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    pH 對大黃魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)及乳化性的影響

    2024-03-25 07:43:28任中陽崔雅清陳玉峰石林凡郝更新邱緒建劉淑集翁武銀
    水產(chǎn)學(xué)報 2024年3期
    關(guān)鍵詞:等電點大黃魚內(nèi)源

    任中陽,崔雅清,陳玉峰,石林凡,2,郝更新,2,楊 燊,2,邱緒建,2,劉淑集,翁武銀,2*

    (1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.集美大學(xué),廈門市海洋功能食品重點實驗室,福建 廈門 361021;3.浙江工業(yè)大學(xué),浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點實驗室,浙江 杭州 310014;4.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310014;5.福建省水產(chǎn)研究所,福建 廈門 361000)

    大黃魚(Larimichthys crocea)具有肉質(zhì)鮮美、蛋白含量高、膽固醇少等特點,深受廣大消費者的喜愛[1]。其主要分布于黃海、東海、臺灣海峽及南海北部,是中國四大海水經(jīng)濟(jì)魚類之一[2]。大黃魚作為中國特色水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品,是我國最具優(yōu)勢的出口水產(chǎn)品之一[3]。2019 年,我國養(yǎng)殖大黃魚年產(chǎn)量達(dá)到22.55 萬t,2020 年產(chǎn)量提升至25.4 萬t[4-5]。為提升大黃魚附加值,深入了解大黃魚肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP)結(jié)構(gòu)和功能特性非常必要。

    MP 是魚肉的重要組成部分,占肌肉蛋白總量的60%~70%。關(guān)于采用不同處理方式如超高壓處理、輻照處理、pH 處理、外源物添加等研究魚肉MP 的結(jié)構(gòu)組成和功能性質(zhì)等已有大量報道[6]。張登科等[7]對養(yǎng)殖大黃魚MP 的處理壓力和保壓時間的研究表明,其最大發(fā)射波長峰值隨著壓力增大而變大。張晗等[8]對花鱸(Lateolabrax japonicus)MP 表面疏水性的研究表明,其隨電子束輻照劑量上升先增大后減小。Kristinsson 等[9]研究不同pH 下大西洋鱈(Gadus morhua)肌肉蛋白功能性質(zhì),結(jié)果表明酸和堿處理提高了MP 的乳化性能,這與表面疏水性有關(guān),疏水性越高越有利于蛋白質(zhì)與非極性油滴表面相互作用。何青[10]對不同pH下豬肉MP 的聚集狀態(tài)分析表明,MP 顆粒的微觀形態(tài)呈纖維狀和不規(guī)則聚集狀態(tài)。在pH 對MP 相關(guān)功能性質(zhì)的研究中,主要集中在凝膠特性方面,通過改變pH 得到組織良好、相對有序致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)[11-12]。

    pH 對MP 乳化特性影響的研究大部分集中在豬肉[13]、雞肉[14]和部分魚類如鱈[9]等方面。周心雅等[15]研究兔肉MP 性質(zhì),結(jié)果表明隨pH 接近等電點,其氫鍵穩(wěn)定性降低,二級結(jié)構(gòu)變化,內(nèi)部疏水性氨基酸暴露,蛋白三級結(jié)構(gòu)展開,導(dǎo)致乳化活性減小。郭延娜等[16]研究在不同pH 條件下豬肉MP 的乳化性質(zhì),結(jié)果表明等電點附近(pH 值5~6)無法形成穩(wěn)定乳液,而在pH 值6~7形成明顯的水包油結(jié)構(gòu)。選擇合適的pH 對于大黃魚MP 制備乳液的穩(wěn)定性尤為重要。乳液可作為運輸系統(tǒng),用于封裝、保護(hù)和釋放穩(wěn)定性差的功能性成分,其中脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)可以溶解在油脂中,被人體消化吸收[17]。此外,在極端酸性和堿性條件下,也可以將破乳技術(shù)應(yīng)用于冷萃取魚油[18]。然而,目前針對不同pH 下大黃魚MP 乳化性的研究有限,有待進(jìn)一步研究以滿足大黃魚蛋白質(zhì)高值化開發(fā)利用的需求。

