基于PARP1信號(hào)通路研究芒柄花素對(duì)糖氧剝奪/復(fù)氧復(fù)糖神經(jīng)元細(xì)胞損傷的影響

郁 麗,王 湄,王文秀,曹麗平,何前松1,

臨床上治療腦梗死常用溶栓恢復(fù)血供,但恢復(fù)血供后,過量的自由基攻擊神經(jīng)元細(xì)胞,造成缺血/再灌注損傷[1]。芒柄花素是藥用植物錦雞兒的主要活性成分-異黃酮類成分[2]。課題組前期研究顯示該類成分對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用,也有研究報(bào)道芒柄花素具有抗炎、抗氧化和抗癌作用[3-4],并且在多種神經(jīng)疾病中具有保護(hù)特性,如阿爾茨海默病[5]、創(chuàng)傷性腦損傷[6]、焦慮和抑郁[7]等。然而,芒柄花素在細(xì)胞糖氧剝奪/復(fù)氧復(fù)糖(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)損傷的作用還有待深入研究。多聚ADP核糖聚合酶1[poly (ADP-ribose) polymerase 1,PARP1]可由DNA損傷激活,能促進(jìn)聚合物PAR的形成。在腦缺血再灌注大鼠模型中,抑制PARP1和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)核易位可抑制神經(jīng)細(xì)胞的死亡[8],但是,芒柄花素在PARP1信號(hào)通路的作用尚不清楚。因此,本研究通過建立OGD/R細(xì)胞損傷模型,基于PARP1通路探究芒柄花素在OGD/R損傷中的作用,為運(yùn)用錦雞兒異黃酮治療腦缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑芒柄花素(HY-N0183,MedChemExpress,美國);PARP1抑制劑PJ34(HY-13688A,MedChemExpress,美國);PARG抑制劑Ethacridine lactate(HY-B2174,MedChemExpress,美國);RIPA細(xì)胞裂解液(C1053,北京普利萊基因技術(shù)有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(E-BC-K318-M,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);P53抗體(AF0879,江蘇親科生物研究中心有限公司);AIF抗體(17984-1-AP,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);β-Actin抗體(HC201,北京全式金生物技術(shù)有限公司);PARP1抗體(13371-1-AP,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);PARG抗體(DF13517,江蘇親科生物研究中心有限公司);Iduna抗體(bs-11669R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司);Cy3 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(AS008,武漢愛博泰克生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和糖氧剝奪/復(fù)氧復(fù)糖小鼠HT22神經(jīng)元細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司,CL-0697)在添加10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和1%P/S的DMEM培養(yǎng)基中,并在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)基。將HT22細(xì)胞接種24 h后進(jìn)行OGD/R實(shí)驗(yàn)。將HT22細(xì)胞原培養(yǎng)基棄去,用無糖培養(yǎng)基洗滌數(shù)次后更換為無糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37°C、1%O2、94%N2和5%CO2,進(jìn)行糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)6 h后,更換為正常培養(yǎng)基在95%空氣和5% CO2中37 ℃進(jìn)行復(fù)氧復(fù)糖1、2、3、24 h。采用Western blot檢測(cè)復(fù)氧不同時(shí)間(1、2、3、24 h)后細(xì)胞內(nèi)PARP1和PARG蛋白表達(dá)情況,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件;確定OGD/R時(shí)間點(diǎn)后,設(shè)置6個(gè)組,分別為對(duì)照組、對(duì)照組+芒柄花素組、OGD/R組、OGD/R+芒柄花素組、OGD/R+PJ34組、OGD/R+PARG抑制劑組;對(duì)照組HT22細(xì)胞正常培養(yǎng),不進(jìn)行OGD/R處理。OGD/R+芒柄花素(10 μmol/L)、OGD/R+PJ34(10 μmol/L)和OGD/R+Ethacridine lactate(7.5 μmol/L)處理組在OGD/R后進(jìn)行加入對(duì)應(yīng)濃度藥物進(jìn)行孵育。

1.3 免疫熒光各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,細(xì)胞于培養(yǎng)皿中用4%多聚甲醛固定,PBS洗滌,每次5 min,PBS浸洗培養(yǎng)皿3次,每次5 min,移液槍吸干PBS,在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5% BSA,37度封閉30 min;棄封閉液,培養(yǎng)皿加入的稀釋好的一抗(P53、AIF,1 ∶200),4 ℃孵育過夜;PBS洗滌,加入稀釋好的熒光二抗Cy3(1 ∶200),37 ℃孵育30 min,PBS浸洗培養(yǎng)皿3次,每次5 min;滴加DAPI避光孵育5 min,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核,用流水沖洗多余的DAPI;用50%甘油封閉培養(yǎng)皿,然后在熒光顯微鏡(奧林巴斯CKX53倒置熒光顯微鏡,北京瑞科中儀科技有限公司)下觀察細(xì)胞采集圖像。

