動(dòng)物胸腺腎模型構(gòu)建的現(xiàn)狀及研究進(jìn)展

王照翔，魏凡超，黃大源，韓士超，戚若晨，王國(guó)輝，張小燕，劉克普，馬帥軍，楊曉劍，秦衛(wèi)軍

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710032)

我國(guó)慢性腎衰竭患病比例約為1.5%，發(fā)病率為10.8%。對(duì)于這些患者，器官移植是治愈他們最有效的手段。盡管努力增加供體庫(kù)，但供體器官數(shù)量仍然短缺[1]。異種移植是解決器官短缺問(wèn)題的一個(gè)重要手段[2]。在2022年美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)以及紐約大學(xué)朗格尼研究所先后進(jìn)行了基因編輯豬-腦死亡受體的異種腎移植[1，3]。盡管異種腎移植研究已有進(jìn)展，但仍面臨著術(shù)后強(qiáng)烈排斥反應(yīng)的問(wèn)題。因此，誘導(dǎo)免疫耐受策略成為器官移植臨床前研究的主要目標(biāo)。

胸腺是中樞性免疫器官，發(fā)揮對(duì)T淋巴細(xì)胞的選擇發(fā)育功能。T淋巴細(xì)胞是移植排斥反應(yīng)的關(guān)鍵，作為T(mén)淋巴細(xì)胞的來(lái)源，胸腺具有獨(dú)特的潛力[4]，通過(guò)胸腺移植，可使供體的胸腺在受體體內(nèi)選擇發(fā)育受體 T 淋巴細(xì)胞從而誘導(dǎo)受體對(duì)供體特異性免疫耐受[5]。在通過(guò)胸腺移植誘導(dǎo)免疫耐受時(shí)，由于胸腺組織本身富含供體的抗原，易導(dǎo)致胸腺移植完成時(shí)、在胸腺血運(yùn)未完全恢復(fù)前發(fā)生強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，使移植的胸腺被宿主清除掉。因此，在移植前切除宿主的胸腺并且通過(guò)胸腺照射消除宿主體內(nèi)原有的T細(xì)胞、NK細(xì)胞是很有必要的[6]。這在嚙齒動(dòng)物、小型動(dòng)物中比較容易實(shí)現(xiàn)，但是在大型動(dòng)物中想完全消除其T細(xì)胞、NK細(xì)胞很難做到，可以通過(guò)腎包膜下包埋胸腺來(lái)構(gòu)建胸腺血管重建模型，這樣有利于在大型動(dòng)物中達(dá)到構(gòu)建免疫耐受的效果[7]。

目前構(gòu)建血管化的胸腺主要有兩種方法：一是“胸腺腎”移植[8-10]；二是進(jìn)行血管化的“胸腺小葉”移植[11-14]。兩種方案均取得良好效果，現(xiàn)主要介紹構(gòu)建“胸腺腎”移植。

本文主要介紹胸腺的主要特征、胸腺腎模型的構(gòu)建方式以及胸腺腎實(shí)現(xiàn)免疫重建的效果。同時(shí)介紹各移植中心在小型動(dòng)物間、大型動(dòng)物間以及基因編輯豬-腦死亡受體間通過(guò)構(gòu)建胸腺腎成功建立免疫耐受完成異種移植的效果，說(shuō)明胸腺腎的臨床應(yīng)用具有可行性。

1 胸腺及胸腺腎模型的構(gòu)建及主要特征

胸腺屬于重要的中樞免疫器官，其髓質(zhì)中含成熟的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，皮質(zhì)中富含未成熟T細(xì)胞。在胸腺微環(huán)境中，未成熟T細(xì)胞經(jīng)歷復(fù)雜的選擇過(guò)程而發(fā)育為成熟的T細(xì)胞。隨著年齡的增長(zhǎng)，胸腺會(huì)發(fā)生退化，主要表現(xiàn)為胸腺實(shí)質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞減少，取而代之的是脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織[15]。

