雞減蛋綜合征病毒中和性單克隆抗體的制備、鑒定及在雙抗體夾心ELISA 中的應(yīng)用

魏 薔，李青梅，金前躍，宋亞鵬，白怡霖，張改平，

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室/河南省動物免疫學重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002；3.鄭州大學 農(nóng)學院，河南 鄭州 450001）

雞減蛋綜合征（Egg drop syndrome，EDS）是由減蛋綜合征病毒（EDSV）感染引起的疾病。EDSV 感染會影響蛋雞的生產(chǎn)能力，導致它們產(chǎn)出軟殼、薄殼或無殼的蛋，并且蛋雞的產(chǎn)蛋率也會顯著下降，使養(yǎng)雞業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟損失。EDS 于1976 年由荷蘭科學家VAN ECK 等[1]首次發(fā)現(xiàn)并報道，隨后世界各地相繼分離出多株該病毒。在我國，李剛等[2]于1992 年從南京某發(fā)病雞場分離到EDSV。目前，減蛋綜合征已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)引起產(chǎn)蛋損失的主要病因之一。

EDSV 是一種無囊膜的雙鏈DNA 病毒，具有典型的腺病毒形態(tài)。五鄰體（Penton）、六鄰體（Hexon）和纖維蛋白（Fiber）是腺病毒的3 個主要結(jié)構(gòu)蛋白。Penton 和Fiber 以非共價鍵連接形成的復合物構(gòu)成EDSV 二十面體的12 個頂點，F(xiàn)iber 以三聚體的形式存在并向外伸展，形成纖突。纖維蛋白由3 個部分組成：N 端尾區(qū)（Tail）、多個三連β 螺旋重復片段構(gòu)成的柄區(qū)（Shaft）和一個C 端的球狀頭區(qū)（Knob）。與其他腺病毒類似，纖維蛋白可能直接與宿主細胞表面受體相互作用，因而能夠高效誘導機體產(chǎn)生病毒中和抗體[3-5]，是最有效的保護性抗原以及血清學檢測中的理想靶標。

單克隆抗體可在快速診斷疫病方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，對于開發(fā)精確、靈敏和快速的診斷技術(shù)至關(guān)重要。在血清學試驗中，EDSV 和其他禽腺病毒會有一定程度的交叉反應(yīng)。因此，為了建立高特異性、高敏感性的EDSV 快速檢測方法，克服潛在的交叉反應(yīng)，應(yīng)當使用抗EDSV 的單克隆抗體進行檢測。以之前證明能夠誘導機體產(chǎn)生高水平中和抗體的EDSV 纖維蛋白作為免疫原免疫BALB/c 小鼠，通過細胞融合和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay，iELISA）以及間接免疫熒光試驗（Indirect immunofluorescence assay，IFA）篩選，制備抗EDSV 的單克隆抗體，旨在為免疫檢測試劑開發(fā)提供技術(shù)支撐，同時為EDSV 中和抗原表位研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒 小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0、EDSV 127株（GenBank accession number：AC_000004）均由本實驗室保存。鴨胚成纖維（Duck embryo fibroblast，DEF）細胞使用10～12 日齡鴨胚按常規(guī)方法制備[6]。

1.1.2 供試動物 6～8 周齡的雌性BALB/c 小鼠及經(jīng)產(chǎn)母鼠均購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.1.3 試劑 抗EDSV 陽性鼠血清由本實驗室保存；商品化抗His 標簽單克隆抗體購自Proteintech公司；DyLight 488 標記的兔抗鼠IgG 購自Abbkine公司；弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑、PEG1500、HT、HAT 培養(yǎng)基購自Sigma 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基、FBS 胎牛血清購自Gibco 公司；DNA 提取試劑盒購自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 重組EDSV 纖維蛋白的鑒定 參考本實驗室此前文獻報道方法[4]，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達、純化得到重組EDSV 纖維蛋白。重組纖維蛋白的純度及狀態(tài)采用SDS-PAGE 鑒定，同時因纖維蛋白具有血凝活性，采用血凝試驗（Hemagglutination，HA）鑒定重組蛋白血凝活性的方法測定其含量。

