KAT7促進軟骨細胞衰老

王旭蕾,儲柱平,王惠敏,魏 偉,嚴尚學

骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種與衰老相關的關節(jié)退行性疾病,是世界范圍內(nèi)常見的致殘性疾病,臨床缺少有效治療藥物。OA的發(fā)展不僅與炎癥或軟骨基質的合成和降解失衡有關,關節(jié)組織中衰老細胞數(shù)量的增加也發(fā)揮著重要作用;年齡相關的線粒體功能障礙與氧化應激也可誘導關節(jié)組織細胞衰老[1-2]。盡管OA的確切機制不明,但衰老的一些特征在OA疾病進程中發(fā)揮重要作用。細胞衰老是衰老的標志之一,衰老細胞表達衰老生物標志物p53和p21,并表現(xiàn)出衰老相關的β-半乳糖苷酶活性增加[3]?；贑RISPR/Cas9的全基因組篩選確定賴氨酸乙酰轉移酶7(lysine acetyltransferase 7,KAT7/HBO1)是細胞衰老的驅動因素[4]。有研究[5-6]證實,軟骨細胞衰老與OA疾病發(fā)展進程密切相關,深入闡明KAT7是否參與軟骨細胞衰老對于了解OA病理機制具有重要作用。該研究擬建立過度復制誘導原代小鼠軟骨細胞衰老模型及小鼠自然衰老模型,研究KAT7在軟骨細胞及軟骨組織衰老中的作用,為治療或預防OA提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雌性SPF級C57BL/6小鼠購于安徽省實驗動物中心[許可證號：SCXK(皖)2020-001],飼養(yǎng)于SPF環(huán)境設施中[許可證號：SYXK(皖)2020-001],自由飲食;對照組(13～15 g)、實驗組(22～24 g)各7只。

1.1.2主要試劑 Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma 公司;小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑購自中杉金橋;β-actin抗體購自美國 Affinity公司;KAT7抗體、p21抗體購自美國Abcam公司;p53抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司;SA-β-Gal染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.1.3主要儀器 激光共聚焦顯微鏡(型號：徠卡TCS SP8)、組織原位細胞掃描分析儀(型號：Pannoramic MIDI) 購于濟南丹吉爾電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1軟骨細胞的分離與培養(yǎng) 從10日齡 C57BL/6幼鼠的膝骨軟骨中分離出原代軟骨細胞。將小鼠CO2梯度處死后,無菌條件下獲取雙側股骨及脛骨軟骨,PBS沖洗3次,剪碎為1 mm3左右的軟骨碎片后用巴氏吸管轉移至15 ml離心管中,離心去除上層PBS,用1%二型膠原酶重懸,37 ℃消化6 h后用22 μm細胞濾器過濾消化液,離心棄上清液,加入10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞,后將細胞懸液轉移至預先加有培養(yǎng)基的25 cm2的培養(yǎng)瓶中37 ℃培養(yǎng)。小鼠軟骨細胞培養(yǎng)在添加有10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.2.2軟骨細胞的鑒定 以甲苯胺藍染色與二型膠原(Col Ⅱ)免疫熒光染色進行軟骨細胞鑒定。采用細胞爬片技術,細胞貼壁后取出蓋玻片,4%多聚甲醛固定20 min,3%過氧化氫室溫下孵育10 min,5% BSA封閉 10 min,滴加Col Ⅱ一抗,4 ℃過夜。 復溫后滴加熒光二抗,室溫下孵育2 h,DAPI染色8 min,滴加抗熒光淬滅劑,指甲油封片。對于甲苯胺藍染色, 固定后用甲苯胺藍染色 5 min,梯度乙醇脫水后常溫干燥,中性樹膠封片。

1.2.3Western blot檢測軟骨細胞衰老信號蛋白p53、p21及KAT7的表達 收集第八代軟骨細胞(P8)及加入WM-3835干預的P8軟骨細胞,提取細胞總蛋白,電泳、轉膜、封閉,分別加入KAT7(1 ∶1 000)、p53(1 ∶1 000)、p21(1 ∶1 000)等一抗孵育過夜;分別加二抗(KAT7與p21為兔抗1 ∶10 000;p52為鼠抗1 ∶1 000) 37 ℃ 孵育 2 h,洗膜,顯影。 Image J軟件分析灰度值并進行統(tǒng)計分析。

