塊菌多糖的提取、結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用研究進(jìn)展

李 盼 曾祥權(quán) 李倩倩 李 健

塊菌(Tuber)為盤菌目塊菌科塊菌屬的一類生長于地下的真菌,屬于子囊菌(Ascomycota),是兩大類松露(Truffle)之一。松露可分為塊菌和沙漠松露兩大類,而塊菌通常被認(rèn)為是盤菌目中“真正的”松露[1],在澳大利亞、新西蘭、中國和許多歐洲國家(如法國、意大利、英國、西班牙和克羅地亞)均有生長[2]。塊菌孢子通常定植于樹木或灌木的根部,形成外生菌根。宿主植物可以通過光合作用為塊菌提供碳水化合物,而真菌促進(jìn)宿主植物水和礦物質(zhì)的吸收,同時釋放生長素類激素吲哚-3-乙酸(IAA)和乙烯,促進(jìn)宿主植物的根生長[3],二者互惠共生。塊菌子實體常呈直徑為2～10 cm的橢圓形或不規(guī)則圓形,顏色為黃褐色、深咖色或黑褐色,外表面裝飾著明顯的突疣,多為圓鈍型或錐型,這些突疣被深網(wǎng)狀的溝縫細(xì)痕分隔,而內(nèi)表面具有深棕色和白色靜脈結(jié)構(gòu)[4]。塊菌的種類繁多,主要分為黑袍塊菌(Tubermelanosporum)、夏塊菌(Tuberaestivum)、白麓塊菌(Tubermagnatum)、中國塊菌(Tubersinense)、印度塊菌(Tuberindicum)、攀枝花塊菌(Tuberpanzhihuanense)、假凹陷塊菌(Tuberpseudoexcavatum)、結(jié)核塊菌(Tuberregium)、白松露(Tuberborchii)等,其中T.melanosporum、T.aestivum和T.magnatum在市場上的銷售量最高。塊菌中富含多種營養(yǎng)及生物活性成分,包括蛋白質(zhì)、多糖、多酚、游離氨基酸、礦物質(zhì)和不飽和脂肪酸等[1],具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗抑郁和免疫調(diào)節(jié)等生物活性[5],近年來,真菌多糖被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)。

文章擬對塊菌多糖的提取工藝、化學(xué)結(jié)構(gòu)、功能活性及其在食品加工中的應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)概述,以期為未來塊菌多糖在食品工業(yè)中的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 塊菌多糖的提取工藝

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是基于相似相溶的原理將目標(biāo)化合物從混合組分中分離出來,具有經(jīng)濟(jì)、便捷的優(yōu)點。但與此同時,溶劑提取法也存在耗時長和提取效率低的缺點。對于塊菌多糖來說,常用的提取溶劑包括熱水、堿、酸等。Wu等[6]分別采用熱水提取法和堿提取法提取T.regium多糖,兩種溶劑提取的多糖組分W-PTR和A-PTR在顏色、溶解度、單糖和分子質(zhì)量上均存在顯著差異,且W-PTP的總糖含量(0.788 mg/mL)約為A-PTP(0.478 mg/mL)的2倍。Zhao等[7]優(yōu)化了熱水提取T.sinense塊菌子實體多糖的工藝條件,其最佳條件為提取溫度94.75 ℃、料液比1∶16.41 (g/mL)、提取時間2.67 h,此條件下塊菌多糖提取率為10.44%?？讘c龍等[8]發(fā)現(xiàn)熱水浸提法提取T.indicum多糖的最佳工藝條件為提取溫度94.68 ℃、提取時間3.71 h、料液比1∶58.66 (g/mL),此時塊菌多糖提取率為10.8%。岳金玫等[9]發(fā)現(xiàn)熱水浸提法提取攀枝花塊菌多糖的最佳工藝條件為提取溫度90 ℃、提取時間60 min、料液比1∶33 (g/mL),此時多糖提取率高達(dá)13.32%,提取物中多糖含量為71.55%。