由于轉(zhuǎn)基因豬已經(jīng)成為很理想的異種器官供體來(lái)源[9]，對(duì)豬的胸腺結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解，有利于在制備胸腺腎模型時(shí)進(jìn)行操作。解剖學(xué)上，豬的胸腺呈“Y”字型，淡粉紅色或黃白色，由胸腺頸葉、中葉、胸葉構(gòu)成。表面覆蓋被膜，腺體被結(jié)締組織分割為許多小葉。1日齡五指山豬胸腺的平均總長(zhǎng)度為9.64 cm[16]。組織學(xué)上，胸腺表面被覆結(jié)締組織，胸腺實(shí)質(zhì)由皮質(zhì)和髓質(zhì)構(gòu)成。皮質(zhì)位于外周，顏色深，以淋巴細(xì)胞為主，具有少量的上皮細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞；髓質(zhì)位于內(nèi)部，顏色淺，具有大量小型胸腺小體，少量幼稚胸腺小體；胸腺小體周邊有嗜酸性粒細(xì)胞。

胸腺腎的制備過(guò)程主要是在腎移植的2個(gè)月前進(jìn)行預(yù)處理[2]：將供體基因編輯豬的胸腺剝離出來(lái)，搗碎或切成薄片，包埋在供體的腎包膜下。由于腎包膜的血供極其豐富，在進(jìn)行正式腎移植手術(shù)前，腎包膜下已形成具有完整血管化的胸腺，此時(shí)的血管化胸腺具有正常胸腺的功能，這一過(guò)程就是胸腺腎的制備。經(jīng)過(guò)隨后的移植，在受者體內(nèi)，胸腺腎可以通過(guò)選擇性發(fā)育，產(chǎn)生具有正常功能的T細(xì)胞，同時(shí)產(chǎn)生的T細(xì)胞對(duì)移植的組織具有免疫耐受[17]，從而減少受體對(duì)移植物排斥反應(yīng)的發(fā)生。

2 胸腺腎實(shí)現(xiàn)免疫重建的研究

在廣州中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院器官移植科建立的大鼠自體胸腺腎模型中，將大鼠自體的胸腺切除，放入0～4 ℃生理鹽水中保存，隨后取其中部分大鼠胸腺，將胸腺剪成3～4片，分別放入雙腎腎包膜下[6]，構(gòu)建雙側(cè)自體胸腺腎模型。術(shù)后2周可看到明顯的血管從腎門(mén)部發(fā)出，進(jìn)入胸腺組織中，胸腺組織由最初的暗紅色變?yōu)檎Ｐ叵俳M織的白色。術(shù)后6～8周，胸腺組織增厚，組織學(xué)可看到正常的胸腺組織結(jié)構(gòu)。術(shù)后6周，只切除胸腺，未建立胸腺腎模型的大鼠CD4+T、CD8+T細(xì)胞逐漸下降；而構(gòu)建胸腺腎的大鼠CD4+T、CD8+T細(xì)胞開(kāi)始回升，并維持穩(wěn)定。由此可見(jiàn)，胸腺腎的構(gòu)建可以實(shí)現(xiàn)免疫重建。

在大鼠自體胸腺腎模型中，將建立自體胸腺腎模型的大鼠與只切除胸腺未建立胸腺腎模型大鼠的CD4+T、CD8+T細(xì)胞含量進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示建立自體胸腺腎模型的大鼠在術(shù)后CD4+T、CD8+T細(xì)胞含量逐漸回升，且呈時(shí)間依賴性。從而驗(yàn)證了胸腺腎模型實(shí)現(xiàn)免疫重建的可行性。但本模型僅構(gòu)建了自體胸腺腎模型，未進(jìn)行同種異體或異種胸腺腎模型構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)，對(duì)于異種胸腺腎實(shí)現(xiàn)免疫重建并沒(méi)有足夠的說(shuō)服力。