1.2.4免疫熒光檢測軟骨細胞KAT7的表達 收集P8軟骨細胞及加入WM-3835干預的P8軟骨細胞,多聚甲醛固定,免疫染色通透液(TritionX-100)通透,使用與二抗相同來源的宿主血清封閉后加KAT7(1：500)一抗過夜;次日棄去一抗加入兔熒光二抗(1 ∶200)孵育2 h,DAPI染色8 min,滴入抗熒光淬滅劑,指甲油封片。

1.2.5病理學檢測 取經(jīng)10%福爾馬林室溫固定的軟骨組織,脫鈣后,石蠟縱向包埋,切片后進行HE ,番紅O-固綠染色,鏡下觀察組織病理學改變。

1.2.6免疫組織化學方法檢測p53、KAT7在軟骨組織樣本中的表達水平 軟骨組織樣本經(jīng)處理后,脫鈣包埋切片,分別用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗原修復液和 3%過氧化氫進行抗原修復并阻斷內(nèi)源性過氧化物的干擾,加入KAT7(1 ∶200)、p53(1 ∶500)一抗4 ℃孵育過夜,第2天室溫復溫后 PBS 洗滌,按照通用二步法免疫組化試劑盒(PV-9000)中說明書步驟：加入一抗增強液孵育30 min,增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物室溫孵育20 min,加入適量新鮮配制的DAB顯色液約3 min,蘇木精復染后封片并在波片掃描儀下觀察。

2 結果

2.1 軟骨細胞的形態(tài)學觀察經(jīng)過兩步酶消化法分離得到的原代軟骨細胞為球形,呈懸浮狀態(tài),大小均一,具有較強的折光性。貼壁后的軟骨細胞大部分呈圓形、橢圓形或短梭形,可見成簇現(xiàn)象。

2.2 軟骨細胞的鑒定3代內(nèi)的陽性軟骨細胞甲苯胺藍染色可見細胞內(nèi)有藍紫色異染顆粒;Ⅱ型膠原( Col Ⅱ)免疫熒光染色陽性軟骨細胞可見細胞均有紅色陽染情況(圖1)。

圖1 小鼠軟骨細胞鑒定 ×100

2.3 過度復制對小鼠軟骨細胞p53、p21及KAT7蛋白表達的影響及染色結果Western blot結果顯示(圖2),與第一代(P1)軟骨細胞相比, P8軟骨細胞p53、p21及KAT7的蛋白表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SA-β-Gal染色可見,P8軟骨細胞中SA-β-gal陽性的軟骨細胞數(shù)高于對照組(圖3)。

圖2 過度復制軟骨細胞衰老蛋白及KAT7的影響

圖3 過度復制軟骨細胞 SA-β-Gal染色×40

2.4 WM-3835對P8軟骨細胞KAT7和p21表達的影響結果顯示,P8軟骨細胞KAT7蛋白表達量明顯升高, 100 μmol/L WM-3835作用48 h可降低KAT7和p21的蛋白表達,差異有統(tǒng)計學意義(圖4)。細胞免疫熒光結果也表明,與P1軟骨細胞相比,P8軟骨細胞KAT7熒光強度(紅色)增強,WM-3835體外可降低KAT7熒光強度(圖5)。

圖4 WM-3835抑制對衰老軟骨細胞KAT7及p21表達的影響(n=3)

圖5 WM-3835體外對P8軟骨細胞KAT7熒光強度的影響 ×400

2.5 不同年齡軟骨組織的病理變化顯微鏡下檢查可見,年輕小鼠軟骨組織中無異常分化細胞,軟骨細胞分布較均勻,大小和形態(tài)一致;老齡小鼠軟骨組織呈現(xiàn)近骨性分布,軟骨細胞數(shù)量減少,空泡化明顯,軟骨表面完整性降低,關節(jié)表面不平整(圖6)。

