脂多糖干預(yù)后的不同滑膜細(xì)胞來源炎性外泌體對軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制研究

周 俊,郭長青,王慶甫

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是由高齡、外傷、勞損、遺傳、肥胖等因素引起的慢性無菌性炎癥?；镜牟±磉^程包括軟骨降解和滑膜炎癥?；ぱ装Y可以出現(xiàn)于KOA病程的任意過程,且研究[1]表明,滑膜炎癥常作為軟骨炎癥的前兆癥狀,并且與軟骨退變、損傷、骨贅形成等臨床癥狀多呈正相關(guān)[2-3]。TLRs/NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與軟骨細(xì)胞的壞死、凋亡關(guān)系密切[4]。正常的膝關(guān)節(jié)滑膜組織由A型滑膜細(xì)胞(巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞,macrophage-like synoviocytes,MLS)、B 型滑膜細(xì)胞 (成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞, fibroblast-like synoviocytes,FLS)組成[5]。外泌體(exosomes) 是一種由細(xì)胞主動分泌到胞外的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡,其在細(xì)胞間信息交流、功能調(diào)控方面發(fā)揮巨大的作用[6]。該研究擬通過離體實驗觀察炎性環(huán)境下不同滑膜細(xì)胞來源外泌體對于軟骨細(xì)胞的影響,探討不同細(xì)胞來源炎性外泌體干預(yù)軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人成纖維樣滑膜細(xì)胞系、巨噬樣滑膜細(xì)胞系(上海ATCC細(xì)胞庫);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Bio-Rad公司);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美國Sigma公司);RYPSIN 0.25%胰酶(美國Invitrogen公司);外泌體提取收集試劑盒(北京恩澤康泰公司);烏磷酸(美國Sigma公司);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司);CCK-8 試劑(南京諾唯贊公司);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6 Elisa試劑盒(美國 abcam 公司) ;Toll樣受體4(Toll-like receptor4, TLR4)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、核因子κB抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase, IkK)、核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)、金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白基元5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5, ADAMTS5)單克隆抗體(美國 abcam 公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(美國 abcam 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1LPS誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞炎癥 將凍存的兩種滑膜細(xì)胞分別置于37 ℃水浴箱中,不時搖動使其迅速融化后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中并利用離心機(jī) 1 000 r/min離心5 min,吸棄上清液,加入適量含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗的無外泌體DMEM培養(yǎng)基重懸后,分別轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,置于5%CO2,飽和濕度90%的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代至3-4代后,各取2瓶FLS和MLS,加入新的含雙抗無外泌體培養(yǎng)基后,在其中1瓶FLS及MLS中分別加入5 μl LPS/PBS溶液(1 μg/ml),另外兩瓶滑膜細(xì)胞不做其余處理,干預(yù)24 h后收集兩種細(xì)胞的上清液;將正常的3-4代FLS和MLS以1 ∶4 的比例接種于同一培養(yǎng)瓶中,加入含雙抗無外泌體培養(yǎng)基,再加入5 μl LPS/PBS溶液(1 μg/ml)干預(yù),模擬KOA環(huán)境,24 h后收集細(xì)胞上清液,分別置于-80 ℃冰箱中凍存,用于后續(xù)實驗。

1.2.2用尺寸排阻加超濾法(SECF)提取細(xì)胞上清液中外泌體 將Exosupur柱固定在裝置架上,使柱內(nèi)溫度與室溫持平,打開柱子上下的封蓋回收封柱液,將15 ml離心管置于柱子下方,從柱子頂部加入PBS進(jìn)行沖洗,保持柱子濕潤,沖洗完成后將細(xì)胞上清液從柱子頂部加入,收集底部流出液,前1 500 μl不用收集,之后收集的成分即為外泌體成分,將所得外泌體置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3電鏡觀察兩種細(xì)胞外泌體形態(tài) 將10 μl外泌體重懸液滴加在電鏡的載樣銅網(wǎng)上,室溫下靜置5 min,用濾紙從側(cè)方將多余的液體吸干,滴加10 μl 4%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上,室溫負(fù)染5 min。濾紙吸干負(fù)染液,白熾燈下烤干后,于透射電子顯微鏡下觀察并在80 kV下成像。

