過表達NRF1減輕阿爾茨海默病模型小鼠的線粒體和認知功能障礙

蘇立寧,王艷兵,張永財

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見的年齡依賴性神經(jīng)退行性疾病,目前尚沒有治愈的方法[1]。近來研究[2]顯示,AD的發(fā)病機制不單獨是淀粉樣β蛋白(amyloid-β protein,Aβ)沉積的線性下游結果,而是一種多種因素共同參與調控的疾病。其中,線粒體功能障礙可能是驅動更為普遍的散發(fā)遲發(fā)性AD病理生理學的主要損傷,并將其稱為“線粒體級聯(lián)假說”[3-4]。線粒體生物發(fā)生在維持和調節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)以及協(xié)調核基因組和線粒體基因組方面起著重要作用,但其受一系列信號因子調控。核呼吸因子1(nuclar respiratory factor-1,NRF1)是線粒體生物合成和功能的關鍵調節(jié)因子[5]。之前已有文獻[6-7]顯示NRF1在包括AD在內的多種神經(jīng)退行性疾病中表達異常降低且其與線粒體生物發(fā)生和功能受損有關,并且擾亂線粒體穩(wěn)態(tài)能加劇學習和記憶障礙[8]。這些研究提示了AD的進展與NRF1異常潛在相關,但其在AD中的具體作用和機制仍不明確。因此,該研究檢測了NRF1對AD相關表型的調控作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑與抗體 NRF1和GAPDH抗體(美國Sigma-Aldrich公司),HRP或Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG抗體(美國Cell Signaling Technology公司),攜帶過表達NRF1或對照(Con)的AAV載體以及稀疏標記的AAV(上海和元生物技術有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒以及ECL化學發(fā)光底物試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.2小鼠 7月齡SPF級5×FAD小鼠(n=40,雄性,體質量26～30 g)作為AD模型小鼠,WT同窩仔(C57BL/6J小鼠,n=20,雄性,體質量26～30 g)作為正常對照小鼠。所有小鼠均購自常州卡文斯實驗動物有限公司[SCXK(蘇)2021-0013],飼養(yǎng)在12 h光/暗循環(huán)的標準SPF條件下,小鼠可自由獲得食物和水。本實驗經(jīng)河北北方學院動物倫理委員會的批準。

1.1.3主要儀器 EM UC7型切片機(德國Leica公司);JEM-1400 PLUS型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司);LSM880型激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司);Western blot印跡系統(tǒng)(美國Bio-rad公司);e-Blot凝膠成像系統(tǒng)(上海易孛特光電技術有限公司);51730型小鼠腦立體定位儀(上海玉研科學儀器有限公司);BHV-M1型Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(北京必海微科技有限公司);MED64型平面微電極矩陣(電生理)記錄系統(tǒng)(日本Alpha Med Science公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫熒光 戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠后,用PBS灌注,然后用4%多聚甲醛灌注。將腦取出,然后在4 ℃下在4%多聚甲醛中后固定24 h。之后,將腦在30%蔗糖溶液中脫水,直到腦沉入底部。將樣品嵌入最佳切割溫度復合物(OCT)中包埋,低溫下用徠卡EM UC7切片機切為8 μm厚的切片。切片在室溫下晾干,PBS清洗3次,用含0.3% Triton X-100的5% BSA在37 ℃封閉2 h,然后在4 ℃孵育NRF1抗體(1 ∶500)過夜,用PBS清洗3次后,Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG抗體(1 ∶500)在室溫下孵育1.5 h,用含DAPI的封片液封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.2腦立體定位顯微注射 戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠,將其置于小鼠腦立體定位儀中。用微量注射針將過表達NRF1和對照的AAV病毒及其稀疏標記的AAV雙側注射入背側海馬 (AP=-2.0 mm,ML=1.2 mm,DV=2 mm,0.5 μl),注射后,留針5 min,然后慢慢抽出。注射14 d后進行行為測試。然后,麻醉下處死小鼠取雙側海馬,通過Western blot和熒光評估NRF1的過表達情況;用電鏡觀察海馬線粒體形態(tài);激光共聚焦顯微鏡下觀察CA1區(qū)稀疏標記神經(jīng)元的樹突棘并計數(shù)。

1.2.3透射電子顯微鏡 戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠后,用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)灌注,然后再用4%多聚甲醛灌注。將海馬組織(1 mm3)小塊快速解剖分離,并用2.5%戊二醛在4 ℃下固定過夜,再1%鋨酸固定1 h,將組織被嵌入Eponate 12包埋樹脂中,并用徠卡EM UC7切片機沿冠狀面切成60～80 nm厚的切片。鉛染后,由雙盲的病理學家通過JEM-1400 PLUS透射電子顯微鏡檢測線粒體形態(tài)。

