葉面噴施鎂對(duì)紫米產(chǎn)質(zhì)量、花青素及代謝物含量的影響

杜雪麗，柯璐瑤，柳 展，代明珠，周 宇，李劍興，徐玖亮

（1.云南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100080；3.勐海曼香云天農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，云南 勐海 666200）

隨著生活水平不斷提高，人們?cè)絹?lái)越注重健康，對(duì)營(yíng)養(yǎng)保健食品的需求不斷增加，紫米因其具有多種藥理作用和極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到了廣泛關(guān)注[1]。紫米在我國(guó)種植歷史悠久，主要分布在云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)等[2]，是消費(fèi)量最大的功能稻米[3]。云南省西雙版納傣族自治州是紫米的主要種植區(qū)之一，其得天獨(dú)厚的自然條件非常適合紫米的生長(zhǎng)，紫米也成了當(dāng)?shù)氐奶厣a(chǎn)業(yè)。與普通大米相比，紫米富含花青素等功能性物質(zhì)[2]。花青素是植物中的多酚類天然水溶色素，屬類黃酮化合物，主要分布在花、葉、果實(shí)、籽粒等組織中?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸痆4]、預(yù)防癌癥[5-6]、提高視覺(jué)功能[7]、保護(hù)心血管系統(tǒng)[8-9]、消炎抑菌[10]、調(diào)節(jié)免疫[11]、改善記憶力[12]等功能。紫米產(chǎn)量、品質(zhì)及花青素合成受遺傳和外界環(huán)境因素的調(diào)控，施肥是重要的外界影響因素。李冠男[13]采用田間長(zhǎng)期定位施肥試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氮、磷、鉀肥配施對(duì)提高稻米品質(zhì)具有較好的促進(jìn)作用。王宇智[14]在沈陽(yáng)市遼中區(qū)，通過(guò)氮肥調(diào)控發(fā)現(xiàn)，適宜的施氮量能提高水稻產(chǎn)量，促進(jìn)稻米的加工品質(zhì)。盧浩宇等[15]研究發(fā)現(xiàn)，施氮量150 kg/hm2、配施有機(jī)肥比例為50%～75%時(shí)，有利于增加紫米的產(chǎn)量，提升品質(zhì)。趙廷丞[16]研究發(fā)現(xiàn)，30%有機(jī)肥配施70%無(wú)機(jī)肥可以提高有色稻產(chǎn)量及籽?；ㄇ嗨睾俊Ｒ虼?，施肥對(duì)提高水稻產(chǎn)量、品質(zhì)及花青素含量具有重要影響。

鎂是繼氮、磷、鉀之后作物必需的第四大營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響[17]。鎂對(duì)作物的葉綠體結(jié)構(gòu)有重要作用，約35%的鎂在葉綠體內(nèi)，可促進(jìn)膜的垛疊，增強(qiáng)作物葉片光合作用[18-20]。鎂對(duì)植物的新陳代謝有重要影響，鎂是各種酶的基本要素，也是最活躍的組分，與蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的代謝和能量的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[21]。同時(shí)，鎂還參與其他物質(zhì)與結(jié)構(gòu)的形成，例如：碳水化合物分配、能量代謝、蔗糖韌皮部裝載、活性氧代謝等[22]。此外，鎂在緩解重金屬、鹽和鋁脅迫等非生物脅迫方面也有重要的作用[23]。

目前，關(guān)于水稻產(chǎn)量、品質(zhì)及花青素含量的研究主要集中在氮、磷等大量元素肥料的用量、種類、施用方式[24-27]以及播期[28]、種植密度[29]等的影響方面。與土施相比，葉面噴施能根據(jù)不同發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)特征，更加靈活地進(jìn)行追肥，具有用量少、見(jiàn)效快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[30-31]。但關(guān)于葉面噴施鎂等中微量元素對(duì)水稻的影響研究很少，且主要集中在提高水稻產(chǎn)量、改善品質(zhì)方面[32]，尚未見(jiàn)對(duì)紫米花青素及代謝物含量的影響研究。為此，探究葉面噴施鎂對(duì)紫米產(chǎn)質(zhì)量、花青素及代謝物含量的影響，以期為優(yōu)化紫米栽培措施提供科學(xué)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況及試驗(yàn)材料

