LINC00894通過(guò)miR-205-5p/ZEB1軸對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

康偉彪,周理好,余昌俊,江 露,陳昌裕

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,全球每年新增胃癌病例達(dá)100萬(wàn),因胃癌死亡病例達(dá)78.40萬(wàn)[1]。盡管目前治療手段很多,但早期診斷率不高,針對(duì)胃癌的機(jī)制研究仍是目前研究的熱點(diǎn)。長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通常以疾病、組織或階段特異性的方式表達(dá),參與多種生物學(xué)過(guò)程,并在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[2-3]。課題組前期通過(guò)利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)比胃癌及其配對(duì)癌旁組織中的數(shù)條lncRNA的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)LINC00894在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào)。近些年,有研究[4-7]表明LINC00894在一些腫瘤中高表達(dá)、發(fā)揮促癌作用,也有研究[8-9]顯示LINC00894在腫瘤中扮演抑癌基因的角色。然而,目前關(guān)于LINC00894在胃癌中的研究較少。大量證據(jù)表明lncRNA可作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),與miRNA相互作用從而吸附它們,降低它們對(duì)靶基因mRNA的調(diào)控效應(yīng)[10]。因此,該研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)合生物信息學(xué)分析,探索LINC00894基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響,并驗(yàn)證LINC00894、miR-205-5p、ZEB1在胃癌中的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

1.1.1主要細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞系(MGC-803、AGS、BGC-823、NCI-N87、HGC-27)及人正常胃細(xì)胞系(GES-1)取自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑 RPMI-1640、DMEM、Opti-MEM培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(貨號(hào)：11668-027)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;血清購(gòu)于美國(guó)Life Technology公司;總RNA提取試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司;LINC00894干擾質(zhì)粒(LINC-KD1,LINC-KD2)、LINC00894過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(LINC-OE)、miR-205-5p模擬物(mimic)及其相應(yīng)的陰性對(duì)照mimic control、miR-205-5p抑制物(inhibitor)及其相應(yīng)的陰性對(duì)照inhibitor control、含miR-205-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型LINC00894熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(LIN-WT)和miR-205-5p結(jié)合位點(diǎn)突變的突變型LINC00894熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(LIN-MUT)、含有ZEB1基因3'UTR序列的野生型或突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(ZEB1-3U-WT,ZEB1-3U-MUT)均購(gòu)于上海吉瑪公司;雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒和報(bào)告基因載體購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;抗ZEB1抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab124512)(稀釋度：1 ∶1 000);抗β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab8227) (稀釋度：1 ∶1 000 );二抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab97051)(稀釋度：1 ∶6 000)。

1.1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：NU-5810E)及生物安全柜(型號(hào)：NU-425-400S)均購(gòu)于美國(guó)NUAIRE公司;倒置熒光顯微鏡(型號(hào)：DeltaVision)購(gòu)于美國(guó)GE公司;微量核酸蛋白紫外分析儀(型號(hào)：Genove Nano)購(gòu)于英國(guó)JENWAY公司;熒光定量PCR儀(型號(hào)：Step One Plus ABI)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.2 樣本收集所有樣本均收集于2011-2012年在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的胃癌患者術(shù)后標(biāo)本,所有患者的納入標(biāo)準(zhǔn)均為：無(wú)其它特殊疾病;術(shù)前未接受任何放療、化學(xué)治療、免疫治療、靶向治療或其它特殊治療。所有胃癌患者的隨訪時(shí)間均超過(guò)5年,且所有納入本研究的患者均簽署了知情同意書(shū)。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)審查及批準(zhǔn),并嚴(yán)格遵照《赫爾辛基宣言》。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均使用含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基,并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用說(shuō)明書(shū)推薦的操作步驟,使用Lipofectamine 2000,對(duì)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823和AGS細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,分為敲低組(LINC-KD1、LINC-KD2)、過(guò)表達(dá)組(LINC-OE)和對(duì)照組(Control),轉(zhuǎn)染48 h后,提取總RNA或總蛋白,通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)針對(duì)LINC00894的敲低和過(guò)表達(dá)效率,以確定LINC00894敲減或過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型是否構(gòu)建成功;通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC00894與ZEB1之間表達(dá)水平的關(guān)系。