1.2 超聲輔助提取法

超聲輔助提取法主要通過機(jī)械作用、熱作用和空化作用破壞塊菌細(xì)胞壁,使多糖組分從破裂細(xì)胞中釋放出來,具有操作簡便、耗時少、提取效率高、提取溫度低等優(yōu)點。Mudliyar等[10]研究表明,超聲輔助提取T.aestivum多糖的最佳工藝條件為pH 6.5、振幅25%、液固比75∶1 (mL/g)、提取時間15 min,此條件下的提取率為(68.91±1.54)%。黃治國等[11]優(yōu)化了超聲波輔助提取法提取攀枝花塊菌多糖的工藝條件,得到最優(yōu)方案為料液比1∶30 (g/mL)、超聲波處理溫度40 ℃、超聲波處理功率100 W、超聲波處理時間60 min,其提取率可達(dá)17.86%。蒲彪等[12]研究表明,超聲輔助提取攀枝花塊菌多糖的最佳工藝條件為超聲功率140 W、超聲處理時間36 min、超聲處理溫度50 ℃、料液比1∶40 (g/mL),此時塊菌多糖提取率為18.15%。與單純的溶劑提取法相比,超聲輔助提取法顯著提升了塊菌多糖的提取率。

1.3 微波輔助提取法

微波輔助提取法是利用微波產(chǎn)生的高頻輻射,將塊菌細(xì)胞組織擊穿,從而使組織內(nèi)部的多糖溶解出來。與此同時,塊菌細(xì)胞組織吸收微波輻射轉(zhuǎn)變的微波能,使組織溫度迅速升高,加速細(xì)胞組織分解,從而使多糖類物質(zhì)更快速地釋放出來。清源[13]確定了微波提取塊菌多糖的最佳工藝條件為微波功率320 W、料液比1∶40 (g/mL)、微波時間200 min,此條件下的多糖提取率高達(dá)15.54%。Guan等[14]設(shè)置微波輔助提取參數(shù)為微波功率280 W、溫度70 ℃、微波輔助提取5 min提取T.aestivum和T.melanosporum多糖,進(jìn)一步分離純化后得到T.aestivum和T.melanosporum多糖組分TAP和TMP分別為12.97%和11.47%。

1.4 酶輔助提取法

酶輔助提取法是基于酶的水解作用對塊菌細(xì)胞壁進(jìn)行降解,使多糖組分溶于溶劑中,從而達(dá)到萃取的目的。相較于溶劑提取法,酶輔助提取法對環(huán)境更為友好,是綠色提取工藝之一。而用于食用菌多糖提取的常見消化酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等[15-17]。Bhotmange等[18]采用復(fù)合酶輔助提取法提取了T.aestivum多糖,其最佳提取條件為木瓜蛋白酶1.0%、胰蛋白酶1.0%、果膠酶2.0%、提取時間90 min、pH 6.0、提取溫度50 ℃,此條件下多糖得率為46.91%。清源等[19]確定了T.indicum多糖的酶法最佳提取工藝為m中性蛋白酶∶m纖維素酶=1∶7、酶用量3.6%、酶解溫度41 ℃、酶解時間48 min、料液比1∶29 (g/mL)、pH 4.8,多糖的得率和含量分別為14.5%和75.96%。岳金玫等[20]研究發(fā)現(xiàn),酶輔助提取攀枝花塊菌多糖的最佳工藝條件為pH 5.6、酶解時間65 min、酶解溫度61 ℃、木瓜蛋白酶添加量1.6%,此時多糖提取率為14.31%,多糖含量高達(dá)74.96%。此外,岳金玫[21]還考察了4種塊菌多糖提取方法(熱水浸提法、酶輔助提取法、超聲波輔助提取法以及超聲波協(xié)同酶法)對提取率的影響,發(fā)現(xiàn)酶輔助提取法(14.31%)、超聲波輔助提取法(18.15%)相較于傳統(tǒng)的熱水浸提法(13.32%)均能提高塊菌多糖的提取率,而超聲波協(xié)同酶法(20.91%)提取塊菌多糖的提取率為熱水提取法的1.6倍。