1.4 Western blot檢測(cè)取各組細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,用RIPA裂解液提取總蛋白,12 000 r/min高速離心機(jī)4 ℃離心10 min,取上清液,BCA蛋白定量試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。對(duì)蛋白樣品進(jìn)行變性后,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)1.5 h,后用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。PVDF膜(Merck millipore)用脫脂奶粉封閉后,與一抗(AKT、p-AKT、PARP1、PARG、Iduna)4 ℃孵育過夜,次日PVDF膜室溫孵育二抗2 h,用發(fā)光液浸濕PVDF膜,置于超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯影。使用Image J軟件用密度法定量蛋白條帶灰度值,計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-Actin)灰度值的比值均值或磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白灰度值的比值均值,進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 OGD/R可誘導(dǎo)HT22細(xì)胞PARP1通路激活為了評(píng)價(jià)OGD/R對(duì)HT22細(xì)胞PARP1通路的影響,采用Western blot檢測(cè)復(fù)氧不同時(shí)間(1、2、3、24 h)后細(xì)胞內(nèi)PARP1和PARG蛋白表達(dá)情況。如圖1所示,在小鼠神經(jīng)元HT22細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,進(jìn)行糖氧剝奪6 h后再進(jìn)行復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)1、2、3 h細(xì)胞中PARG表達(dá)升高(P<0.05),復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)3 h和24 h時(shí)細(xì)胞中PARP1表達(dá)升高(P<0.05)。綜合來看,在OGD/R 3 h時(shí),HT22細(xì)胞中PARP1/PARG通路激活最明顯,后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件確定為OGD/R 3 h。

圖1 Western blot檢測(cè)HT22細(xì)胞OGD/R不同時(shí)間PARP1和PARG蛋白表達(dá)水平

2.2 芒柄花素及PARP1通路抑制劑處理對(duì)HT22細(xì)胞OGD/R損傷后P53和AIF表達(dá)影響免疫熒光結(jié)果如圖2所示,DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色,陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光。與對(duì)照組相比,芒柄花素組細(xì)胞中p53和AIF表達(dá)無明顯差異變化,OGD/R組細(xì)胞中p53和AIF表達(dá)均升高(P<0.05);而在OGD/R后加入芒柄花素、PARP1抑制劑PJ34、PARG抑制劑Ethacridine lactate孵育后,HT22細(xì)胞中AIF、p53表達(dá)下降。這表明芒柄花素、PARP1抑制劑PJ34、PARG抑制劑Ethacridine lactate均可降低OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞中AIF、p53表達(dá)(免疫熒光量化分析見圖3)。

圖2 免疫熒光檢測(cè)HT22細(xì)胞P53、AIF蛋白表達(dá)情況 ×400

圖3 免疫熒光檢測(cè)HT22細(xì)胞P53、AIF蛋白表達(dá)差異性分析

2.3 芒柄花素對(duì)HT22細(xì)胞OGD/R損傷后PARP1通路的影響如圖4所示,與對(duì)照組相比,HT22細(xì)胞經(jīng)OGD/R后,細(xì)胞中AKT蛋白磷酸化比值下降(P<0.05),Iduna蛋白表達(dá)下降(P<0.05),PARG和PARP1蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。與OGD/R組細(xì)胞相比,在OGD/R后加入芒柄花素或PARG抑制劑Ethacridine lactate孵育后,細(xì)胞中AKT蛋白磷酸化比值上升(P<0.05),Iduna蛋白表達(dá)上升(P<0.05),PARG和PARP1蛋白表達(dá)量均下降(P<0.05);細(xì)胞OGD/R后加入PARP1抑制劑PJ34孵育,細(xì)胞中p-AKT和Iduna蛋白表達(dá)量上升(P<0.05),而PARG和PARP1蛋白表達(dá)量均下降(P<0.05)。這表明芒柄花素可通過抑制PARP1/PARG通路對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷進(jìn)行保護(hù)。