1.4 RNA提取與RT-qPCR細(xì)胞總RNA的提取、RNA的逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR的方法參課題組前期發(fā)表的文章[11]。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后,使用PBS溶液清洗細(xì)胞3次,然后用含有蛋白酶抑制劑的裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解,使用干凈的細(xì)胞刮刮凈培養(yǎng)皿中的液體,收集后并離心,提取細(xì)胞中的總蛋白,并檢測(cè)總蛋白濃度。制備SDS-PAGE膠后,取20 μl的蛋白樣品或Marker在SDS-PAGE膠中進(jìn)行電泳分離,然后將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上,麗春紅染色后再次清洗PVDF膜,然后將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h,根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入稀釋后的一抗(抗ZEB1抗體,1 ∶1 000;抗β-actin抗體,1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,第2天使用PBST浸洗3次后,加入相應(yīng)的二抗[山羊抗兔IgG H&L (HRP),1 ∶6 000],室溫下孵育60 min后取出PVDF膜,再次使用PBST浸洗3次,最后加入顯影液放在顯影儀中進(jìn)行顯影并保存圖片。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后,使用胰酶消化細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以每孔2 000個(gè)細(xì)胞的密度于96孔板種板,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,分別于種板后的第1、2、3、4天進(jìn)行數(shù)據(jù)收集,數(shù)據(jù)收集前,每孔加入CCK-8試劑10 μl,孵育120 min后,收集450 nm波長(zhǎng)的光密度(optimal density, OD)值。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后,使用胰酶消化細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以每孔600個(gè)的密度于6孔板種板,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,每隔3 d更換1次培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)2周,待克隆形成后終止培養(yǎng),棄去舊的培養(yǎng)基,并使用PBS溶液清洗細(xì)胞,去除原有殘余培養(yǎng)基和細(xì)胞碎片等雜質(zhì),使用濃度為4%的多聚甲醛(1 000 μl/孔),固定20 min;棄去多聚甲醛后,使用0.1%的結(jié)晶紫溶液(1 000 μl/孔)染色1 h后,拍照并計(jì)數(shù)每組克隆形成數(shù)。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)

1.8.1遷移實(shí)驗(yàn) 胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后,使用胰酶消化細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至5×105/ml,于Transwell 24孔板中加入600 μl完全培養(yǎng)基,向孔中安裝Transwell小室,然后向上室加入200 μl目的細(xì)胞懸液,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,90%乙醇固定0.5 h,0.1%結(jié)晶紫染色5 min后,最后,使用顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.8.2侵襲實(shí)驗(yàn) 于冰上預(yù)先配制基質(zhì)膠工作混合液(基質(zhì)膠 ∶無(wú)血清培養(yǎng)基=1 ∶8),吸取60 μl基質(zhì)膠工作液于小室上層(小室放于Transwell 24孔板中),將24孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中超過(guò)2 h,按照相同的步驟將細(xì)胞懸液種植與小室上層,剩余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)使用生物信息學(xué)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)starbase(https：//starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測(cè)LINC00894靶基因,miR-205-5p與LINC00894具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),將結(jié)合位點(diǎn)突變,構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(LIN-MUT);同樣使用starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-205-5p靶基因,ZEB1與miR-205-5p具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),將結(jié)合位點(diǎn)突變,構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(ZEB1-3U-MUT)。將LIN-WT或LIN-MUT分別與miR-205-5p mimic或mimic control共轉(zhuǎn)染到BGC-823細(xì)胞中;將LIN-WT或LIN-MUT分別與miR-205-5p inhibitor或inhibitor control共轉(zhuǎn)染到AGS細(xì)胞中;將ZEB1-3U-WT或ZEB1-3U-MUT分別與miR-205-5p mimic或mimic control共轉(zhuǎn)染到BGC-823細(xì)胞中;將ZEB1-3U-WT或ZEB1-3U-MUT分別與miR-205-5p inhibitor或inhibitor control共轉(zhuǎn)染到AGS細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后,利用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1LINC00894在胃癌中高表達(dá)且與不良預(yù)后有關(guān)RT-qPCR結(jié)果顯示(圖1A)：LINC00894在胃癌組織中的表達(dá)水平較胃正常組織明顯升高(P<0.01);Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析顯示(圖1B、C)：高表達(dá)LINC00894的胃癌患者具有更差的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期;RT-qPCR結(jié)果顯示(圖1D)：LINC00894在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平較胃正常細(xì)胞系GES-1明顯升高,其中在BGC-823細(xì)胞中表達(dá)最高,在AGS細(xì)胞中表達(dá)最低,因此,選擇BGC-823和AGS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 LINC00894在胃癌中高表達(dá)且與不良預(yù)后有關(guān)

