大麻素2型受體在加速正畸牙移動(dòng)中的作用

范登瑩,翟浩嫣,劉慧娟,趙 圓,李東娜,喬 星,康文靜,朱德超,劉春艷

亞洲人錯(cuò)合畸形發(fā)病率高達(dá)48%[1],目前臨床上正畸療程長達(dá)2年。隨著生活節(jié)奏加快,越來越多的患者要求縮短正畸治療療程。因此,加速正畸牙齒移動(dòng)(orthodontic tooth movement, OTM)逐漸成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)。臨床上主要通過手術(shù)加速OTM,但適應(yīng)證嚴(yán)格,存在不確定性、風(fēng)險(xiǎn)高等缺點(diǎn)。因此有必要研究調(diào)控破骨進(jìn)程的有效靶點(diǎn),加速正畸速率,縮短矯治療程。牙齒移動(dòng)速度取決于破骨細(xì)胞數(shù)量和牙槽骨吸收活性。目前研究[2]表明大麻素2型受體(cannabinoid receptor 2, CB2)可能通過負(fù)調(diào)控破骨細(xì)胞在牙槽骨吸收過程中發(fā)揮作用。CB2主要分布于外周與免疫細(xì)胞,與骨代謝有關(guān)。研究[3]證明當(dāng)CB2缺乏時(shí),破骨細(xì)胞數(shù)量增加和功能增強(qiáng), CB2基因敲除的中年小鼠牙槽骨密度顯著下降[4]。然而CB2在OTM過程中的影響尚不清楚,因此,該研究擬通過建立CB2-/-小鼠OTM模型,觀察CB2在正畸過程中對OTM速率和壓力區(qū)牙槽骨吸收的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)CB2-/-小鼠購自北京集萃藥康生物科技有限公司?；贑RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建C57BL/6J 品系 CB2基因敲除小鼠,與C57BL/6品系WT小鼠交配,獲得子代雜合子,然后使用子代雜合子互配獲取足量純合子和同窩野生小鼠用作實(shí)驗(yàn)鼠。所有小鼠都飼養(yǎng)在無病原體條件下。SPF房溫度設(shè)定為(23±3)℃,保持相對濕度(60±5)%,維持標(biāo)準(zhǔn)的 12 h明暗循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案通過河北醫(yī)科大學(xué)科研倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：20220301)。每鼠籠CB2+/-雄鼠與CB2+/-雌鼠以1 ∶2配繁,仔鼠出生3周到4周期間進(jìn)行斷奶、基因型鑒定和分籠。

1.1.2主要試劑及儀器 基因組 DNA 提取試劑盒(DP304,天根,北京),TAE(ZS205-3,莊盟,北京),瓊脂糖(1613102EDU,伯樂,美國),核酸染料(ZS-M18006,中實(shí)同創(chuàng),天津),DL2000 DNA Ladder(M0046,LifeSct LLC,美國),SYBR Green PCR 預(yù)混液(ZS-M13002,莊盟,北京),DNA上樣緩沖液(D0071,碧云天,上海),流動(dòng)性光固化樹脂(3M ESPE,美國),酸蝕劑(3M ESPE,美國),4% 多聚甲醛(P0099,碧云天,上海),蘇木精-伊紅染色液(BA4025,貝索,珠海),抗酒石酸鹽酸性磷酸酶試劑盒(CR2107063,塞維爾生物,武漢),抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9抗體(ARG40613,Arigobio,上海),Tween 20(ZLI-9309,中杉金橋,北京),兔二步法試劑盒(PV-6001,中杉金橋,北京),戊巴比妥鈉(Merck,美國),伯樂梯度PCR儀(T100 Thermal Cycle,伯樂,美國),三恒多用電泳儀(DYY-6D,北京六一,北京),凝膠成像系統(tǒng)(G：BOX,Syngene,英國),正畸鎳鈦彈簧(CS-12-9,埃蒙迪,上海),正畸不銹鋼結(jié)扎絲(2.0,康橋,上海)。

1.2 方法

1.2.1小鼠基因分型 提取3周～4周齡仔鼠尾(0.5～1 cm )基因組DNA,根據(jù)北京集萃藥康提供的序列(表1),進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳,化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)分析條帶大小。擴(kuò)增產(chǎn)物只有294 bp左右條帶為CB2-/-小鼠;只有392 bp左右條帶為WT小鼠;擴(kuò)增產(chǎn)物有294 bp和392 bp左右2條電泳條帶則為CB2雜合型小鼠(CB2+/-)(圖1)。

