<0.01);與Vec組相比,NOD2組磷酸化AMPK蛋白的表達(dá)水平增加(t=4.70,P<0.01),和磷酸化mTOR蛋白的表達(dá)水平降低(t=9.36,P<0.01)(圖4C)。

圖4 NOD2對(duì)CC細(xì)胞AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響

2.5 NOD2通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)介導(dǎo)CC細(xì)胞的自噬激活此外,GSEA結(jié)果顯示,NOD2的表達(dá)與自噬調(diào)節(jié)途徑激活、自噬體形成顯著相關(guān),表明NOD2在自噬調(diào)節(jié)中的潛在調(diào)節(jié)作用(圖5A、B)。因此,進(jìn)一步評(píng)估NOD2在自噬調(diào)節(jié)中的功能作用。首先,用GFP-mRFP-LC3轉(zhuǎn)染CC細(xì)胞以評(píng)估自噬流的形成。與shNC組相比,shNOD2組GFP-mRFP-LC3的點(diǎn)積累減少(t=4.78,P<0.01);與Vec組相比,NOD2的GFP-mRFP-LC3的點(diǎn)積累增加(t=4.52,P<0.01)(圖5C、D)。此外,Western blot試驗(yàn)分析顯示,與shNC組相比,shNOD2組LC3表達(dá)水平減少(t=7.13,P<0.01),p62表達(dá)水平增加(t=6.61,P<0.01);與Vec組相比,NOD2組LC3表達(dá)水平顯著增加(t=8.43,P<0.01),p62表達(dá)水平減少(t=8.75,P<0.01)(圖5E)。

圖5 NOD2通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)介導(dǎo)CC細(xì)胞的自噬激活

3 討論

近年來(lái),盡管CC的臨床治療取得了進(jìn)展,但預(yù)后仍不令人滿意[9]。因此,迫切需要確定更可靠的治療靶點(diǎn)并闡明其對(duì)CC進(jìn)展的影響。本研究使用一系列體外和體內(nèi)功能喪失和獲得實(shí)驗(yàn)證明了NOD2在抑制CC進(jìn)展中的作用。首先,對(duì)在線數(shù)據(jù)庫(kù)的分析顯示NOD2在CC組織中上調(diào),并且NOD2的表達(dá)水平與較差的預(yù)后相關(guān)。使用各種功能實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估NOD2在CC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中的作用。NOD2顯示出惡性表型。一系列功能獲得實(shí)驗(yàn)證實(shí)NOD2在促進(jìn)CC進(jìn)展中的作用,顯示NOD2可以通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR/自噬信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)CC細(xì)胞進(jìn)展。

轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性CC是高度難治的腫瘤,治療具有挑戰(zhàn)性。先前的研究[10]表明,幾種PRRs與CC的發(fā)展有關(guān)。PRRs的NLR家族已在宿主免疫防御中得到鑒定,其成員NOD2廣泛表達(dá)于女性生殖器官,包括子宮內(nèi)膜、輸卵管、子宮頸和外子宮頸[8]。NOD2在CC的發(fā)展中起重要作用,其失調(diào)推動(dòng)宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展為CC[11]。研究[8]中,與正常子宮頸相比,CSCC組織中檢測(cè)到較高水平的NOD2,尤其在LVSI、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低分化腫瘤中特別高表達(dá),并與較差的生存率相關(guān)。本研究中,與Ect1/E6E7細(xì)胞相比,NOD2在CC細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。這與在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和乳腺癌細(xì)胞系中觀察到的NOD2表達(dá)增加一致[12-13]。隨后,體外功能獲得和喪失實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了NOD2在促進(jìn)CC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的重要作用。尾靜脈注射模型顯示,NOD2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致CC細(xì)胞體內(nèi)遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移率增加。這些體內(nèi)和體外結(jié)果表明,特異性靶向NOD2的shRNAs可以有效抑制CC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。然而,NOD2促進(jìn)CC進(jìn)展的潛在機(jī)制尚未完全研究。

為進(jìn)一步探索NOD2促進(jìn)CC進(jìn)展的機(jī)制,在用shNC和shNOD2轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中,通過(guò)RNA-Seq進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析顯示NOD2的表達(dá)與AMPK信號(hào)激活和mTOR信號(hào)抑制顯著相關(guān),表明NOD2在AMPK/mTOR信號(hào)中的潛在調(diào)節(jié)作用。研究[14]顯示,AMPK/mTOR信號(hào)通路激活可誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬和自噬性死亡,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。例如,Liu et al[15]報(bào)道BDH2通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)抑制腫瘤進(jìn)展。Tang et al[16]表明沉默AMPK/mTOR信號(hào)通路抑制GBM的進(jìn)展。另一項(xiàng)研究[17]表明,鹽霉素可以通過(guò)增加活性氧的產(chǎn)生,從而激活PI3K/AKT/mTOR和ERK/p38 MAPK信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞自噬。本研究中,NOD2的表達(dá)與AMPK信號(hào)激活和mTOR信號(hào)抑制相關(guān),表明NOD2在AMPK/mTOR信號(hào)中的潛在調(diào)節(jié)作用。因此,癌細(xì)胞利用NOD2的細(xì)胞保護(hù)能力來(lái)創(chuàng)造促進(jìn)癌細(xì)胞存活的微環(huán)境。

自噬是一種溶酶體依賴的分解代謝途徑,通過(guò)該途徑清除受損或衰老的細(xì)胞器。自噬在調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展和確定腫瘤細(xì)胞對(duì)化療誘導(dǎo)的應(yīng)激的反應(yīng)中起重要作用[10]。然而,自噬在癌癥治療中的作用是多方面的,取決于細(xì)胞類型、微環(huán)境和腫瘤發(fā)展的階段[18]。迄今為止,已經(jīng)描述了細(xì)胞保護(hù)性和細(xì)胞毒性功能形式的自噬,其中細(xì)胞保護(hù)性自噬在對(duì)化療的反應(yīng)中更為頻繁[7]。一系列證據(jù)表明,自噬通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、EMT以及耐藥性,在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[19]。AMPK/mTOR信號(hào)的激活已被證明與自噬激活相關(guān)[17]。本研究證實(shí)NOD2的表達(dá)與自噬調(diào)節(jié)途徑、自噬體形成顯著相關(guān),表明NOD2在自噬中的潛在調(diào)節(jié)作用。

綜上所述,這項(xiàng)研究表明,NOD2可能通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)促進(jìn)CC增殖、遷移和侵襲,其作用機(jī)制部分涉及自噬激活。因此,靶向NOD2可能是治療CC的有前途的治療靶點(diǎn)。