3 小型動(dòng)物胸腺腎建立免疫耐受的研究

在原第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷研究所構(gòu)建的F344近交系大鼠與裸小鼠的模型中，將F344近交系大鼠的胎胸腺移植入裸小鼠的左腎包膜下，以此來(lái)構(gòu)建胸腺腎模型[18]。由于裸小鼠屬于先天性免疫缺陷動(dòng)物，先天胸腺發(fā)育異常，T淋巴細(xì)胞功能缺陷[19]，從而實(shí)現(xiàn)了受體T細(xì)胞的完全清除。100 mg/kg異戊巴比妥鈉鹽腹腔注射麻醉后，將孕15 d的F344大鼠胎胸腺組織1 mm3植入裸小鼠左腎包膜下，隨后在SPF級(jí)飼養(yǎng)室培育。術(shù)后第2個(gè)月和術(shù)后第3個(gè)月，通過(guò)細(xì)胞流式儀觀察到經(jīng)過(guò)胸腺移植后的裸小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞均有重建，且重建程度呈時(shí)間依賴性。具體表現(xiàn)為正常BALB/c小鼠CD4+T細(xì)胞百分率為13.02%，接受胸腺移植的裸小鼠術(shù)后第2個(gè)月和術(shù)后第3個(gè)月的CD4+T細(xì)胞百分率分別為2.77%、7.75%。正常BALB/c小鼠CD8+T細(xì)胞百分率為8.89%，接受胸腺移植的裸小鼠術(shù)后第2個(gè)月和術(shù)后第3個(gè)月的CD8+T細(xì)胞百分率分別為3.10%、10.14%。其中在移植后第3個(gè)月裸小鼠的CD8+T淋巴細(xì)胞甚至高于免疫健全的小鼠CD8+T細(xì)胞的比率[18]。由此可見(jiàn)，胸腺腎的構(gòu)建可以在免疫缺失動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)免疫重建并誘導(dǎo)受體對(duì)供體特異性T細(xì)胞的耐受。

哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院移植生物學(xué)研究中心構(gòu)建的豬-小鼠模型中[20]，通過(guò)將胎豬胸腺移植入小鼠腎包膜下來(lái)建立免疫耐受，隨后進(jìn)行供體豬到小鼠的異種皮膚移植。首先將小鼠胸腺切除，在胸腺移植前6 d和1 d腹腔注射mAbs GK1.5、30-H12、PK136等藥物來(lái)達(dá)到耗盡T細(xì)胞和NK細(xì)胞的目的，在胸腺移植當(dāng)日對(duì)小鼠進(jìn)行3 Gy全身照射，將胎豬的胸腺組織以1 mm3移植到受體小鼠腎包膜下。2周后將胎豬皮膚移植入小鼠后外側(cè)胸腔上。術(shù)后4周觀察到CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增并有效的填充外周[21]。重建的功能性T細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)供體豬以及受體小鼠的耐受性，供體豬的皮膚移植物并未發(fā)生排斥反應(yīng)[22-23]。

在大鼠與裸小鼠的異種胸腺腎模型中，術(shù)后對(duì)裸小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞含量的測(cè)定顯示，CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞含量逐漸恢復(fù)，且含量的增長(zhǎng)與時(shí)間成正比。本模型證明了胸腺腎模型在異種移植中實(shí)現(xiàn)免疫重建的可行性，同時(shí)宿主并未對(duì)移植胸腺有明顯的排斥反應(yīng)，證明胸腺腎模型在異種移植中具有建立免疫耐受的功能。但本實(shí)驗(yàn)術(shù)后僅測(cè)定了淋巴細(xì)胞的含量與亞型，并未通過(guò)有效的檢測(cè)方式對(duì)新生成的淋巴細(xì)胞進(jìn)行溯源，如果能發(fā)現(xiàn)新生成的淋巴細(xì)胞的來(lái)源，將對(duì)胸腺腎實(shí)現(xiàn)免疫重建機(jī)制的研究有所指導(dǎo)。