1.2.4軟骨細(xì)胞提取與培養(yǎng) 軟骨組織取自于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的膝骨關(guān)節(jié)炎患者,患者對實驗過程完全知情并簽署知情同意書,收集術(shù)中取出的廢棄軟骨組織并立即送至實驗室進(jìn)行細(xì)胞提取。該研究已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會審查 (倫理號BZYSY-2019KYKTPJ-26)。

將術(shù)中取得的軟骨組織用含1%雙抗的PBS漂洗3次,用眼科手術(shù)剪將附著軟骨塊的軟組織剪除,再剪為1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片,加入約10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶,使軟骨碎片懸浮,放入5%CO2,飽和濕度90%的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜,用70 μm細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾后,1 000 r/min離心5 min,獲得軟骨細(xì)胞。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,加入含雙抗無外泌體培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),選取第3-4代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.5炎性滑膜細(xì)胞外泌體干預(yù)軟骨細(xì)胞 取3-4代軟骨細(xì)胞,分別置于5個培養(yǎng)瓶中,并標(biāo)記Ⅰ-Ⅴ。在5組培養(yǎng)瓶中分別等量加入含雙抗無外泌體培養(yǎng)基。將1.2.2中所得各組外泌體用生理鹽水制備成混懸液(濃度為1×107/ml)。第Ⅰ、Ⅱ組軟骨細(xì)胞中分別加入正常的MLS和FLS外泌體,第Ⅲ組加入2種細(xì)胞共培養(yǎng)的炎性外泌體,第Ⅳ、Ⅴ組加入分別加入炎性的MLS和FLS外泌體。各組干預(yù)24 h后,光鏡下觀察各組軟骨細(xì)胞形態(tài)。分別收集各組軟骨細(xì)胞及上清液并置于-80 ℃冰箱中凍存,用于后續(xù)實驗研究。

1.2.6CCK-8法檢測各組軟骨細(xì)胞活力 取3-4代軟骨細(xì)胞,計數(shù),用培養(yǎng)基使軟骨細(xì)胞懸浮,調(diào)整細(xì)胞濃度1×105個/ml,接種于96孔板,各孔加0.1 ml細(xì)胞懸液,分為5組,分別加入對應(yīng)的外泌體混懸液：第Ⅰ、Ⅱ組軟骨細(xì)胞中分別加入正常的MLS和FLS外泌體,第Ⅲ組加入兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的炎性外泌體,第Ⅳ、Ⅴ組加入分別加入炎性的MLS和FLS外泌體。放入恒溫培養(yǎng)箱中過夜,用倒置相差顯微鏡觀察各組軟骨細(xì)胞形態(tài)。向每組孔中加入10 μl CCK-8溶液,放入恒溫孵育箱中再次孵育3 h后使用酶聯(lián)免疫檢測儀在 450 nm雙波長處測得相應(yīng)吸光度值(absorbance,A)。

1.2.7ELISA法檢測各組軟骨細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平 將各組軟骨細(xì)胞上清液室溫解凍搖勻后,ELISA法檢測其中中TNF-α、IL-1β、IL-6水平,按照試劑盒操作步驟執(zhí)行,每個指標(biāo)設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.8Western blot法檢測軟骨細(xì)胞中TLR4、NF-kB、IkK、IκB、ADAMTS5蛋白的表達(dá) 收集各組軟骨細(xì)胞,用PBS洗滌細(xì)胞沉淀3次,1 000 r/min離心5 min,吸棄上清液后加入0.2 ml的蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合液;4 ℃低溫離心機(jī)12 000 r/min離心15 min后,取上清液置于新EP管中,標(biāo)記分組。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定,取適量蛋白進(jìn)行電泳,電泳完成后進(jìn)行電轉(zhuǎn),將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫下將膜完全浸沒在3% BSA-TBST中輕搖30 min。用3% BSA-TBST稀釋(1 ∶1 000)一抗,參照TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5及內(nèi)參β-actin等抗體說明書進(jìn)行一抗標(biāo)記,TBST清洗4次后,加入3% BSA-TBST稀釋(1 ∶1 000)后的二抗室溫孵育1 h,最后加入ECL試劑后顯影。