試驗(yàn)田位于云南省西雙版納傣族自治州勐?？h勐遮鎮(zhèn)曼根村曼莊小組（100°23'E、21°95'N），海拔1 255.0 m，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，多年平均氣溫18.4 ℃，年平均日照時(shí)間2 113.2 h，年降水量1 301.9 mm，種植制度為水稻—馬鈴薯輪作，一年兩熟制。試驗(yàn)田土壤質(zhì)地為壤土，0～20 cm 土壤初始pH 值為5.6，有機(jī)質(zhì)含量為33.1 g/kg，速效磷含量為21.0 mg/kg，速效鉀含量為146.0 mg/kg，全氮含量為1.9 g/kg，鎂含量為71.0 mg/kg.。

供試紫米品種為滇香紫1 號(hào)，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和墨江農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心共同選育。氮肥為尿素（含N 46%），磷肥為過(guò)磷酸鈣（含P2O514%），鉀肥為氯化鉀（含K2O 60%），均購(gòu)自云天化集團(tuán)有限責(zé)任公司。氧化鎂（含MgO 99.99%），購(gòu)自阿拉丁。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)處理，分別為葉面噴施蒸餾水（CK）、2% MgO（MgⅠ）、3% MgO（MgⅡ），每個(gè)處理設(shè)5 個(gè)重復(fù)，隨機(jī)排列，小區(qū)面積為100 m2（10 m×10 m），噴施量為300 L/hm2，分別在抽穗期和灌漿期各噴施1 次。N、P2O5、K2O 施用量分別為180、75、90 kg/hm2，氮肥按照基肥∶分蘗肥∶穗肥=4∶3∶3 施用，磷肥全部用作基肥，鉀肥按照基肥∶追肥=1∶1施用。2022 年2 月15 日插秧，種植密度是2.5×106穴/hm2。其他管理按照當(dāng)?shù)卮筇锕芾怼?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)量及其構(gòu)成因素測(cè)定 在成熟期，取10穴植株，調(diào)查穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒質(zhì)量；小區(qū)實(shí)收，放置陰涼通風(fēng)處風(fēng)干，直至水分達(dá)到13.5%左右，計(jì)產(chǎn)。

1.3.2 加工品質(zhì)測(cè)定 籽粒脫殼、碾磨，按照GB 1350—2009的方法測(cè)定糙米率和整精米率[33]。

1.3.3 花青素提取及含量測(cè)定 取40 mg 籽粒置于球磨儀中振動(dòng)研磨3 min，將粉末置于提取瓶中，加入4 mL 預(yù)冷提取劑（V乙醇∶V水∶V鹽酸=70∶29∶1），旋渦振蕩30 s 后超聲30 min（4 ℃），-20 ℃靜置過(guò)夜，取2 mL 上清液用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾后放置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ』ㄇ嗨貥?biāo)品配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以標(biāo)品峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取待檢測(cè)樣本，采用Nexera X2 LC-30AD高效液相色譜（Shimadzu）串聯(lián)QTRAP5500 質(zhì)譜儀（AB SCIEX）組成的LC-MS 進(jìn)行花青素含量測(cè)定。所使用色譜柱為ACQUITY UPLC BEH 色譜柱（1.7 μm×2.1 mm×100 mm，Waters），流動(dòng)相：A 液為5%乙腈水溶液含20 mmol/L乙酸銨，B液為100%乙腈。柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流速0.3 mL/min。A液相梯度洗脫程序：0～1 min，95%；1～14 min，95%線性變化到65%；14～15 min，從65%線性變化到35%；15～17 min，35%；17～17.1 min，35% 線 性 變 化 到95%；17.1～20 min，95%。樣本隊(duì)列中每隔8 個(gè)試驗(yàn)樣本設(shè)置1個(gè)QC樣本，用于對(duì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及重復(fù)性進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)。ESI源參數(shù)：ESI電子噴霧電壓5 500 V或-4 500 V，毛細(xì)管溫度550 ℃；離子源加熱輔助氣40 psi，氣簾氣50 psi[34]。

1.3.4 代謝組學(xué)分析 取80 mg 籽粒，放入球磨儀中振動(dòng)研磨3 min，加入2 mL 預(yù)冷提取液（V甲醇∶V乙醇∶V水=4∶4∶2），旋渦振蕩30 s 后超聲60 min（4 ℃），-20 ℃靜置過(guò)夜，在4 ℃條件下16 000×g離心10 min，取上清液用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾后放置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于檢測(cè)代謝物含量，同1.3.3用LC-MS進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；采用Simca-P+ 23 軟件對(duì)代謝物進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。根據(jù)PLS-DA模型獲得變量權(quán)重值（VIP），將VIP 值大于1 且P值小于0.05的代謝物定義為差異代謝物（SCMs），同時(shí)將差異代謝物通過(guò)代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）進(jìn)行注釋解析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面噴施鎂對(duì)紫米產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響