1.2.2 小鼠免疫 將5 只BALB/c 小鼠隨機分為免疫組（4 只小鼠）和對照組（1 只小鼠）。免疫組共進行4 次免疫，免疫EDSV 纖維蛋白抗原，對照組皮下注射PBS。首次免疫采用弗氏完全佐劑，其余3 次免疫采用弗氏不完全佐劑，免疫時采用皮下多點注射，免疫劑量20 μg/只，免疫間隔21 d。在第4 次免疫后的14 d，收集小鼠的血清樣本，并使用iELISA和IFA方法測定血清中的抗體效價。選擇效價最高的小鼠進行細胞融合。在進行細胞融合之前，向小鼠腹腔注射不含佐劑的重組纖維蛋白，即每只小鼠以50 μg的纖維蛋白進行超免。超免3 d后，無菌條件下取出小鼠的脾臟，并制備脾臟細胞用于后續(xù)的細胞融合試驗。

1.2.3 細胞融合及陽性雜交瘤細胞株篩選 超免后第3天，選取小鼠將其脫頸處死，按常規(guī)方法進行細胞融合[7]。使用含有HAT選擇劑的培養(yǎng)基稀釋融合細胞，并將其均勻分布到96孔細胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)10 d 后，使用纖維蛋白包被酶標板，采用iELISA方法鑒定雜交瘤細胞上清液。同時，使用IFA 方法對iELISA 方法檢測所得陽性孔進行復檢。選擇經(jīng)iELISA 法及IFA 法檢測均為陽性的孔，擴大培養(yǎng)至24 孔板。在對24 孔雜交瘤細胞上清進行iELISA 和IFA 復測后，選擇強陽性孔，使用有限稀釋法連續(xù)進行亞克隆，最終得到能夠穩(wěn)定分泌EDSV 抗體的單克隆雜交瘤細胞株。

1.2.4 IFA 鑒定 按常規(guī)方法制備DEF 細胞，將細胞均勻加入96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1 d后（匯合度達到80%），每孔接種200 TCID50EDSV，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以4%多聚甲醛固定細胞，隨后加入0.1%Triton X-100通透，之后加入5%的脫脂奶粉于37 ℃封閉1 h。PBS 漂洗后，加入待測樣品，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗6 次，按照每孔50 μL 的量向細胞培養(yǎng)孔中加入1∶1 000 稀釋的DyLight 488 標記的兔抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min，棄去溶液，PBS 洗6 次，每孔加入100 μL PBS，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 單克隆抗體腹水的制備及效價測定 預先對經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔注射滅菌液體石蠟，10 d 后，向每只小鼠腹腔注射0.5 mL 處于對數(shù)生長期的單克隆抗體雜交瘤細胞（約3×106個細胞）。8～14 d 后，采集腹水，12 000 r/min 離心15 min，吸取上清保存于-20 ℃?zhèn)溆?。同時使用iELISA 法及IFA 法檢測腹水效價。

1.2.6 Western blot 鑒定單克隆抗體的反應(yīng)性 取纖維蛋白加入上樣緩沖液，高溫加熱后進行SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜后，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，隨后試驗組使用單克隆抗體腹水為一抗，陽性對照組使用商品化抗His 標簽單克隆抗體為一抗，二者均采用HRP 標記的羊抗鼠IgG 為二抗，進行Western blot檢測。

1.2.7 單克隆抗體的EDSV 中和效價檢測 將倍比稀釋后的單克隆抗體腹水與200 TCID50的EDSV 等體積混合，37 ℃孵育1 h；棄去DEF 細胞培養(yǎng)板（匯合度達到80%）中的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 的上述混合物，37 ℃孵育2 h；PBS漂洗后，加入RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。參照IFA 方法對細胞進行處理，檢測時以陽性小鼠血清為一抗，DyLight 488標記的兔抗鼠IgG 為二抗，依據(jù)檢測結(jié)果采用Reed-Muench法計算抗體中和滴度。

1.2.8 單克隆抗體的亞型鑒定 采用Proteintech 公司的單克隆抗體亞型鑒定試劑盒進行單克隆抗體的亞型鑒定，按照產(chǎn)品說明書進行操作。

1.2.9 使用棋盤法對單抗進行配對試驗 利用GE Hitrap protein G 預裝柱純化單克隆抗體腹水，得到純化后的單克隆抗體。利用Lightning-Link 試劑盒標記單克隆抗體，得到HRP標記的單克隆抗體。使用棋盤法對單克隆抗體進行配對試驗。將HRP 偶聯(lián)標記的單抗作為檢測抗體；以未偶聯(lián)HRP組的單抗包被酶標板捕獲抗原用。利用1 μg/mL 的捕獲單抗包被酶標板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；PBST 洗板3 次后，5%脫脂奶粉封閉，37 ℃溫箱孵育2 h；洗板5 次后甩干，加入EDSV 纖維蛋白，質(zhì)量濃度為1 μg/mL，37 ℃溫箱孵育1 h；洗板后，加入檢測抗體，工作濃度同為1 μg/mL，37 ℃靜置1 h；顯色：加入TMB顯色，100 μL/孔，避光顯色10 min；利用酶標儀測定OD450值。