圖1 小鼠Cnr2基因PCR產(chǎn)物電泳圖

表1 引物信息

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 選取體質(zhì)量22～23 g的CB2-/-和同窩WT鼠雄性小鼠各30只,6周齡時(shí)建模,WT小鼠作為對照組,CB2-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)組,接受牙移動(dòng)裝置,建模時(shí)間分別為0、3、7、14和21 d;2種基因型的0 d組(n=6)小鼠均作為陰性對照,不做任何處理。

1.2.3建模方法 腹腔注射戊巴比妥鈉(0.008 ml/g)麻醉小鼠。經(jīng)正畸鎳鈦螺旋拉簧(絲徑0.3 mm)的一端通過0.2 mm不銹鋼結(jié)扎絲固定于左側(cè)上頜第一磨牙上,另一端通過流動(dòng)性修復(fù)樹脂直接粘結(jié)到上頜切牙上,固定的結(jié)扎絲兩端之間共計(jì)8圈彈簧,使用測力計(jì)準(zhǔn)確測量裝置力值,施力裝置在30～40 ℃之間,提供恒定且持續(xù)的約20 g的力值,實(shí)驗(yàn)期間不需要重新激活[5],上頜第一磨牙近中移動(dòng)(圖2)。所有小鼠術(shù)后均給予軟食,術(shù)后每天檢查施力裝置在模型鼠口內(nèi)狀態(tài)。

圖2 小鼠牙移動(dòng)模型口內(nèi)圖

1.2.4牙移動(dòng)距離測量 在實(shí)驗(yàn)的第0、3、7、14和21天,樣本選取左側(cè)上頜牙槽骨和牙在內(nèi)的橫斷區(qū)域,使其根方橫斷面垂直于上頜合平面,獲取體視顯微鏡圖片,使用Image J軟件,測量圖片中左側(cè)上頜第二磨牙測量圖片中左側(cè)上頜第二磨牙近中邊緣嵴的中點(diǎn)至第一磨牙近中邊緣嵴的中點(diǎn)之間的距離,然后減去第一磨牙近遠(yuǎn)中徑,獲得牙移動(dòng)距離。

1.2.5組織學(xué)觀察 HE染色觀察第一磨牙遠(yuǎn)中根牙周膜和壓力側(cè)牙槽骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)。Image J測量第一磨牙遠(yuǎn)中根壓力側(cè)牙周膜寬度,通過自第一磨牙遠(yuǎn)中根近中最凸點(diǎn)(根中1/3區(qū)域內(nèi))作垂直于遠(yuǎn)中根的延長線,獲得該線延長至第一磨牙遠(yuǎn)中根壓力側(cè)牙槽骨的距離。TRAP染色統(tǒng)計(jì)左側(cè)上頜第一磨牙遠(yuǎn)中根壓力區(qū)附著于硬骨板表面凹陷的TRAP(+)破骨細(xì)胞數(shù)量。MMP-9抗原免疫組化染色統(tǒng)計(jì)左側(cè)上頜第一磨牙遠(yuǎn)中根壓力區(qū)MMP-9的陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建CB2-/-和WT小鼠OTM模型模型鼠術(shù)后健康,無基因型差異,每種基因型納入30只OTM手術(shù)成功模型。

2.2 牙移動(dòng)距離測定OTM 距離增加與施力時(shí)間呈正比,3 d組的OTM 距離最小,21 d組的OTM 距離最大。牙移動(dòng)3、7、14和21 d組中,CB2-/-小鼠牙移動(dòng)距離均較WT小鼠增加(圖3、表2),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。

圖3 不同時(shí)間兩組小鼠的牙移動(dòng)距離

表2 牙移動(dòng)距離分析

2.3 組織學(xué)改變0天WT小鼠牙周膜纖維排列正常,牙槽骨硬骨板清晰完整,骨小梁交織成網(wǎng)狀,CB2-/-小鼠骨小梁較WT小鼠稀疏。OTM 3 d時(shí)近遠(yuǎn)中牙周膜間隙寬度不一致,在壓力側(cè)變窄,張力側(cè)變寬,兩種基因型OTM小鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OTM 7和14 d時(shí)CB2-/-小鼠壓力區(qū)牙周膜間隙寬度大于WT小鼠(圖4、圖5、表3)。