2 結(jié)果

2.1 電鏡下觀察兩種滑膜細(xì)胞外泌體形態(tài)電鏡下可見兩種外泌體均為顆粒直徑為30～150 nm范圍內(nèi)的圓形或橢圓形膜性微囊泡結(jié)構(gòu),內(nèi)含有致密的云狀物質(zhì),為外泌體內(nèi)容物。

圖1 電鏡下觀察兩種滑膜細(xì)胞外泌體形態(tài) ×500

2.2 各組軟骨細(xì)胞的生長形態(tài)顯微鏡下觀察正常外泌體干預(yù)的兩組軟骨細(xì)胞多為圓形、橢圓形及短梭形,貼壁生長,與未經(jīng)干預(yù)的正常軟骨細(xì)胞形態(tài)基本相似;炎性外泌體干預(yù)的三組軟骨細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則型,有較多的懸浮壞死細(xì)胞,細(xì)胞密度低于另外兩組。見圖2。

圖2 各組軟骨細(xì)胞生長形態(tài) ×10

2.3 各組軟骨細(xì)胞A值Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組軟骨細(xì)胞活力低于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ組細(xì)胞活力幾乎沒有差異。Ⅳ組細(xì)胞活力最低,Ⅲ組細(xì)胞活力高于Ⅳ組但低于V組(P<0.05)。見表1。

表1 各組軟骨細(xì)胞A值

2.4 各組軟骨細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平Ⅰ、Ⅱ兩組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平?jīng)]有差異;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于Ⅰ、Ⅱ兩組(P<0.05);Ⅲ組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于Ⅳ組(P<0.05),但低于V組(P<0.05)。見表2。

表2 Elisa法檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

2.5 各組軟骨細(xì)胞中TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5的表達(dá)量Ⅰ、Ⅱ兩組軟骨細(xì)胞TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5的蛋白表達(dá)量沒有差異;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組軟骨細(xì)胞TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5的蛋白表達(dá)量高于Ⅰ、Ⅱ兩組(P<0.05);Ⅲ組軟骨細(xì)胞TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5的蛋白表達(dá)量高于Ⅳ組(P<0.05),但低于Ⅴ組(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 各組軟骨細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)量與actin比值

圖3 Western blot檢測各組軟骨細(xì)胞TLRs/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)印跡圖