2.2LINC00894對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響RT-qPCR結(jié)果顯示(圖2A)：敲低組LINC-KD1、LINC-KD2較對(duì)照組Control的LINC00894表達(dá)量下降(F=53.04,P<0.01);過(guò)表達(dá)組LINC-OE較對(duì)照(Control)組的LINC00894表達(dá)量上升(P<0.01)。

圖2 LINC00894對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

此外,對(duì)LINC00894的敲低效率和過(guò)表達(dá)效率均超過(guò)50%,表明敲減和過(guò)表達(dá)模型構(gòu)建成功。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2B)：與對(duì)照組比較,LINC00894敲低組(LINC-KD1、LINC-KD2)的OD值(450 nm)減小(F=26.21,P<0.01),而LINC00894過(guò)表達(dá)組(LINC-OE)(1.76 ± 0.21)的OD值(450 nm)增加,提示LINC00894基因的表達(dá)上調(diào)可提高胃癌細(xì)胞的增殖能力?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2C)：LINC00894敲低組(LINC-KD1、LINC-KD2)細(xì)胞形成克隆數(shù)較對(duì)照組減少(F=135.0,P<0.01),LINC00894過(guò)表達(dá)組(LINC-OE)細(xì)胞形成克隆數(shù)較對(duì)照組增加,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示LINC00894基因的高表達(dá)顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的克隆形成能力。

2.3LINC00894對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3A)：LINC-KD1、LINC-KD2組較Control組的遷移細(xì)胞數(shù)減少(F=75.77,P<0.01),LINC-OE組較Control組的遷移細(xì)胞數(shù)增加,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3B)：LINC-KD1、LINC-KD2組較Control組的侵襲細(xì)胞數(shù)減少(F=70.46,P<0.01),LINC-OE組較Control組的侵襲細(xì)胞數(shù)增加,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示LINC00894基因的高表達(dá)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖3 LINC00894對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.4LINC00894與miR-205-5p和ZEB1的靶向關(guān)系生物信息學(xué)分析顯示(圖4A、B)：LINC00894與miR-205-5p、miR-205-5p與ZEB1具有互補(bǔ)序列,因此miR-205-5p可能是LINC00894的靶基因,而ZEB1可能是miR-205-5p的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示：在BGC-823細(xì)胞中,miR-205-5p mimic降低了LIN-WT組的熒光素酶活性,而LIN-MUT組的熒光素酶活性沒(méi)有變化,在AGS細(xì)胞中,miR-205-5p inhibitor增強(qiáng)了LIN-WT組的熒光素酶活性,而LIN-MUT組的熒光素酶活性沒(méi)有變化,以上結(jié)果提示LINC00894和miR-205-5p之間可能存在直接的相互作用(圖4C);在BGC-823,miR-205-5p mimic降低了ZEB1-3U-WT組的熒光素酶活性,而ZEB1-3U-MUT組的熒光素酶活性沒(méi)有變化,在AGS細(xì)胞中,miR-205-5p inhibitor增強(qiáng)了ZEB1-3U-WT組的熒光素酶活性,而ZEB1-3U-MUT組的熒光素酶活性沒(méi)有變化,以上結(jié)果提示ZEB1和miR-205-5p之間可能存在直接的相互作用(圖4D)。RT-qPCR結(jié)果顯示(圖4E)：在BGC-823細(xì)胞中,敲低組LINC-KD1、LINC-KD2較對(duì)照組Control的miR-205-5p表達(dá)量上升(F=42.17,P<0.01));在AGS細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)組LINC-OE較對(duì)照組Control的miR-205-5p表達(dá)量下降。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示(圖4F)：在BGC-823細(xì)胞中,敲低組LINC-KD1、LINC-KD2較對(duì)照組Control的ZEB1蛋白的表達(dá)量下降;在AGS細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)組LINC-OE較對(duì)照組Control的ZEB1蛋白的表達(dá)量上升。以上結(jié)果表明：LINC00894通過(guò)靶向miR-205-5p并下調(diào)其表達(dá),從而促進(jìn)ZEB1的表達(dá)。