1.2.10 基于單克隆抗體9G12和10E11的雙抗體夾心ELISA 方法的建立 將單克隆抗體10E11作為捕獲抗體，HRP-9G12作為檢測抗體，建立雙抗體夾心ELISA 方法，應(yīng)用于EDSV 的檢測。棋盤法確定10E11 和HRP-9G12 的最適反應(yīng)濃度，對封閉液和封閉時間、包被抗體包被條件、抗原與捕獲抗體的反應(yīng)時間、顯色時間進行優(yōu)化。優(yōu)化后的檢測條件：使 用2 μg/mL 的10E11 包 被 酶 標 板，每 孔100 μL，4 ℃包被過夜；PBST 洗板4次后，5%脫脂奶封閉，37 ℃孵育2 h；洗板5 次后，加入待測樣品，37 ℃溫箱孵育1 h；洗板4 次后，加入稀釋過的檢測抗體HRP-9G12（0.8 μg/mL），每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；洗板3 次后，加入TMB 顯色，100 μL/孔，避光顯色10 min；隨后加入50 μL/孔終止液，酶標儀測定OD450值。使用該雙抗體夾心ELISA 方法檢測30 份EDSV 陰性樣品，確定cut-off 值，cut-off 值=OD450平均值+3×標準差。

1.2.11 基于單克隆抗體9G12和10E11的雙抗體夾心ELISA 方法的初步應(yīng)用 將12 只SPF 雞分成2組，試 驗 組9 只，肌 肉 注 射 攻 毒200 μL EDSV（TCID50=10-6.4/mL），對照組3 只，注射PBS，攻毒后7 d取肝臟病料。取0.2 g病料加入1 mL PBS進行研磨，10 000 r/min 離心5 min，上清用雙抗體夾心ELISA 方法進行抗原檢測，沉淀使用DNA 提取試劑盒進行DNA 提取，隨后采用熒光定量PCR 方法[4]進行抗原檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDSV纖維蛋白的純化與鑒定

利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達、制備EDSV 纖維蛋白，SDS-PAGE結(jié)果表明，重組纖維蛋白分子質(zhì)量約為30 ku，純化后蛋白質(zhì)純度可達95%以上。此外，在常溫條件下，即便在SDS 存在的情況下，纖維蛋白仍以三聚體的形式存在（圖1A），表明純化所得纖維蛋白具備三聚體天然狀態(tài)[8-11]。與EDSV 病毒粒子類似，純化所得纖維蛋白能夠凝集雞紅細胞，血凝效價為1∶27（圖1B）。

圖1 重組EDSV纖維蛋白SDS-PAGE鑒定及血凝活性檢測結(jié)果Fig.1 Results of SDS-PAGE and hemagglutination assay of recombinant EDSV fiber protein

2.2 EDSV纖維蛋白免疫BALB/c小鼠血清效價

將第4 次免疫后14 d 的小鼠血清倍比稀釋，分別用iELISA 和IFA 對免疫鼠及陰性鼠進行血清抗體效價檢測。iELISA 結(jié)果表明，4 只免疫鼠血清的抗體效價均較高，2 號鼠和4 號鼠的血清抗體效價達到了1∶409 600（表1）。IFA檢測結(jié)果顯示，4只免疫鼠中同樣可檢測到高抗體效價，其中1 號鼠和4號鼠IFA效價達到了1∶12 800（表2）。因此，后續(xù)選擇4號免疫鼠進行超免，用于取脾臟細胞制備雜交瘤細胞。

表1 EDSV纖維蛋白免疫鼠多克隆抗體血清iELISA效價Tab.1 The iELISA titers of polyclonal serum from mice immunized with EDSV fiber protein

表2 EDSV纖維蛋白免疫鼠多克隆抗體血清IFA效價Tab.2 The IFA titers of polyclonal serum from mice immunized with EDSV fiber protein