豬-小鼠模型中，使用了單克隆抗體與胸腺照射來(lái)增加胸腺腎模型建立的成功率。在小鼠體內(nèi)異種胸腺腎模型的構(gòu)建，讓宿主小鼠成功耐受了供體豬的皮膚移植物，說(shuō)明胸腺腎模型構(gòu)建對(duì)異種移植免疫耐受的形成具有幫助。

4 大型動(dòng)物胸腺腎建立免疫耐受的研究

在哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院移植生物學(xué)研究中心對(duì)豬與狒狒模型的研究中，通過(guò)狒狒胸腺切除、眼鏡蛇毒因子來(lái)消耗T細(xì)胞和補(bǔ)體[24]。在移植前40～80 d將供體豬的胸腺埋入自體雙腎包膜下，制備雙側(cè)胸腺腎，隨后將構(gòu)建的右側(cè)胸腺腎原位移植給狒狒。術(shù)后免疫抑制劑使用嗎替麥考酚酯、抗胸腺細(xì)胞球蛋白、環(huán)磷酰胺、眼鏡蛇毒因子。5例實(shí)驗(yàn)中有1例豬腎在狒狒體內(nèi)存活超過(guò)6個(gè)月。最終由于腎臟的過(guò)度生長(zhǎng)導(dǎo)致腎皮質(zhì)壞死，并無(wú)排斥反應(yīng)的證據(jù)，胸腺腎移植物顯示腎小球以及腎血管表現(xiàn)良好，并無(wú)血管病變及炎癥反應(yīng)[25-26]。

哥倫比亞大學(xué)轉(zhuǎn)化免疫學(xué)中心YAMADA實(shí)驗(yàn)室在對(duì)基因編輯豬-非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行的研究中[27]，將GGTA1單基因敲除的供體豬的胸腺取出并切碎，分別包埋入自體雙側(cè)腎包膜下。6～8周后，將構(gòu)建的胸腺腎取出，取出時(shí)應(yīng)保留部分腎周脂肪，防止在之后的移植中造成組織粘連。將胸腺腎移入狒狒體內(nèi)，使用的方法是右側(cè)腎原位移植，移植后有尿產(chǎn)生后切除受體左腎。文章主要介紹了手術(shù)方法，并未介紹試驗(yàn)后的結(jié)果。該團(tuán)隊(duì)先前的研究顯示：?jiǎn)位騁GTA1敲除豬血管化胸腺腎移植后，受體肌酐維持正常水平長(zhǎng)達(dá)83 d，未構(gòu)建血管化胸腺的受體肌酐維持正常僅34 d，在34 d時(shí)腎臟及胸腺移植物均先后被排斥[28]。隨著誘導(dǎo)方案及手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)，該中心2017年實(shí)現(xiàn)了胸腺腎在受者體內(nèi)存活超過(guò)6個(gè)月的案例[29-30]。

在豬-非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物這類(lèi)大型動(dòng)物間的腎移植模型中，要注意由于宿主體內(nèi)的免疫細(xì)胞很難像小型動(dòng)物一樣通過(guò)全身照射或免疫抑制劑清除，如果胸腺腎在未完全完成血管化重建時(shí)便移植入宿主體內(nèi)，很容易就會(huì)被宿主排斥掉。YAMADA實(shí)驗(yàn)室的研究也顯示未構(gòu)建血管化胸腺的受體肌酐維持正常僅34 d，在34 d時(shí)腎臟及胸腺移植物均先后被宿主排斥[27]。只有構(gòu)建血管化的胸腺腎，進(jìn)行異種移植后才能在宿主體內(nèi)發(fā)揮建立免疫耐受的功能。同時(shí)，胸腺腎移植術(shù)前對(duì)宿主進(jìn)行胸腺切除以及使用免疫抑制劑也是必要的。胸腺腎在豬-非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物間腎移植模型的成功構(gòu)建并建立免疫耐受的實(shí)驗(yàn)也為胸腺腎在臨床上應(yīng)用以減輕異種移植術(shù)后超急性排斥反應(yīng)提供了更充足的理論依據(jù)。