    通過不同pH 處理大黃魚MP,對其Zeta 電位、接觸角以及內(nèi)源熒光性進(jìn)行分析。以不同pH 處理的大黃魚MP 和大豆油為原料制備乳液,對乳液的形貌、電位以及穩(wěn)定性進(jìn)行分析。分析pH 對MP 結(jié)構(gòu)及乳化性的影響,為開發(fā)大黃魚產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大黃魚購于廈門市新華都購物廣場,去頭、去尾、去內(nèi)臟、去皮,純水清洗干凈,取背部肌肉切塊,自封袋包裝,-24 °C 冷凍保藏。十二烷基硫酸鈉(SDS)購于Sigma 公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。實驗過程中操作人員嚴(yán)格遵守倫理規(guī)范,并按照集美大學(xué)倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Vanti J-26S 高速冷凍離心機(jī),美國Beckman公司;UV-2600A 紫外分光光度計,上海元析儀器有限公司;SDC-200 光學(xué)接觸角測量儀,東莞市晟鼎精密儀器有限公司;Cary Eclipse 熒光分光光度計,美國Agilent 公司;Zetasizer Nano-ZS90納米粒度電位儀,英國Malvern 公司;S-4 800 電子掃描顯微鏡,日本東京日立制造所。

    1.3 實驗方法

    MP 提取 參考Cao 等[19]MP 提取的方法,并略作修改。取冷凍大黃魚背部肌肉,加入4 倍體積低鹽磷酸緩沖液(0.02 mol/L Na2HPO4、0.02 mol/L NaH2PO4、0.05 mol/L NaCl,pH 7.5)漂 洗3 次,離心(9 500 r/min,15 min,4 °C)棄上清液取沉淀。沉淀與4 倍質(zhì)量的高鹽磷酸緩沖液(0.02 mol/L Na2HPO4、0.45 mol/L NaCl,pH 7.5)混合均勻,浸提12 h?;旌衔镫x心(9 500 r/min,15 min,4 °C),棄沉淀取上清液。上清液加入10 倍質(zhì)量的冷凝水,靜置3 h 后離心(9 500 r/min,15 min,4 °C),沉淀即為MP,凍干備用。

    MP 溶液及乳液制備 稱取0.5 g MP,分別溶于pH 為2、4、6、8、10、12 的50 mL 低鹽磷酸緩沖液中。取10 g/L 不同pH 處理的MP 溶液與大豆油按照體積比1∶1 混合,經(jīng)20 000 r/min高速均質(zhì)2 min,4 °C 冷藏備用。

    SDS-PAGE 參考Fang 等[20]SDS-PAGE 電泳的方法,并略作修改。將2 g/L 蛋白懸浮液經(jīng)10 000 r/min 離心10 min,取上清液。測定條件:10%分離膠、4%濃縮膠、上樣量10 μL,利用8 mA 恒定電流運行15 min,再采用16 mA 恒定電流至終點。用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色24 h,采用脫色液(10%甲醇,30%乙酸)脫色45 min 至背景清晰。

    接觸角的測定 參考Ren 等[21]接觸角的測定方法,并略作修改。不同pH 處理的MP 溶液凍干,取凍干樣品0.25 g,壓片機(jī)25 MPa 壓制成片。測定條件:MP 壓片置于油相,1 μL 超純水液滴吸附至壓片表面,計時2 min,利用接觸角測量儀測定分析。

    內(nèi)源熒光性的測定 參考閆春子等[22]內(nèi)源熒光性的測定方法,并略作修改。MP 溶液用高鹽緩沖液稀釋至0.5 g/L。測定條件:激發(fā)波長295 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為2.5 nm,波長掃描范圍為300~400 nm,掃描速率為600 nm/min。