2.3 抗EDSV中和性單克隆抗體的篩選

雜交瘤細胞生長10 d 后，利用iELISA 方法及IFA 方法篩選陽性雜交瘤細胞株，擴大培養(yǎng)后，再次復檢，對強陽性孔進行亞克隆，收集單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清。將細胞培養(yǎng)上清與200 TCID50的EDSV 等體積混合，隨后采用1.2.7 所述EDSV 中和效價檢測方法檢測細胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體的中和活性，最終篩選得到2 株具有中和EDSV 感染活性的單克隆抗體9G12 和10E11。再次進行IFA驗證，結(jié)果顯示，單克隆抗體9G12 和10E11 均能與EDSV發(fā)生特異性反應(yīng)（圖2）。

圖2 EDSV單克隆抗體9G12和10E11 IFA檢測結(jié)果Fig.2 Detection of Monoclonal antibodies 9G12 and 10E11 against EDSV by IFA

2.4 抗EDSV中和性單克隆抗體腹水效價

利用iELISA 及IFA 方法分別檢測9G12 和10E11 單克隆抗體腹水的效價，結(jié)果如表3 所示，iELISA 檢測9G12 和10E11 單克隆抗體的腹水效價分別為1∶128 000 和1∶1 020 000；IFA 效價分別為1∶2 000和1∶8 000。

表3 單克隆抗體腹水iELISA及IFA效價Tab.3 Determination of monoclonal antibody ascites titers by iELISA and IFA

2.5 抗EDSV中和性單克隆抗體中和效價

將9G12 和10E11 的單克隆抗體腹水2 倍比系列稀釋后與200 TCID50的EDSV 等體積混合，采用1.2.7所述EDSV中和效價檢測方法進行檢測。結(jié)果表 明，9G12 和10E11 的 中 和 效 價 分 別 為1∶27和1∶24。

2.6 抗EDSV中和性單克隆抗體的反應(yīng)性

向純化所得EDSV 纖維蛋白樣品中加入上樣緩沖液，高溫加熱后進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜后，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，隨后試驗組使用單克隆抗體腹水9G12 和10E11 作為一抗進行檢測，對照組使用商品化抗His 標簽單克隆抗體作為一抗進行檢測。檢測結(jié)果表明，試驗組單克隆抗體9G12 和10E11 均不能識別變性的纖維蛋白（圖3A、3B），對照組抗His 標簽單克隆抗體則可以識別變性的纖維蛋白，且由于樣品中仍有少量纖維蛋白聚體存在，Western blot 分析結(jié)果顯示2 條帶（圖3C）。由于9G12 和10E11 在iELISA 及IFA 試驗中與纖維蛋白及EDSV 均能產(chǎn)生特異性反應(yīng)，但在Western blot 鑒定中卻不識別變性的纖維蛋白，由此推斷，9G12和10E11識別的纖維蛋白抗原表位為構(gòu)象表位。

圖3 抗EDSV中和性單克隆抗體對變性EDSV纖維蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.3 Western blot results of the recombinant EDSV fiber protein detected by the neutralizing monoclonal antibodies against EDSV

2.7 抗EDSV中和性單克隆抗體的亞型鑒定

單克隆抗體9G12和10E11屬于同種抗體亞型，其重鏈均為IgG1亞型，輕鏈均為Kappa型。

2.8 抗EDSV中和性單克隆抗體配對的結(jié)果

通過棋盤法對5株HRP標記單抗和5株未標記單抗進行配對，當中和性單克隆抗體10E11 作為捕獲抗體時，均有陽性信號，但是HRP-9G12 作為檢測抗體和10E11 配對時，OD450值是最高的（表4）。因此，選擇單克隆抗體10E11 作為捕獲抗體，HRP-9G12作為檢測抗體，建立雙抗體夾心ELISA方法。

表4 抗EDSV中和性單克隆抗體配對的結(jié)果Tab.4 Pairing results of neutralizing monoclonal antibody against EDSV

2.9 基于抗EDSV 中和性單克隆抗體9G12 和10E11的雙抗體夾心ELISA方法的應(yīng)用

通過檢測30份EDSV 陰性樣品的OD450值，確定該雙抗體夾心ELISA 方法的Cut-off 值為0.215。在病料檢測中，12 份樣品的ELISA 檢測結(jié)果見圖4，88.9%（8/9）的攻毒樣品檢測為陽性，100%（3/3）的對照組樣品檢測為陰性。熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，100%（9/9）的攻毒樣品檢測為陽性，100%（3/3）的對照組樣品檢測為陰性。以熒光定量PCR 檢測結(jié)果為標準，雙抗體夾心ELISA 方法的檢測結(jié)果符合率為91.7%（11/12）（表5）。

表5 雙抗體夾心ELISA方法與熒光定量PCR方法檢測結(jié)果Tab.5 Results of sandwich ELISA and real-time PCR methods