圖4 LINC00894與miR-205-5p和ZEB1的靶向關(guān)系

3 討論

隨著對(duì)癌癥機(jī)制的不斷深入研究,lncRNA作為癌癥的潛在生物標(biāo)志物,已逐漸成為極具吸引力的癌癥治療靶點(diǎn)[12-13]。課題組前期通過(guò)薈萃分析發(fā)現(xiàn)[14],lncRNA在胃腸道腫瘤中具有預(yù)后價(jià)值,有望成為新的腫瘤預(yù)后標(biāo)志物。近些年,多篇研究報(bào)道LINC00894在癌癥中扮演著癌基因的角色,其中包括腎癌[4-6]和乳腺癌[7]。然而,有報(bào)道[8]說(shuō)明LINC00894在抑制乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬耐藥的進(jìn)展方面也起到關(guān)鍵作用,此外,也有報(bào)道[9]說(shuō)明LINC00894在甲狀腺癌中同樣發(fā)揮抑癌作用。由此可見(jiàn),LINC00894的功能因腫瘤類(lèi)型而異,這可能與組織異質(zhì)性或基因的多功能性有關(guān)。

本研究中,LINC00894在胃癌中表達(dá)上調(diào),且LINC00894高表達(dá)的胃癌患者往往預(yù)后更差。此外,LINC00894低表達(dá)后,CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)表明LINC00894的敲低對(duì)胃癌細(xì)胞的活力和增殖能力具有明顯抑制作用;Transwell實(shí)驗(yàn)表明LINC00894的敲低對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力也具有顯著的抑制作用。相反,LINC00894基因的過(guò)表達(dá)得到相反的結(jié)果,此數(shù)據(jù)與過(guò)去的研究[7]結(jié)果一致。因此,本研究表明LINC00894對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。為了探究LINC00894調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制,本研究通過(guò)starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了“LINC00894/miR-205-5p/ZEB1”ceRNA調(diào)控機(jī)制,并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了LINC00894、miR-205-5p和ZEB1三者之間的調(diào)控關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LINC00894與miR-205-5p、miR-205-5p與ZEB1存在直接結(jié)合,且LINC00894與miR-205-5p存在負(fù)調(diào)控關(guān)系,LINC00894與ZEB1存在正調(diào)控關(guān)系。過(guò)去的研究[7-8]表明,在乳腺癌中,LINC00894可通過(guò)ceRNA調(diào)控機(jī)制競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miRNA,從而介導(dǎo)ZEB1的表達(dá),此結(jié)論與上述數(shù)據(jù)一致。由此說(shuō)明,在胃癌中,LINC00894可通過(guò)靶向miR-205-5p并下調(diào)其表達(dá),從而促進(jìn)ZEB1的表達(dá)。

綜上所述,LINC00894在胃癌中扮演癌基因的角色,且LINC00894可能通過(guò)調(diào)控miR-205-5p/ZEB1生物軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,然而,具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步證實(shí)。本研究有望為胃癌的靶向治療及預(yù)后預(yù)測(cè)提供新的線(xiàn)索。