    乳液微觀形貌及Zeta 電位 參考丁儉等[23]乳液微觀形貌的觀察方法,并略作修改。測定條件:吸取1 滴乳液,滴于載玻片上,蓋上蓋玻片后于光學(xué)顯微鏡下,用40 倍物鏡進(jìn)行乳液液滴的形貌觀察。參考王旭等[24]乳液Zeta 電位的測定方法,并略作修改。測定條件:將制備的MP 懸液及乳液稀釋100 倍,采用納米粒度電位儀測定其電位。

    乳液穩(wěn)定性的測定 參考Ren 等[25]測定乳液穩(wěn)定性的方法,并略作修改。制備好的乳液立即取10 mL 于比色管中,測量乳液總的高度和底端乳清層的高度。乳析指數(shù)(creaming index,CI,%)計算公式:

    式中,H0為乳化后初始階段乳液總高度(cm),Ht為乳化后t時刻乳化層高度(cm)。

    數(shù)據(jù)分析 用SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用單因素分析中Duncan 氏兩兩比較法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

    2 結(jié)果

    2.1 pH 處理對大黃魚MP 結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響

    pH 對MP 的Zeta 電位影響 不同pH 處理大黃魚MP 的Zeta 電位結(jié)果顯示,等電點位于pH 4~6,在等電點左側(cè),pH 越接近等電點,Zeta電位絕對值越?。辉诘入婞c右側(cè),pH 6~12 Zeta電位絕對值較大,可達(dá)36.15 mV;在pH 12 時Zeta 電位絕對值相對pH 10 有所降低(圖1)。

    圖1 pH 處理大黃魚肌原纖維蛋白Zeta 電位不同字母代表差異顯著(P<0.05),圖3 和圖6 同。Fig.1 Zeta potential of myofibrillar proteins of L.crocea treated at different pH valuesLowercase letters indicate significant differences between different samples,P<0.05,the same as Fig.3 and Fig.6.

    pH 對MP 的SDS-PAGE 影響 不同pH處理大黃魚MP 后SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示,經(jīng)不同pH 處理后,MP 發(fā)生不同程度的降解(圖2)。從上到下依次為副肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈,該結(jié)果與Wang 等[26]的研究基本一致。在等電點右側(cè),pH 增加,凝膠頂部多聚體逐漸加深,堿性條件下MP 更易聚集,且200 ku 處無明顯條帶。

    圖2 pH 處理大黃魚肌原纖維蛋白SDS-PAGE 電泳圖M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)200;Ⅰ~Ⅳ分別代表副肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈。Fig.2 SDS-PAGE of myofibrillar proteins of L.crocea treated at different pH valuesM.Marker 200;Ⅰ-Ⅳ represent paramyosin,actin,tropomyosin and troponin,respectively.

    pH 對MP 接觸角的影響 在pH 2~8 下,接觸角均小于90°且變化不明顯,表現(xiàn)為親水性。隨pH 繼續(xù)增加,MP 接觸角增大,接觸角在pH 10 和pH 12 時均大于90°,MP 表現(xiàn)為明顯的疏水性(圖3)。

    圖3 pH 對MP 接觸角的影響Fig.3 Effect of pH on contact angle of myofibrillar proteins

    pH 對MP 內(nèi)源熒光性的影響 進(jìn)一步通過熒光光譜分析不同pH 處理MP 后內(nèi)源熒光的變化,在等電點左側(cè),pH 越接近等電點,熒光強(qiáng)度越低,發(fā)射波長紅移(從331 到340 nm)。在等電點右側(cè),隨著pH 增加,熒光強(qiáng)度逐漸增加,發(fā)射波長先藍(lán)移后紅移(從337 到332 nm,再到337 nm) (圖4)。

    圖4 pH 對MP 內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of pH on endogenous fluorescence intensity of myofibrillar proteins

    2.2 pH 對大黃魚MP 乳化特性的影響

    pH 對MP 乳液微觀形貌的影響 不同pH 處理大黃魚MP 后新鮮乳液微觀形貌的結(jié)果顯示,在等電點左側(cè)乳滴較大且不均勻。而在等電點右側(cè),pH 6~10 時,乳滴粒徑逐漸減小且大小趨于均勻,pH 12 時乳滴較小,彼此間出現(xiàn)明顯的絮凝(圖5)。