圖4 OTM牙周組織變化 HE×200

圖5 第一磨牙遠(yuǎn)中根壓力區(qū)牙周膜寬度分析

表3 第一磨牙遠(yuǎn)中根壓力區(qū)牙周膜寬度分析

2.4 牙移動(dòng)壓力區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)量觀察破骨細(xì)胞位于壓力區(qū)硬骨板骨吸收陷凹內(nèi)呈酒紅色陽性顆粒。0 d組2種基因型小鼠的第一磨牙遠(yuǎn)中根壓力區(qū)硬骨板均無破骨細(xì)胞。OTM 組3 d時(shí) WT和CB2-/-小鼠的壓力區(qū)硬骨板上出現(xiàn)了少量破骨細(xì)胞。OTM 組7 d時(shí)2種基因型小鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量與3 d組相比均增加,且CB2-/-小鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量大于WT小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。OTM 組14 d時(shí)CB2-/-小鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量大于WT小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。但14和21 d時(shí)CB2-/-小鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量變化不大,表明在14 d時(shí)CB2-/-小鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值;而WT小鼠在第21天時(shí)數(shù)量達(dá)到最大值(圖6、圖7、表4)。

圖6 TRAP染色結(jié)果 ×200

圖7 OTM壓力區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)量分析

表4 OTM壓力區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)量分析

2.5 牙移動(dòng)壓力區(qū)破骨細(xì)胞的早期募集和破骨活性觀察MMP-9(+)單核細(xì)胞晚期前體多位于牙周膜間隙,呈深黃棕色著色;MMP-9(+)多核細(xì)胞多位于硬骨板骨吸收陷凹內(nèi)多核且胞質(zhì)呈深黃棕色著色,有時(shí)可見明顯偽足(圖8)。0 d組CB2-/-小鼠的壓力區(qū)牙周膜區(qū)域MMP-9(+)單核細(xì)胞數(shù)量有大于WT小鼠的趨勢,但2種基因型小鼠均未見MMP-9(+)多核細(xì)胞。3和7 d時(shí)WT型和CB2-/-單核細(xì)胞和多核細(xì)胞數(shù)量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OTM 組14 d時(shí),CB2-/-小鼠的MMP-9(+)單核細(xì)胞和兩種基因型的多核細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值,且CB2-/-小鼠的MMP-9(+)單核細(xì)胞和多核細(xì)胞數(shù)量均大于WT小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表5、6)。