1.5 加壓液相萃取法

加壓液相萃取法是在密閉容器內(nèi),通過升高壓力使溶劑快速充滿萃取池以加速塊菌多糖的萃取,同時提高溫度以增加塊菌多糖在溶劑中的溶解度。Tejedor-Calvo等[22]研究表明,加壓液相萃取法提取T.aestivum多糖的最佳工藝條件為溶劑中V水∶V乙醇=1∶1,提取溫度180 ℃,提取時間30 min,所提取的塊菌多糖含量最高為69.3%。目前,借助加壓液相萃取法提取塊菌多糖的相關(guān)研究較少,后續(xù)可以進(jìn)一步擴(kuò)大該技術(shù)的應(yīng)用范圍。

2 塊菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)

如表1所示,目前國內(nèi)外對塊菌多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究主要圍繞不同種類塊菌多糖的分子質(zhì)量、單糖組成及比例、單糖殘基的連接方式及構(gòu)型、多糖構(gòu)型等方面展開,并借助氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)連用、核磁共振(NMR)、高效液相色譜法(HPLC)、高效凝膠滲透色譜(HPGPC)、體積排阻色譜(VEC)、紫外可見光譜法(UV-Vis)和傅里葉紅外光譜法(FT-IR)等技術(shù)對塊菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。不同塊菌來源的多糖具有不同的單糖組成、連接單元和分子質(zhì)量。其中,塊菌多糖的分子質(zhì)量范圍為5.13～2.18×104kDa,塊菌的品種、生長環(huán)境、提取方法、純化步驟等均會導(dǎo)致塊菌多糖分子質(zhì)量的差異。此外,從塊菌中提取得到的多種不同的塊菌多糖,其單糖組成通常由不同摩爾比的 Rha、Man、Glc和Gal組成,各單糖殘基主要通過1,6-、1,4-以及1,3-等連接。不同塊菌多糖的糖苷鍵構(gòu)型主要為α構(gòu)型,部分同時存在α構(gòu)型和β構(gòu)型,且絕大多數(shù)塊菌多糖為吡喃糖。

表1 塊菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)?

3 塊菌多糖的功能活性

如表2所示,塊菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等功能活性,與其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

表2 塊菌多糖的功能活性

3.1 抗氧化活性

不同分子質(zhì)量塊菌多糖的抗氧化活性也存在一定差異。岳金玫[21]對攀枝花產(chǎn)印度塊菌粗多糖進(jìn)行超濾,分離得到了3種不同分子質(zhì)量的塊菌多糖組分TIP-Ⅰ(<50 kDa)、TIP-Ⅱ(50～100 kDa)和TIP-Ⅲ(>100 kDa),3種多糖組分的抗氧化能力與其分子質(zhì)量大小緊密相關(guān),總還原能力和自由基清除能力大小順序為TIP-Ⅲ>TIP-Ⅱ>TIP-Ⅰ,螯合鐵離子能力大小順序為TIP-Ⅰ>TIP-Ⅱ>TIP-Ⅲ。

3.2 抗腫瘤活性

近年來,塊菌多糖被證明具有一定的抗癌作用,與其抑制瘤細(xì)胞生長或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的作用有關(guān)。Tao等[34]從T.regium中提取的水溶性超支化β-葡聚糖,編碼為TM3b,在體內(nèi)和體外均顯示出有效的抗腫瘤活性,可以抑制肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的生長。而Zhao等[35]從3個塊菌子實體(T.indicum,T.himalayense,T.sinense)和4個塊菌發(fā)酵體系(T.melanosporum,T.indicum,T.sinense,T.aestivum)中分離出52個多糖組分,各多糖組分對HepG2、A549、HCT-116、SK-BR-3和HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。其中,從塊菌發(fā)酵體系中分離出的多糖的最大細(xì)胞生長抑制率為69.95%,比從塊菌子實體中分離出的高約16%,可能是塊菌發(fā)酵體系分離出的多糖中β-D-葡聚糖的三螺旋構(gòu)象在增強(qiáng)抗腫瘤活性方面發(fā)揮了重要作用。此外,通過分析其多糖組分的分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),過高的重均分子質(zhì)量還可能會削弱抗腫瘤活性。