圖4 雙抗體夾心ELISA方法對12份樣品的檢測結(jié)果Fig.4 Determination of 12 samples by the sandwich ELISA method

3 結(jié)論與討論

減蛋綜合征是蛋雞養(yǎng)殖行業(yè)重點防治疾病之一，養(yǎng)雞場一旦有蛋雞感染EDSV，可造成嚴重的經(jīng)濟損失。單克隆抗體對于建立特異、敏感、快速檢測EDSV 的方法尤為重要。孔德迎等[12]使用純化的EDSV 病毒為免疫原，篩選得到5 株單克隆抗體，通過ELISA 方法鑒定其特異性，但并未對單克隆抗體的中和活性進行表征，并且未建立高特異性、高敏感型的檢測方法。與其他禽腺病毒類似，纖維蛋白是EDSV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導機體產(chǎn)生特異性中和抗體，是制備EDSV 單克隆抗體的理想抗原[13-15]。本實驗室前期利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備了EDSV 重組纖維蛋白，具備天然三聚體結(jié)構(gòu)，且在SDS 存在的條件下仍能維持其天然狀態(tài)，甚至在高溫加熱后仍然有少量聚體存在，表明其具有較高的穩(wěn)定性，同時該重組蛋白具有類似天然EDSV 病毒粒子凝集雞紅細胞的HA 活性，能夠誘導機體產(chǎn)生高水平中和抗體[4]。綜上，純化所得重組纖維蛋白是理想的免疫原。因此，本研究利用該重組纖維蛋白作為免疫原，最終篩選得到2 株穩(wěn)定分泌中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株9G12和10E11。

本研究在純化纖維蛋白的基礎(chǔ)上進行了血凝效價的測定，并以此作為免疫單位，避免了以目的蛋白含量為免疫單位時存在的問題。不同批次蛋白質(zhì)純度不同導致目的蛋白含量難以確定，而利用血凝效價則直接可以判斷免疫原的含量，保證目的蛋白含量穩(wěn)定。制備的單克隆抗體9G12 和10E11經(jīng)iELISA 及IFA 檢測，結(jié)果顯示，單克隆抗體與重組纖維蛋白及EDSV 病毒粒子均發(fā)生特異性反應(yīng)，表明這2株單克隆抗體能夠識別二者天然狀態(tài)下的抗原表位。但是Western blot 結(jié)果表明，9G12 和10E11 不能識別變性的重組纖維蛋白，表明變性條件下抗體識別的纖維蛋白抗原表位發(fā)生了變化，導致變化后的表位無法被單克隆抗體識別，從而揭示出這2株單克隆抗體識別的表位為構(gòu)象型表位。單克隆抗體中和效價測定顯示，9G12 的中和效價為1∶27，10E11的中和效價為1∶24，這表明9G12具有更高的中和EDSV病毒感染活性。

目前，EDSV 的檢測方法主要是HA 及熒光定量PCR 等[16-21]。HA 方法檢測每次均需要取用新鮮的雞紅細胞，不利于臨床大批量簡便操作，且無法排除其他有血凝活性病毒的干擾。雖然熒光定量PCR 方法靈敏度高、特異性強，但是其檢測過程復雜，需要專業(yè)儀器及專業(yè)人員操作，通常用于實驗室檢測，因此不利于臨床快速診斷。相比之下，ELISA方法具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等特點。免疫膠體金技術(shù)具有操作簡便、成本低、反應(yīng)快、不依賴于特殊的儀器設(shè)備、用肉眼即可對結(jié)果進行判讀的特點，且同時具有良好的特異性和敏感性。以本研究篩選的單克隆抗體為分子基礎(chǔ)建立膠體金免疫層析試紙條或建立ELISA 檢測方法，可實現(xiàn)臨床上準確、快速檢測EDSV，具有重要的應(yīng)用價值。在本研究中，以單克隆抗體10E11 作為捕獲抗體，HRP-9G12作為檢測抗體，初步建立了雙抗體夾心ELISA方法。將該雙抗體夾心ELISA方法應(yīng)用于EDSV 抗原檢測，在臨床病料檢測中與熒光定量PCR檢測結(jié)果的符合率為91.7%。

綜上所述，本研究成功篩選到2 株識別EDSV纖維蛋白構(gòu)象表位的中和性單克隆抗體，為EDSV纖維蛋白中和表位鑒定奠定了基礎(chǔ)，為EDSV 抗原的臨床檢測提供了技術(shù)支持。