1.2.4Western blot 用RIPA緩沖液裂解海馬組織,然后按操作說明書步驟,在4 ℃下11 000 r/min離心25 min收集蛋白上清液。根據(jù)制造商的說明,通過BCA法檢測蛋白的濃度。每樣品取蛋白上清液(含25 μg蛋白)與上樣緩沖液在100 ℃下煮沸5 min,然后進行電泳分離和轉印。在室溫下,用5%牛奶封閉1.5 h,然后在4 ℃下孵育一抗(GAPDH,1 ∶8 000;NRF1,1 ∶1 000)過夜。PBS-T緩沖液(含0.05%吐溫20的PBS)洗滌3次后,室溫下孵育HRP標記羊抗兔IgG二抗(1 ∶2 000)1.5 h。用ECL試劑顯示條帶,并用e-Blot成像系統(tǒng)采集圖像。用Image J軟件分析條帶的強度。

1.2.5Morris水迷宮 用Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(內徑120 cm,高50 cm,可升降的站臺直徑9 cm)評估小鼠的空間記憶。將其充滿不透明的水并保持在23 ℃(水深30 cm),分成4個象限,站臺位于水面下1 cm處。測試小鼠在1 d內從4個象限釋放,在90 s內自由游泳,若老鼠沒有找到隱藏的站臺,引導老鼠到隱藏的站臺并停留15 s。在最后一次訓練24 h后進行空間探測試驗,站臺降至水底,從放置隱藏平臺的相反象限釋放小鼠,記錄小鼠停留在隱藏站臺的時間。之后,通過在對面的水面上放置一個帶有旗幟的水下站臺來進行暗示測試。對每只小鼠進行1次試驗,并記錄到達站臺的時間。

1.2.6海馬離體腦片電生理學 小鼠麻醉后,迅速取出大腦,分離出海馬體,置于人工腦脊液(由124 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、26 mmol/L NaHCO3、1.25 mmol/L NaH2PO4、2 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgSO4和10 mmol/L D-葡萄糖組成)在室溫下孵育2 h,并制作400 μm厚的海馬切片。在CA1區(qū)的Schaffer側支-連合纖維CA1錐體細胞通路中記錄場電位反應。用100 Hz脈沖以30 s的間隔刺激,記錄興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。在穩(wěn)定基線開始后20 min引入兩列高頻刺激(high frequency stimulation,HFS： 100 Hz,1秒內100個脈沖,間隔30 s),誘導長時程增強效應(long-term potentiation,LTP)。通過將HFS期后90 min的平均fEPSP斜率與基線期的平均fEPSP斜率進行比較并計算相對于基線的百分比變化來量化LTP。

2 結果

2.1 AD模型小鼠中NRF1蛋白表達情況和NRF1過表達模型構建免疫熒光染色結果顯示,5×FAD小鼠海馬NRF1染色熒光強度相對于WT小鼠下降(圖1A)。Western blot結果,與WT對照相比,5×FAD小鼠海馬NRF1蛋白水平顯著降低(t=6.251,P<0.001) (圖1B)。將過表達NRF1的AAV病毒注射到5×FAD小鼠的海馬區(qū)域,熒光顯微圖片顯示AAV病毒注射成功(圖1C);同時用Western blot驗證NRF1過表達的效率,與AAV-Con組相比,AAV-NFR1組NRF1蛋白顯著上調(圖1D,t=8.432,P<0.001),表明NRF1基因在海馬中過表達成功。

圖1 各組小鼠中海馬NRF1表達情況

2.2 各組小鼠海馬神經(jīng)元中線粒體形態(tài)變化用透射電鏡觀察AD模型小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體損傷情況,對照WT小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體正常,5×FAD小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的線粒體結構發(fā)生了顯著改變,呈現(xiàn)線粒體腫脹且線粒體嵴消失(圖2A)。進一步觀察了過表達NRF1對海馬神經(jīng)元線粒體損傷的影響(圖2B),AAV-NFR1組5×FAD小鼠海馬神經(jīng)元線粒體腫脹和線粒體嵴的喪失的病理變化較AAV-Con組減輕,表明NRF1可改善AD小鼠的線粒體損傷。

2.3 NRF1過表達緩解5×FAD小鼠的認知和記憶功能Morris水迷宮測試評估過表達NRF1對5×FAD小鼠的空間學習和記憶。各組訓練路徑中的游泳速度相似,在第2至5天,AAV-NFR1組隱藏站臺的逃避潛伏期比對照組顯著降低(圖3A,t=4.014、5.906、10.132、12.048,P<0.01或P<0.001),在用于評估記憶回憶的測試(隱藏站臺被移除)中,與AAV-Con組相比,AAV-NFR1在目標象限中的時間百分比以及穿過平臺的次數(shù)間均顯著增多(圖3B、3C,t=11.536、18.062,P<0.001)。這些結果表明,在海馬中的NRF1過表達能增強了AD小鼠的認知和記憶功能。