圖8 OTM 壓力區(qū)MMP-9(+)單核細(xì)胞和MMP-9(+)多核細(xì)胞數(shù)量

表5 MMP-9(+)單核細(xì)胞數(shù)量

表6 MMP-9(+)多核細(xì)胞數(shù)量

3 討論

研究顯示正畸力值達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí),破骨細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)峰值,更大的力值則不會(huì)增加牙齒移動(dòng)距離且引起牙根吸收[6]。為獲最佳牙移動(dòng)和破骨細(xì)胞募集,所有加力裝置均采用20 g力值。螺旋彈簧模型提供恒定和連續(xù)的力,防止牙周炎樣組織反應(yīng),對建模牙齒的牙周組織的干擾最小[7]。為盡可能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化OTM模型,本研究使用精心設(shè)計(jì)的鎳鈦彈簧的施力裝置。機(jī)械刺激有助于破骨細(xì)胞活化和骨吸收,但長期的機(jī)械刺激骨吸收程度反而下降[8]。研究[9]顯示OTM過程中牙槽骨阻力增加,3周后的大鼠牙齒移動(dòng)減緩。本研究選擇觀察3周內(nèi)的OTM模型。結(jié)果表明OTM模型成功建立,未發(fā)現(xiàn)明顯的牙根吸收和牙周炎癥,3周的觀察時(shí)間比較合理。CB2屬G-蛋白偶聯(lián)受體,其配體結(jié)合部位是7個(gè)跨膜螺旋相互作用形成的中央核心。CB2激活后,通過跨膜區(qū)的構(gòu)象變化,將生化信息傳遞到細(xì)胞內(nèi),從而引發(fā)一系列生理活動(dòng),參與骨代謝[2],在牙周組織中廣泛表達(dá),包括連接上皮、牙齦結(jié)締組織、牙周膜和牙槽骨表面[10]。牙移動(dòng)速率是決定正畸治療療程的直接決定因素,縮短正畸治療周期的關(guān)鍵在于加速OTM,而壓力側(cè)牙周組織改建是OTM限速的關(guān)鍵,本研究主要關(guān)注CB2對正畸牙齒移動(dòng)速率的影響,觀察小鼠CB2基因敲除后在正畸力作用下壓力側(cè)牙周組織的改變。結(jié)果顯示CB2-/-小鼠牙移動(dòng)距離和壓力區(qū)牙周膜間隙寬度均較WT小鼠增加,提示CB2與牙齒移動(dòng)速率相關(guān)。此外,Konermann et al[11]發(fā)現(xiàn)牙周膜細(xì)胞連續(xù)拉伸 20%的狀態(tài)下,在第48 小時(shí),CB2 的蛋白表達(dá)下調(diào)。錢紅 等[12]發(fā)現(xiàn)CB2抑制可下調(diào)牙周膜細(xì)胞中機(jī)械牽張力引起的成骨基因高表達(dá)。以上研究表明CB2表達(dá)受機(jī)械力的影響,且在骨改建中起重要作用。因此,結(jié)合所有研究,推測CB2缺失通過促進(jìn)骨改建,最終加速OTM。OTM 壓力側(cè)骨吸收是決定OTM速度的限速步驟,而OTM 壓力側(cè)的破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收活性決定骨吸收速度。TRAP是破骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶,特異性分布于破骨細(xì)胞中。本研究中,OTM CB2-/-小鼠的TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量上調(diào),表明CB2缺失影響破骨細(xì)胞的活性。Ofek et al[13]發(fā)現(xiàn)激活CB2通過促進(jìn)成骨前體細(xì)胞有絲分裂擴(kuò)大前成骨細(xì)胞數(shù)量,同時(shí)通過減少破骨前體細(xì)胞有絲分裂,抑制破骨細(xì)胞分化,以此參與骨重建過程。有研究[4]發(fā)現(xiàn)CB2缺乏可通過上調(diào)破骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞數(shù)量導(dǎo)致牙槽骨低骨量表型。本研究結(jié)果與之基本一致,因此推測CB2缺失通過促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化,增加破骨細(xì)胞數(shù)目和骨吸收活性,加速壓力側(cè)骨吸收。MMP-9是一種前體和成熟破骨細(xì)胞的標(biāo)志物,在OTM壓力區(qū)組織中高表達(dá)[7],機(jī)械力誘導(dǎo)的骨吸收過程促進(jìn)破骨細(xì)胞的早期募集及提高骨吸收活性[14]。本研究結(jié)果提示CB2-/-小鼠較WT小鼠有更明顯的破骨細(xì)胞的早期募集。Zhu et al[15]發(fā)現(xiàn)CB2激動(dòng)劑可抑制骨髓來源破骨細(xì)胞前體的分化和破骨能力,下調(diào)MMP-9和TRAP的表達(dá)。提示CB2缺失通過促進(jìn)機(jī)械刺激性破骨細(xì)胞的早期募集及提高骨吸收活性促進(jìn)壓力側(cè)骨吸收。綜上,CB2缺失通過促進(jìn)機(jī)械刺激性破骨細(xì)胞的早期募集及提高骨轉(zhuǎn)換促進(jìn)正畸牙齒移動(dòng),但是其中參與的信號(hào)通路還有待于進(jìn)一步研究。

CB2積極參與正畸牙移動(dòng)過程,CB2缺失通過調(diào)節(jié)機(jī)械刺激性破骨過程參與正畸骨吸收過程,提高牙移動(dòng)速率。提示靶向干預(yù)CB2的表達(dá)或可為正畸牙齒移動(dòng)的精準(zhǔn)干預(yù)的潛在靶點(diǎn)提供新的思路和線索,同時(shí)為臨床上加速牙移動(dòng)和縮短正畸療程提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。本研究尚有不足,僅從功能表型層面探討CB2缺失在加速牙移動(dòng)中的作用,應(yīng)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn),從分子、細(xì)胞、組織等不同級(jí)別進(jìn)一步探究該作用背后的具體機(jī)制。