5 動(dòng)物與人異種移植中胸腺腎的應(yīng)用

紐約大學(xué)朗格尼移植研究所在2021年分別對(duì)兩位腦死亡患者進(jìn)行了異種腎移植[4]。采用的方法為GGTA1單基因敲除豬以及構(gòu)建胸腺腎模型進(jìn)行移植。在獲取器官的兩個(gè)月前，將供體豬的胸腺植入腎包膜下[31-32]。獲得胸腺腎器官后保存在SPS-1器官保存液中，隨后進(jìn)行移植手術(shù)。第一例腎缺血時(shí)間為7 h，第二例腎缺血為6 h。移植并且再灌注后，腎臟迅速呈現(xiàn)粉紅色，并在幾分鐘后開(kāi)始排尿。免疫抑制劑使用嗎替麥考酚酯、甲基潑尼松龍。在觀察的54 h內(nèi)，兩例研究的移植物均表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)eGFR逐漸上升，肌酐逐漸下降。在第6、24、48、54 h進(jìn)行的活檢中，未發(fā)生超急性排斥反應(yīng)以及抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。

紐約大學(xué)朗格尼移植研究所于2023年7月14日再次進(jìn)行了GGTA1基因敲除豬到腦死亡受體的異種腎移植。本次移植中仍然構(gòu)建了胸腺腎模型。本次腎臟功能共維持了61 d。移植腎持續(xù)有尿，未觀察到超急性和急性排斥反應(yīng)，肌酐水平在研究期間處于最佳范圍內(nèi)，并且沒(méi)有關(guān)于排斥反應(yīng)活檢的證據(jù)[33]。

朗格尼移植研究所在2021年與2023年的臨床異種腎移植試驗(yàn)中，均使用胸腺腎作為輔助手段來(lái)減輕移植術(shù)后的排斥反應(yīng)。這也是胸腺腎模型首次運(yùn)用于異種移植的臨床研究中，在他們最近的一次研究中，移植腎功能維持了61 d，超出了原有的世界紀(jì)錄60 d，并且在維持功能的61 d中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)的證據(jù)。這些數(shù)據(jù)都展示出胸腺腎模型在異種移植中減輕排斥反應(yīng)的可行性。但其建立免疫耐受的機(jī)制并不清楚，仍需要在動(dòng)物間建立模型進(jìn)行進(jìn)一步的探究，從而為臨床應(yīng)用提供更有價(jià)值的指導(dǎo)。

6 總結(jié)與展望

不論是小型動(dòng)物、大型動(dòng)物間異種移植還是在基因編輯豬-腦死亡受體的異種移植中，胸腺腎模型的構(gòu)建都對(duì)排斥反應(yīng)的抑制展現(xiàn)出積極的效果。胸腺腎的構(gòu)建可能有助于減少排斥反應(yīng)的發(fā)生[2]。將胸腺腎作為異種移植的輔助手段來(lái)建立免疫耐受，對(duì)減輕或避免超急性排斥反應(yīng)很有意義。然而對(duì)胸腺腎建立免疫耐受的機(jī)制仍不清楚；胸腺腎構(gòu)建時(shí)胸腺移植在腎臟的不同部位，是否會(huì)影響胸腺腎血管化的重建；胸腺腎血管化重建期間是否可以通過(guò)用藥加快其重建等仍不清楚，這些都是未來(lái)胸腺腎在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)應(yīng)用所急需解決的問(wèn)題。未來(lái)通過(guò)在小型動(dòng)物間進(jìn)行異種移植胸腺腎的構(gòu)建，并在移植術(shù)后對(duì)重建的淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)免疫耐受產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行研究；在對(duì)大型動(dòng)物進(jìn)行研究時(shí)可設(shè)置對(duì)照，對(duì)比異種移植中構(gòu)建胸腺腎與不構(gòu)建胸腺腎受體移植術(shù)后的存活情況、各項(xiàng)生理生化指標(biāo)、各項(xiàng)輔助檢查指標(biāo)，從而為胸腺腎在異種移植的臨床應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。