3 討論

KOA是一種以滑膜炎癥、軟骨退變?yōu)橹饕±碜兓耐诵行约膊6-10]?；ぱ装Y導(dǎo)致滑膜細(xì)胞釋放的炎性因子和基質(zhì)蛋白酶是誘發(fā)軟骨炎癥、加重軟骨損傷的重要因素[11]。人體膝關(guān)節(jié)滑膜組織主要由MLS和FLS兩種細(xì)胞組成。MLS是來源于骨髓的巨噬細(xì)胞通過循環(huán)系統(tǒng)遷徙至滑膜下層,約占滑膜細(xì)胞總數(shù)的約20%,它可以吞噬關(guān)節(jié)腔內(nèi)碎屑、異物并釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子。FLS占滑膜細(xì)胞總數(shù)的約80%,它具有分泌透明質(zhì)酸,合成膠原蛋白及分泌產(chǎn)生基質(zhì)蛋白酶的功能[12]。外泌體攜帶有來自細(xì)胞的蛋白,脂質(zhì)及核酸等物質(zhì)。在細(xì)胞間信息交流和細(xì)胞功能調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用[13]。不同細(xì)胞來源的外泌體具備不同的特點和功能。觀察不同滑膜細(xì)胞來源的外泌體在炎癥過程中的特點和功能差異,有助于進(jìn)一步研究KOA的病理過程和治療方法。TLRs/NF-κB信號通路可以調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)滑膜及軟骨細(xì)胞產(chǎn)生免疫和炎癥反應(yīng)。一般狀態(tài)下,NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IκB)結(jié)合成二聚體結(jié)構(gòu)而處于活性抑制狀態(tài)。在KOA中,由于軟骨損傷或退化產(chǎn)生體內(nèi)損傷相關(guān)分子模式( DAMPs)和炎性因子,Toll樣受體是一類重要的模式識別受體(如TLR2、TLR4等),其可通過識別DAMPs而激活,并使得IkK活化,該激酶可以激活I(lǐng)κB,使其從二聚體上解離,激活NF-κB信號通路。產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α等下游因子,引起滑膜和軟骨炎癥,同時產(chǎn)生MMP-13和ADAMTs等可以使軟骨外基質(zhì)降解,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞壞死[14]。

本研究中三組炎性外泌體干預(yù)后的軟骨細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞變形,懸浮,壞死的情況。說明炎性滑膜細(xì)胞外泌體可以影響軟骨細(xì)胞活力。用CCK-8法觀察各組軟骨細(xì)胞活力,三組炎性外泌體干預(yù)組的軟骨細(xì)胞活力比正常外泌體干預(yù)后的軟骨細(xì)胞差,兩種滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)后的炎性外泌體干預(yù)后的軟骨細(xì)胞活力高于炎性FLS外泌體而低于炎性MLS外泌體。ELISA法和Western blot法檢測結(jié)果亦顯示三組炎性外泌體組均可激活軟骨細(xì)胞中TLRs/NF-κB信號通路并產(chǎn)生炎性因子,其中兩種滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)后的炎性外泌體致炎效果強(qiáng)于FLS外泌體而弱于MLS外泌體。在KOA中兩種滑膜細(xì)胞均會產(chǎn)炎性因子,其中FLS還會一些抗炎因子如前列腺素和血管內(nèi)皮生長因子等,同時巨噬細(xì)胞可以根據(jù)微環(huán)境的變化由具有促炎作用的M1型轉(zhuǎn)化為具有生抗炎和組織修復(fù)作用的M2型[15]。有研究[16-17]通過成纖維細(xì)胞與巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng),顯示巨噬細(xì)胞的促炎因子釋放得到抑制,這可能是由于成纖維細(xì)胞體表的CD14+蛋白的中和作用導(dǎo)致的。在本實驗中,兩種細(xì)胞共培養(yǎng)后MLS外泌體的致炎作用得到一定抑制,可能由于FLS外泌體對于MLS的炎性因子釋放和M1、M2兩種亞型的轉(zhuǎn)變有一定的調(diào)控作用,有待進(jìn)一步的實驗驗證。總之在KOA的炎癥過程,兩種細(xì)胞之間既可以相互促進(jìn)炎癥釋放,又可互相抑制其致炎作用,處于促炎與抗炎的動態(tài)平衡中,而外泌體在兩種細(xì)胞的信息交流中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述,在KOA疾病進(jìn)展過程中,兩種滑膜細(xì)胞來源外泌體均可通過調(diào)控軟骨TLRs/NF-κB信號通路,促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解,加重軟骨退變。兩種細(xì)胞通過其外泌體進(jìn)行細(xì)胞間信號交流,既可以相互促進(jìn)又會抑制致炎效果。本實驗為KOA的機(jī)制研究和臨床用藥開發(fā)提供了新的途徑和思路。