如表1 所示，各處理紫米產(chǎn)量表現(xiàn)為MgⅡ＞MgⅠ＞CK。與CK 相比，MgⅠ處理產(chǎn)量顯著提高了10.0%，MgⅡ處理產(chǎn)量顯著提高了15.8%，但MgⅠ處理與MgⅡ處理產(chǎn)量無(wú)顯著差異。從產(chǎn)量構(gòu)成因素看，葉面噴施鎂可顯著提高結(jié)實(shí)率和千粒質(zhì)量，但對(duì)穗數(shù)和穗粒數(shù)無(wú)顯著影響，與CK 相比，MgⅠ、MgⅡ處理結(jié)實(shí)率顯著提高了3.3%、5.1%，MgⅠ、MgⅡ處理千粒質(zhì)量顯著提高了3.4%、3.0%，但結(jié)實(shí)率和千粒質(zhì)量在MgⅠ、MgⅡ處理之間均無(wú)顯著差異。

表1 葉面噴施鎂對(duì)紫米產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響Tab.1 Effect of foliar spray of magnesium on purple rice yield and its component

2.2 葉面噴施鎂對(duì)紫米加工品質(zhì)的影響

如圖1 所示，葉面噴施鎂對(duì)紫米糙米率無(wú)顯著影響，所有處理均在74%左右；葉面噴施鎂能顯著提高整精米率，與CK 相比，MgⅠ、MgⅡ處理整精米率分別顯著提高了6.9%、5.2%，但MgⅠ、MgⅡ處理之間無(wú)顯著差異。

圖1 葉面噴施鎂對(duì)紫米加工品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of foliar spray of magnesium on processing quality of purple rice

2.3 葉面噴施鎂對(duì)紫米花青素含量的影響

本研究在紫米中檢測(cè)出了3個(gè)主要花青素類化合物，分別為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖2 紫米中3種主要花青素類化合物結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure formula of three main anthocyanins in purple rice

如圖3 所示，葉面噴施鎂顯著提高了紫米中矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量，對(duì)矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷含量無(wú)顯著影響。與CK 相比，MgⅠ和MgⅡ處理矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷含量分別顯著增加了28.9%和23.5%，芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量分別顯著增加了28.5% 和27.6%，但矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量在MgⅠ處理和MgⅡ處理間均無(wú)顯著差異。

圖3 葉面噴施鎂對(duì)紫米花青素含量的影響Fig.3 Effect of foliar spray of magnesium on anthocyanin content of purple rice

2.4 葉面噴施鎂條件下紫米中代謝物的主成分分析

本研究，在紫米中共鑒定出182個(gè)代謝物，包括氨基酸15 個(gè)、苯型烴類7 個(gè)、脂類6 個(gè)、核苷類35個(gè)、有機(jī)酸類57個(gè)、有機(jī)雜環(huán)34個(gè)和其他代謝物28個(gè)。對(duì)代謝物進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，PC1 的貢獻(xiàn)率為20.3%，PC2 的貢獻(xiàn)率為13.7%。沿著PC1 軸方向分為2 組，第1 組是CK 代謝物，第2 組是MgⅠ處理和MgⅡ處理代謝物；沿著PC2 軸可以將MgⅠ處理和MgⅡ處理代謝物區(qū)分開(kāi)，但不明顯（圖4A）。

圖4 不同處理紫米中代謝物的PCA（A）與PLS-DA（B）分析Fig.4 PCA（A）and PLS-DA（B）analysis of metabolites in purple rice of different treatment

通過(guò)PLS-DA 模型進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，沿著PC1軸方向，葉面噴施鎂處理（MgⅠ處理和MgⅡ處理）代謝物與葉面不噴施鎂處理（CK）代謝物有明顯差異；沿著PC2 軸方向，MgⅠ處理和MgⅡ處理代謝物有明顯差異（圖4B）。R2（X）為0.55，R2（Y）為0.99，Q2為0.85，表示模型較穩(wěn)定、預(yù)測(cè)能力較好。