圖3 過表達NRF1減輕5×FAD小鼠的認知和記憶功能障礙(n=8)

2.4 過表達NRF1改善海馬突觸可塑性為確定過表達NRF1對樹突棘的影響,在小鼠的海馬中使用稀疏標記染色定量樹突棘,與AAV-Con組相比,AAV-NFR1組小鼠的樹突棘密度顯著增高(圖4A、B,t=9.532,P<0.001),表明過表達NRF1降低了5×FAD小鼠樹突棘的丟失。為測試過表達NRF1是否可挽救AD中受損的海馬突觸可塑性,研究了其對長時程增強的影響,與AAV-Con組相比,AAV-NFR1組在整個90 min的記錄時間周期內產(chǎn)生了持久穩(wěn)定的LTP(圖4C),fEPSP斜率顯著增高(圖4D,t=3.408,P<0.01),表明NRF1干預可使受損的LTP得到挽救。

圖4 過表達NRF1挽救AD小鼠海馬突觸可塑性受損(n=8)

3 討論

幾十年來,Aβ一直被認為是緩解AD的主要靶點,但迄今為止,以靶向Aβ為主的方法在臨床試驗中均產(chǎn)生了令人失望的結果[9]。與此同時,近期越來越多的文獻[3-4]揭示了AD患者腦的海馬神經(jīng)元線粒體功能受損,提示以線粒體為細胞生物能學靶點治療AD的策略的可能性。然而,在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中,線粒體功能障礙的具體受影響的分子機制仍不清楚。本研究結果表明,NRF1介導的線粒體功能障礙在AD模型的5×FAD小鼠中調控了AD病程的進展。

為證實5×FAD 小鼠(AD模型小鼠)與AD病人在線粒體病理改變方面的一致性,本研究首先對5×FAD小鼠海馬神經(jīng)元的線粒體形態(tài)進行電鏡觀察,確認了線粒體損傷的發(fā)生。NRF1是一種核轉錄因子,主要作為線粒體生物發(fā)生相關基因的正調節(jié)因子[5]。本研究中,NRF1在5×FAD小鼠海馬中顯著降低,這提示了NRF1相關的線粒體功能異?？赡茉?×FAD小鼠AD相關癥狀進展中發(fā)揮作用。為驗證課題組提出的NRF1在AD發(fā)揮作用中的假設,本實驗利用攜帶過表達NRF1的AAV病毒對5×FAD小鼠進行腦立體定位注射干預,并在確認病毒工具工作良好后進行疾病表型直接相關的認知功能檢測。水迷宮的空間學習記憶表現(xiàn)是反映海馬損傷和神經(jīng)認知性能的重要指標[10-11]。本研究通過Morris水迷宮表現(xiàn),建立了直接干預海馬中NRF1與5×FAD小鼠空間學習和記憶之間的聯(lián)系。正如預期,NRF1過表達小鼠表現(xiàn)出更短的到達站臺的時間,此外,其在目標象限花費的時間及穿越次數(shù)也顯著增多,這些Morris水迷宮測試的結果表明,5×FAD小鼠空間學習缺陷的原因至少部是由于其海馬神經(jīng)元的NRF1表達降低所致。并且在隨后的線粒體檢測中,本研究結果與之前報道的一致,NRF1表達刺激線粒體生物發(fā)生,在維持足夠的功能性神經(jīng)元線粒體質量中發(fā)揮重要作用[6-7, 12]。

越來越多的證據(jù)[13-14]表明AD患者的樹突棘減少,而維持適當?shù)臉渫患芏葘τ贏D患者和AD小鼠的突觸功能和認知行為至關重要。本研究評估了過表達NRF1干預對5×FAD小鼠樹突棘密度的影響,結果顯示過表達NRF1干預的小鼠海馬組織中更為豐富的樹突棘形態(tài)學改變。眾所周知,線粒體結構和功能的變化對維持突觸可塑性的功能至關重要[15]。神經(jīng)元末梢結構受損的線粒體功能,可能無法在突觸處產(chǎn)生ATP,導致突觸損傷[16]。本研究利用NRF1過表達病毒的干預逆轉了這一突觸的解剖結構的缺陷,且后續(xù)的LTP功能實驗也佐證了過表達NRF1可挽救5×FAD小鼠海馬突觸可塑性受損。

綜上所述,本研究觀察表明NRF1異常表達途徑介導的線粒體功能異常可能是AD表現(xiàn)發(fā)展的病理機制之一,這種機制直接參與了認知功能相關的突觸可塑性改變。從治療角度來看,利用NRF1相關的線粒體干預靶點可能是一種減緩AD發(fā)病的潛在的藥理學方法。