圖4 Western blot檢測(cè)芒柄花素對(duì)HT22細(xì)胞OGD/R損傷后PARP1/PARG通路蛋白表達(dá)影響

3 討論

本研究中,PARP1在OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。PARP1及PARG在OGD/R條件下均上調(diào),在復(fù)氧復(fù)糖3 h時(shí)達(dá)到高峰,但在24 h,PARG表達(dá)發(fā)生回降。在OGD/R后使用芒柄花素、PARP1抑制劑PJ34或PARG抑制劑Ethacridine lactate孵育細(xì)胞,均可有效抑制HT22細(xì)胞OGD/R損傷后凋亡因子P53和AIF表達(dá),并抑制PARP1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。表明芒柄花素可通過抑制PARP1信號(hào)通路參與HT22小鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

PARP1是多聚ADP核糖聚合酶的一種,主要負(fù)責(zé)DNA鏈缺口和斷鏈輕度激活后染色體DNA修復(fù),然而,過度活化的PARP1可以將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)轉(zhuǎn)化為長PAR聚合物,從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)后產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用,PAR聚合物可誘導(dǎo)AIF從線粒體外膜池釋放,加劇細(xì)胞凋亡的聯(lián)級(jí)反應(yīng),同時(shí)多聚ADP核糖甘油水解酶PARG將ADP核糖從蛋白上降解[9]。PARP1在缺血再灌注表達(dá)后上調(diào),抑制PARP1信號(hào)通路對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[10]。在本研究中,OGD/R誘導(dǎo)的HT22小鼠神經(jīng)元細(xì)胞中PARP1在復(fù)氧復(fù)糖3、24 h后均升高,PARG在OGD/R條件下以時(shí)間依賴性上調(diào),但在24 h表達(dá)下降(圖1),故本研究選擇OGD/R 3 h作為后續(xù)研究實(shí)驗(yàn)條件。另外,本研究中在OGD/R條件下,HT22細(xì)胞中除了PARP1和PARG被激活,凋亡誘導(dǎo)因子AIF和P53表達(dá)升高,而芒柄花素與PARP1抑制劑PJ34和PARG抑制劑Ethacridine lactate效果一致,均抑制了PARP1和PARG,同時(shí)部分逆轉(zhuǎn)了AIF和P53的累積,而挽救了細(xì)胞的凋亡。這表明芒柄花素可通過抑制PARP1和PARG激活而抑制OGD/R誘導(dǎo)的HT22小鼠神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Iduna是一種PAR聚合物依賴的E3泛素連接酶,調(diào)節(jié)DNA損傷,Iduna對(duì)PARP1的OAR依賴泛素化靶向其進(jìn)行蛋白酶體降解,通過PAR結(jié)合和泛素E3連接酶活性,Iduna保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[11]。Iduna可通過抑制PARP1誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡來保護(hù)HT22細(xì)胞免受過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[12]。本研究顯示在OGD/R條件下,HT22細(xì)胞中Iduna蛋白表達(dá)水平下降,經(jīng)芒柄花素或PARG抑制劑Ethacridine lactate孵育后可部分逆轉(zhuǎn),但PARP1抑制劑PJ34卻沒有這種效果。這表明芒柄花素是通過上調(diào)Iduna來抑制OGD/R誘導(dǎo)的PARP1表達(dá)而減輕HT22小鼠神經(jīng)元細(xì)胞損傷。

有研究[13]說明芒柄花素通過激活A(yù)KT磷酸化蛋白介導(dǎo)對(duì)大鼠腦缺血/再灌注的神經(jīng)保護(hù)作用,本研究結(jié)果與之一致。本研究顯示芒柄花素處理OGD/R后的HT22細(xì)胞可升高p-AKT蛋白磷酸化比值,同時(shí),在此研究中,PARP1抑制劑PJ34和PARG抑制劑Ethacridine lactate處理可使OGD/R后的HT22細(xì)胞中p-AKT比值升高。這表明芒柄花素可通過抑制PARP1通路來激活A(yù)KT的磷酸化而抑制OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示HT22小鼠神經(jīng)元細(xì)胞在OGD/R條件下,芒柄花素可通過提高Iduna蛋白表達(dá)抑制PARP1/AIF/Akt信號(hào)通路來減輕HT22小鼠神經(jīng)元細(xì)胞損傷。這些結(jié)果為開發(fā)運(yùn)用錦雞兒異黃酮治療腦缺血再灌注損傷提供了依據(jù),后續(xù)可在體內(nèi)動(dòng)物模型研究中進(jìn)一步證明這一機(jī)制,以排除體外研究的局限性。