2.5 葉面噴施鎂與不噴施鎂條件下紫米中的差異代謝物分析

本研究最終篩選出42 個(gè)差異代謝物（圖5），占所鑒定代謝物的23%。其中，MgⅠ處理中有25 個(gè)代謝物含量較CK 顯著提高，包括羥基異已酸、肌酸酐、3-酰脲丙酸、肌酸、N-乙酰-L-丙氨酸、2-酮-D-葡糖酸、L-蘋(píng)果酸、乙酰膽堿、2-甲基精氨酸、新蝶呤、苯丙氨酸、苯基乙?；?L-谷氨酰胺、L-高絲氨酸、犬尿酸、異冬谷酸、葡萄糖醛酸、天冬酰胺、5-羥基色氨酸、天冬氨酸、L-肌肽、N-乙酰葡糖胺、精氨酸、黃素單核苷酸、谷胱甘肽二硫化物、N6-乙酰賴氨酸；有17 個(gè)代謝物含量較CK 顯著降低，包括L-半胱氨酸、蔗糖、二羥基丙酮、4-吡哆酸、甘油-3-磷酸、5'-肌苷酸、氨基馬尿酸、肌醇、磷酸硫胺素、柚皮苷、β-羥丁酸、焦磷酸硫胺素、2，3-二甲氧基苯甲酸、二磷酸鳥(niǎo)苷、腺嘌呤核糖核苷酸、三磷酸腺苷、烏頭酸鹽。MgⅡ處理中有16 個(gè)代謝物含量較CK顯著提高，包括2-甲基精氨酸、新蝶呤、苯丙氨酸、苯基乙?；?L-谷氨酰胺、L-高絲氨酸、犬尿酸、異冬谷酸、天冬酰胺、5-羥基色氨酸、天冬氨酸、L-肌肽、N-乙酰葡糖胺、精氨酸、黃素單核苷酸、谷胱甘肽二硫化物、N6-乙酰賴氨酸；有26 個(gè)代謝物含量較CK 顯著降低，包括L-半胱氨酸、蔗糖、二羥基丙酮、4-吡哆酸、甘油-3-磷酸、5'-肌苷酸、氨基馬尿酸、肌醇、磷酸硫胺素、柚皮苷、β-羥丁酸、焦磷酸硫胺素、2，3-二甲氧基苯甲酸、二磷酸鳥(niǎo)苷、腺嘌呤核糖核苷酸、三磷酸腺苷、烏頭酸鹽、羥基異已酸、肌酸酐、3-酰脲丙酸、肌酸、N-乙酰-L-丙氨酸、2-酮-D-葡糖酸、L-蘋(píng)果酸、乙酰膽堿、葡萄糖醛酸。這42 個(gè)差異代謝物包括有機(jī)酸15 個(gè)、苯型烴類3 個(gè)、氨基酸類4個(gè)、脂類3個(gè)、核苷酸類3個(gè)、有機(jī)雜環(huán)類7個(gè)、其他7個(gè)。相對(duì)于CK，MgⅠ、MgⅡ處理代謝物含量都顯著提高的有16 個(gè)，包括2-甲基精氨酸、新蝶呤、苯丙氨酸、苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、L-高絲氨酸、犬尿酸、異冬谷酸、天冬酰胺、5-羥基色氨酸、天冬氨酸、L-肌肽、N-乙酰葡糖胺、精氨酸、黃素單核苷酸、谷胱甘肽二硫化物、N6-乙酰賴氨酸。葉面噴施鎂能顯著提高紫米籽粒中苯丙氨酸含量。

圖5 葉面噴施鎂與不噴施鎂條件下紫米中差異代謝物分析Fig.5 Analysis of differential metabolites in purple rice grains between spraying magnesium treatment and treatment without magnesium

2.6 葉面噴施鎂與不噴施鎂條件下紫米中差異代謝物的代謝通路分析

KEGG富集分析（圖6）發(fā)現(xiàn)，葉面噴施鎂與不噴施鎂條件下紫米中42 個(gè)差異代謝物共富集到10 條代謝通路中，主要包括三羧酸循環(huán)、苯丙氨酸代謝、氧化磷酸化、輔因子的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、硫胺素代謝、糖酵解/糖原異生、丙酮酸鹽代謝、β-丙氨酸代謝和丙酸代謝。