    圖5 pH 處理大黃魚肌原纖維蛋白乳液的顯微觀察(40×)(a)~(f)分別為在pH 2、4、6、8、10 和12 下MP 制備的乳液。Fig.5 Microscopic observation of myofibrillar protein emulsions of L.crocea treated at different pH values(a)-(f) represent emulsions prepared by MP at pH 2,4,6,8,10 and 12,respectively.

    pH 對MP 乳液Zeta 電位的影響 不同pH 處理大黃魚MP 制備的乳液Zeta 電位,在等電點左側(cè)乳液帶正電,接近等電點時,乳液電位絕對值降低;在等電點右側(cè)乳液帶負(fù)電,隨著pH增加,乳液電位絕對值呈先上升后下降趨勢(圖6)。該結(jié)果與MP 的Zeta 電位(圖1)相一致。

    圖6 pH 對MP 乳液的Zeta 電位的影響Fig.6 Effect of pH on Zeta potential of myofibrillar protein emulsions

    pH 對MP 乳液穩(wěn)定性的影響 不同pH處理對大黃魚MP 乳液穩(wěn)定性的結(jié)果顯示,乳液在靜置10 d 后,乳析指數(shù)基本穩(wěn)定(圖7)。在等電點左側(cè),乳析指數(shù)較大,乳液穩(wěn)定性較差。在等電點右側(cè),隨pH 值(6~12)增加,乳析指數(shù)先減后增,乳液穩(wěn)定性在pH 8 下穩(wěn)定性較好。在pH 12 時,MP 可能過度交聯(lián)聚集,導(dǎo)致乳液穩(wěn)定性下降,13 d 后出現(xiàn)破乳(圖7)。

    3 討論

    3.1 pH 處理對大黃魚MP 結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響

    pH 對 MP 電位的影響 Zeta 電位是指膠體分散體電動勢,絕對值越大意味著靜電斥力越大,與溶解度有關(guān)[27]。在等電點附近,MP 表面帶電荷較少,靜電相互作用最小,可能是由于范德華力和氫鍵促進(jìn)蛋白凝聚導(dǎo)致溶解度下降[28]。在等電點右側(cè),隨pH 增加,MP 表面攜帶負(fù)電荷越多,Zeta 電位絕對值越大。而在pH 12 時Zeta 電位絕對值略微降低,可能是由于MP 發(fā)生變性使表面暴露電荷減少。

    pH 對MP SDS-PAGE 的影響 SDSPAGE 電泳能直觀地呈現(xiàn)魚肉MP 的降解和變性情況[29]。堿處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性聚合形成大分子質(zhì)量聚集體[30]。在等電點左側(cè),凝膠頂部無聚集物,200 ku 處肌球蛋白重鏈條帶消失,小分子質(zhì)量蛋白條帶加深,可能是由于肌球蛋白重鏈發(fā)生了降解。pH 4 下MP 電泳條帶顏色較淺可歸因于接近等電點使其蛋白濃度降低所致。與先前報道相符,與酸性條件相比,肌動蛋白在堿性條件下蛋白條帶有加深趨勢[31]。

    pH 對 MP 接觸角的影響 三相接觸角(θ)可用于標(biāo)識MP 的親疏水性,一定程度反映MP在油水界面的分布、乳液的類型和穩(wěn)定性[32]。天然蛋白質(zhì)分子中,親水基團(tuán)一般暴露在外部并且可與水相互作用,疏水基團(tuán)則位于蛋白分子內(nèi)部[33]。堿處理后,肌原纖維蛋白構(gòu)象變化,可能由于疏水基團(tuán)暴露在外部導(dǎo)致疏水性增加。