3.3 降血糖活性

多糖的降血糖活性通常與其對相關(guān)消化酶以及肝臟糖代謝過程中相關(guān)酶表達(dá)的抑制作用有關(guān)[36]。魏鑫悅等[37]測定了攀枝花塊菌多糖的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的體外抑制作用,發(fā)現(xiàn)多糖組分對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50值分別為1.99,3.30 mg/mL。Huang等[38]從T.regium菌株發(fā)酵菌絲體中提取得到3種多糖組分1P、2P和3P,可以顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖水平和糖化血紅蛋白(HbA1c)水平,恢復(fù)糖尿病大鼠的胰島素水平,且1P降低血糖作用比2P和3P的更明顯。塊菌多糖的降血糖作用可能歸因于其抗氧化能力,在減少胰島B細(xì)胞損傷和恢復(fù)胰島素水平方面起關(guān)鍵作用。

3.4 抗疲勞活性

塊菌多糖可以通過提高機(jī)體的糖原含量、提高機(jī)體肌肉組織中相關(guān)乳酸清除酶的活性、緩解機(jī)體蛋白質(zhì)、氨基酸的分解代謝以及緩解機(jī)體氧化損傷來達(dá)到一定的抗疲勞效果。馬寧[39]對印度塊菌多糖EPT進(jìn)行了體內(nèi)抗疲勞試驗,發(fā)現(xiàn)高劑量(3 g/kg BW)EPT處理能顯著提高小鼠的力竭游泳時間,使游泳小鼠的肝糖原、肌糖原含量恢復(fù)到正常水平。EPT還能顯著提高小鼠組織細(xì)胞中的乳酸脫氫酶活性,加速肌肉中乳酸的清除代謝,防止肌肉中乳酸積累,降低小鼠血清中肌酸激酶活性、力竭游泳后小鼠的肌肉損傷程度、血清中尿素氮水平和機(jī)體蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝,從而減緩肌肉力量的降低。此外,EPT處理還可明顯降低小鼠血清中羥自由基含量,血清、肌肉、肝臟中的丙二醛含量,增加小鼠血清中脂肪酸水平,說明塊菌多糖能防止自由基造成的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷,利用脂肪酸氧化供能,從而減少肌糖原無氧酵解產(chǎn)生乳酸,達(dá)到一定的抗疲勞效果。李陸[40]通過印度塊菌多糖灌胃小鼠的負(fù)重力竭游泳試驗探究了塊菌多糖的運(yùn)動抗疲勞效果。研究表明,高、中、低3種劑量的塊菌多糖處理組均可顯著延長小鼠的平均力竭游泳時間。此外,各劑量多糖灌胃處理組小鼠的肝重系數(shù)均較對照組顯著升高,且顯著性隨多糖劑量的增加而增大,說明塊菌多糖能延長小鼠的肌肉耐受能力并提高小鼠的肝糖原儲備,從而起到抗疲勞的作用。

3.5 免疫調(diào)節(jié)

塊菌多糖能夠通過影響免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子、補(bǔ)體系統(tǒng)和細(xì)胞因子等對免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。趙玲[41]對中華塊菌T.sinense粗多糖CTP進(jìn)行了體內(nèi)外免疫活性測定,體外試驗結(jié)果表明,CTP對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO的促進(jìn)作用隨CTP濃度的增加而增加。體內(nèi)試驗中,CTP能顯著促進(jìn)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)的部分恢復(fù),同時對免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)也有一定的促恢復(fù)作用。此外,CTP還能增強(qiáng)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬作用。其中,低劑量(50 mg/kg)CTP可以顯著增加免疫抑制小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)量,紅細(xì)胞數(shù)量與血紅蛋白含量。胡慧娟等[42]對T.sinica中提取得到的多糖PST進(jìn)行了小鼠免疫調(diào)節(jié)活性評價,觀察到PST不僅能增加小鼠脾臟的重量,增加小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和綿陽紅細(xì)胞所引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng),還能提高小鼠血清的抗體水平,說明PST有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性。