圖6 不同年齡軟骨組織的病理變化 ×100

圖7 不同年齡小鼠軟骨中的KAT7和p53的表達 ×100

2.6 不同年齡小鼠軟骨組織中KAT7和p53的表達免疫組化法檢測年輕小鼠(2月齡)與老齡小鼠(22月齡)軟骨組織KAT7和p53表達水平,結果顯示22月齡小鼠軟骨組織中KAT7和p53表達水平相比于2月齡明顯升高。

3 討論

細胞衰老是衰老的標志之一,軟骨細胞在衰老的過程中具有許多衰老細胞的特征。衰老細胞的慢性積累與年齡相關的疾病有關,其中骨性關節(jié)炎是一種常見的關節(jié)疾病,晚期骨性關節(jié)炎患者的軟骨中大量存在衰老細胞。盡管當軟骨細胞衰老而停止分裂時,它們?nèi)匀槐３执x活性,分泌多種炎癥細胞因子、趨化因子、生長因子和許多更可溶和不可溶的蛋白酶,這些蛋白酶被稱為衰老相關分泌表型(SASP);SASP改變組織微環(huán)境,影響周圍細胞和組織炎性因子浸潤,進而促進關節(jié)炎的發(fā)生[7]。

KAT7(HBO1或MYST2)是一種乙?；疕3和H4組蛋白的組蛋白乙酰轉移酶;它由一個N-末端結構域和一個C-末端MYST結構域組成,這是乙酰輔酶a結合和乙酰化所必需的[8]。HBO1在調節(jié)許多關鍵的細胞行為和生理功能方面至關重要,包括基因轉錄、蛋白質泛素化、免疫調節(jié)、干細胞多能性、自我更新維持和胚胎發(fā)育等。已有研究[4]證實,KAT7是人間充質前體細胞衰老的有力驅動因素,對于肝細胞和人間充質前體細胞衰老具有明顯的促進作用,使用KAT7抑制劑WM-3835可延緩肝細胞和人間充質前體細胞的衰老;KAT7還是MSCs衰老的驅動因素,有文獻[9]通過體外研究發(fā)現(xiàn)衰老MSCs中KAT7表達量上升,且β-胡蘿卜素可通過調節(jié)KAT7 - P15信號軸抑制衰老。OA是一種與年齡相關性極高的關節(jié)疾病,軟骨組織和軟骨細胞是否發(fā)生衰老過程,KAT7是否參與了軟骨組織衰老,尚未見文獻報道。

本研究中,與P1小鼠原代軟骨細胞相比,P8軟骨細胞的p53、p21和KAT7蛋白表達水平升高,SA-β-Gal也顯示陽染增多;WM-3835作為一種KAT7抑制劑,可結合在KAT7乙酰輔酶A的結合位點上使KAT7失活[10],體外使用WM-3835(100 μmol/L)可以降低P8軟骨細胞中KAT7和衰老標志物p21的表達。這些結果提示,P8軟骨細胞產(chǎn)生了“復制性衰老”, KAT7在小鼠軟骨細胞衰老模型中發(fā)揮促進作用。比較不同年齡小鼠的關節(jié)組織顯示,與年輕小鼠相比,老齡小鼠軟骨組織呈現(xiàn)近骨性分布,空泡化嚴重,軟骨表面完整性降低,p53和KAT7表達明顯上調,提示KAT7與老齡小鼠的軟骨組織衰老密切相關。Western blot和細胞免疫熒光確定在衰老軟骨細胞中KAT7表達升高;在衰老小鼠軟骨組織切片中使用免疫組化和免疫熒光的方法同樣證明與年輕小鼠相比,衰老小鼠軟骨組織中KAT7表達上調,說明KAT7與衰老息息相關。

綜上所述,本研究在成功建立小鼠原代軟骨細胞產(chǎn)生復制性衰老模型及小鼠自然衰老模型的基礎上,明確了KAT7在軟骨細胞衰老過程中的作用,KAT7或可成為軟骨衰老新的標志物。