    pH 對 MP 內(nèi)源熒光性的影響 蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光性主要來源于色氨酸,色氨酸對微環(huán)境的改變極其敏感[34]。最大發(fā)射波長小于330 nm,表明色氨酸基團(tuán)位于蛋白分子內(nèi)部非極性環(huán)境中;最大發(fā)射波長大于330 nm,表明色氨酸位于蛋白分子外部極性環(huán)境中[22]。在等電點左側(cè),接近等電點,蛋白發(fā)生聚集,色氨酸包埋在蛋白分子內(nèi)部;在等電點右側(cè),隨pH 增加,蛋白質(zhì)分子排列順序發(fā)生變化,三級結(jié)構(gòu)展開,色氨酸向外部極性環(huán)境逐漸暴露,導(dǎo)致內(nèi)源熒光強(qiáng)度增加[35]。該結(jié)果表明,MP 內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,內(nèi)部疏水氨基酸暴露在蛋白表面,這與接觸角的結(jié)果相一致(圖3)。

    3.2 pH 對大黃魚MP 乳化特性的影響

    pH 對MP 乳液微觀形貌的影響 顯微鏡常用于觀察乳滴,直觀反映乳滴的顆粒大小和分散情況。Liu 等[36]研究新鮮乳液經(jīng)1% SDS 溶液處理后的粒徑分布,結(jié)果表明1% SDS 可以使油滴在乳液中保持分離,乳滴大小可以反映蛋白質(zhì)的乳化能力,乳滴粒徑越小,乳化能力越強(qiáng)。由此可以判斷,在等電點左側(cè)MP 的乳化能力較差;在等電點右側(cè),pH 4~8 時MP 的乳化能力逐漸增強(qiáng),隨著pH 值繼續(xù)增加,乳滴粒徑繼續(xù)減小,同時聚集程度不斷加深,在pH 12 穩(wěn)定的乳液中出現(xiàn)明顯聚集。

    pH 對MP 乳液Zeta 電位的影響 乳液液滴表面帶電量可在一定程度上反映乳滴的穩(wěn)定性[37]。電位的絕對值越大,油滴間的靜電斥力越大,阻止乳滴間發(fā)生聚集,從而有利于乳液的穩(wěn)定性[38]。乳滴粒徑減小導(dǎo)致表面積更大,分散粒子表面顯示更多電荷,從而導(dǎo)致乳液Zeta 電位絕對值增加[39]。在pH 8 時,乳液的Zeta 電位絕對值達(dá)到最大值[(49.63±1.52) mV]。在pH 12 時,乳滴發(fā)生聚集,可能是由于MP 顆粒通過靜電相互作用所致。

    pH 對MP 乳液穩(wěn)定性的影響 從宏觀角度,通常利用乳析指數(shù)表征乳液的穩(wěn)定性變化,乳析指數(shù)越小乳液越穩(wěn)定[38]。Kurt[40]研究pH 對乳液穩(wěn)定性的影響,結(jié)果表明pH 值遠(yuǎn)離等電點時凈電荷增加,促使乳液穩(wěn)定性增加。大黃魚MP乳液Zeta 電位遠(yuǎn)離蛋白等電點,乳滴表面MP 彼此間的靜電排斥有利于乳液的穩(wěn)定性。通過不同pH 下乳液在不同貯藏時間的外觀觀察,觀察到乳液的乳化程度和破乳現(xiàn)象,與以上乳液特性分析相一致。

    綜上所述,從大黃魚MP 的開發(fā)利用出發(fā),本研究在不同pH (2~12)條件下處理大黃魚MP,對其結(jié)構(gòu)性質(zhì)和乳化穩(wěn)定性進(jìn)行分析。在pH 12 時,MP 發(fā)生聚集,導(dǎo)致絕對值略微降低。堿性條件下MP 更易聚集,其內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,疏水氨基酸暴露在蛋白表面,疏水性增加。本研究表明,在pH 8 下乳液穩(wěn)定性較好,而在pH 12 下乳液貯藏13 d 后蛋白變性聚集,導(dǎo)致乳液失穩(wěn)出現(xiàn)破乳。利用pH 處理可以達(dá)到改善大黃魚MP 加工特性的目的,為今后其在食品工業(yè)中的加工應(yīng)用提供指導(dǎo)依據(jù)。

    (作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突)

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