4 塊菌多糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用

塊菌多糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要圍繞研制糕點和含片類產(chǎn)品展開。華思寧[43]采用蛋白酶酶解和超聲波等現(xiàn)代工藝技術(shù)預(yù)處理黑松露,使多糖等有效成分大量析出。隨后將預(yù)處理溶液于100 ℃恒溫水浴鍋中,在持續(xù)攪拌下加入葡萄糖酸鈣和蘋果酸鋅溶液,最終在高壓脈沖電場下處理3 h得到黑松露溶液。該溶液存在松露多糖螯合鈣和螯合鋅兩種新型微量元素補(bǔ)充劑,可直接被人體吸收利用。在傳統(tǒng)月餅餡料中加入50%的黑松露溶液制得月餅餡料后,按2∶8或3∶7的月餅面皮與餡料的比例制作月餅。與市面上已有的將黑松露直接粉碎加入餡料中制得的月餅相比,該工藝增加了餡料中黑松露多糖、松露多糖鈣和多糖鋅螯合物等有效成分,顯著提高了月餅的營養(yǎng)價值,更加滿足現(xiàn)代健康飲食的需求。

含片具有便于攜帶、方便食用等優(yōu)點,受到許多消費(fèi)者的喜愛。清源[13]以塊菌為原料制備得到塊菌多糖粉后,選用甘露醇粉為填充劑、乳糖為甜味劑與其混勻,隨后緩慢加入70%乙醇制軟料,進(jìn)行制粒、干燥、整粒和壓片后得到多糖含片,以色澤、風(fēng)味、口感和組織狀態(tài)為感官指標(biāo)對配方進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)塊菌多糖粉用量為100 g,添加2%硬脂酸鎂、20%甘露醇粉、45%乳糖以及體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇,所得含片的甜味協(xié)調(diào),口感最佳。鮮欣言[44]將塊菌多糖提取液制成稠浸膏狀后,采用濕法壓片工藝制備得到了塊菌多糖含片,當(dāng)甘露醇、阿斯巴甜、檸檬酸、硬脂酸鎂添加量分別為65.0%,2.0%,0.1%,0.7%時,含片的感官評價得分最高。塊菌多糖含片的研制不僅豐富了塊菌食品的形式,還在一定程度上推廣了塊菌多糖的保健功能價值。

5 結(jié)語

研究系統(tǒng)總結(jié)了塊菌多糖的提取工藝、化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能活性及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用,為未來塊菌多糖功能性食品的開發(fā)提供了一定的理論支撐。但目前關(guān)于塊菌多糖的研究仍存在一定局限性,后續(xù)可以嘗試借助其他方法繼續(xù)優(yōu)化塊菌多糖的提取工藝,如超臨界萃取法等。而對于塊菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu),還需進(jìn)一步研究其主鏈骨架和螺旋構(gòu)象等。此外,塊菌多糖的其他潛在功能活性也有待進(jìn)一步證明,如抗炎、抗菌和降膽固醇活性等。為了擴(kuò)大塊菌多糖的應(yīng)用,可將其作為壁材遞送不同生物活性成分以增強(qiáng)其穩(wěn)定性及利用率,開發(fā)成新型乳液穩(wěn)定劑提高乳液的穩(wěn)定性或復(fù)合膜材料制備可食用薄膜或涂層以延長食品貨架期,以及用于蛋白多糖復(fù)合物的制備實現(xiàn)新型脂肪代替物的開發(fā),改善食品品質(zhì)及營養(yǎng)價值。