圖6 葉面噴施鎂與不噴施鎂條件下紫米中差異代謝物的代謝通路分析Fig.6 Analysis of metabolic pathway of different metabolites in purple rice grain between spraying magnesium treatment and treatment without magnesium

3 結(jié)論與討論

3.1 葉面噴施鎂對(duì)紫米產(chǎn)量和加工品質(zhì)的影響

在作物生長(zhǎng)過(guò)程中，鎂是必需礦物質(zhì)元素之一，參與葉綠素合成、光合作用、能量代謝和酶活化等基礎(chǔ)性生理過(guò)程，土壤中鎂的豐缺對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)的形成有顯著影響[34]。施鎂對(duì)作物產(chǎn)量有顯著影響[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施鎂對(duì)水稻穗數(shù)和穗粒數(shù)無(wú)顯著影響，但顯著提高了結(jié)實(shí)率和千粒質(zhì)量及產(chǎn)量，這與前人[36-38]研究結(jié)果一致。合理施用鎂肥能夠促進(jìn)水稻干物質(zhì)積累，在灌漿期噴鎂肥提高籽粒庫(kù)的生理活性，促進(jìn)莖葉中碳水化合物向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)，提高水稻的千粒質(zhì)量和結(jié)實(shí)率，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)[36]。

施用鎂肥可顯著改善小麥、大豆、蔬菜、茶葉等的品質(zhì)[39-41]。大量研究結(jié)果表明，噴施鎂肥可改善稻米品質(zhì)，提高糙米率、整精米率[42-45]。王猛[45]研究發(fā)現(xiàn)，追施鎂肥能提高稻米的加工品質(zhì)。錢(qián)永德[38]研究發(fā)現(xiàn)，適量鎂肥配合氮肥施用可提高稻米的整精米率和整精米產(chǎn)量。在本研究中，葉面噴施鎂顯著提高了整精米率，而糙米率無(wú)明顯差異。這可能是因?yàn)榈竟戎兴趾枯^高，其在糙米與稻殼間直接以游離水形態(tài)存在，致使在礱谷階段水分容易損失，最終導(dǎo)致糙米率下降，直接掩蓋鎂對(duì)糙米率的影響[46]，也可能與滇香紫1號(hào)品種特性有關(guān)。

3.2 葉面噴施鎂對(duì)紫米中花青素含量的影響

與普通大米相比，紫米富含花青素，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能[47]。花青素穩(wěn)定性較差且易發(fā)生降解作用，很少有游離的花色素存在于自然界中，其主要以花色苷的形式存在[48-49]。通?；ㄇ嗨厥且蕴擒真I與一個(gè)或多個(gè)糖類物質(zhì)相連形成花色苷。研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施鎂肥可提高光合色素含量，促進(jìn)光合產(chǎn)物生成，為花色苷的合成提供更多底物；此外，Mg2+能與花青素發(fā)生螯合作用，使其更加穩(wěn)定生成螯合物[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施鎂顯著促進(jìn)了紫米中苯丙氨酸積累，這與前人[48]研究結(jié)果一致。苯丙氨酸屬于芳香族氨基酸，是花青素合成的直接前體物質(zhì)，在合成花青素的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[51]。因此，苯丙氨酸含量增加促進(jìn)了花青素的合成。鎂促進(jìn)紫米中苯丙氨酸代謝，這可能是因?yàn)镸g2+作為植物葉綠素的中心原子，是葉綠素的組成成分之一，水稻適量吸收Mg2+能夠極大地增強(qiáng)光合作用強(qiáng)度，促進(jìn)代謝循環(huán)[52-53]。同時(shí)Mg2+能活化大多數(shù)的激酶和磷酸酶，影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定合成等[54]，從而提高苯丙氨酸裂解酶（PAL）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）等一系列酶的活性，促進(jìn)代謝。此外，云南省西雙版納傣族自治州位于云貴高原，水稻季白天溫度較高，葉面噴施鎂增加水稻中鎂含量可以防止高溫對(duì)其造成有害影響。

綜上，葉面噴施鎂能提高紫米產(chǎn)量、加工品質(zhì)和花青素含量，促進(jìn)三羧酸循環(huán)苯丙氨酸代謝、脯氨酸代謝、精氨酸代謝等，顯著提高了花青素合成前體物質(zhì)苯丙氨酸的含量，從而促進(jìn)紫米中花青素積累。