玻璃化冷凍時間對凍胚移植妊娠結(jié)局的影響

屈瀟瀟,哈靈俠,杜玉冬,王金娟

近年來,玻璃化冷凍胚胎移植(FET)技術(shù)在輔助生殖過程中的應用越來越普遍。221家生殖中心的ART數(shù)據(jù)顯示,2019年常規(guī)IVF周期全胚冷凍率可達50.68%,ICSI周期全胚冷凍率可達54.09%[1]。然而迄今為止,關(guān)于胚胎冷凍時間是否影響凍胚復蘇結(jié)局及凍胚移植妊娠結(jié)局仍存在較大爭議。有研究表明,隨著冷凍胚胎保存時間的延長,胚胎復蘇率顯著下降[2]。且玻璃冷凍胚胎儲存時間的延長會降低生化妊娠率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率[3]。然而也有研究表明玻璃化胚胎的冷凍保存時間并不會影響臨床妊娠結(jié)局[4]。由此可見,對不同玻璃化冷凍胚胎的移植時限仍有待進一步研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2020年9月至2022年9月在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心接受FET的550例患者的資料。根據(jù)胚胎的不同玻璃化冷凍時間分為5組,A組239例,玻璃化冷凍時間≤3個月;B組138例,3個月<玻璃化冷凍時間≤6個月; C組74例,6個月<玻璃化冷凍時間≤1年; D組75例,1年<玻璃化冷凍時間≤5年;E組24例,玻璃化冷凍時間>5年。并對所有資料的一般情況、復蘇結(jié)局及妊娠結(jié)局等進行記錄分析。

1.1.1 納入標準 選取年齡在20～45歲,接受胚胎冷凍并進行凍胚復蘇移植的患者。

1.1.2 排除標準 ①夫妻一方或雙方染色體異常的患者;②患有子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位癥等內(nèi)膜病變的患者;③孕前患有嚴重生殖器官畸形及腫瘤的患者;④合并有嚴重內(nèi)外科疾病的患者;⑤有不良孕產(chǎn)史的患者。

1.2 胚胎玻璃化冷凍及復蘇方法

1.2.1 玻璃化冷凍過程 冷凍液分為ES和VS,室溫下胚胎先放入 ES冷凍培養(yǎng)基,胚胎皺縮后膨脹,待恢復至最飽滿時迅速轉(zhuǎn)移至VS培養(yǎng)基中。在1 min內(nèi)迅速把胚胎取出放在冷凍載桿上,并放入液氮中冷卻。

1.2.2 玻璃化復蘇過程 解凍液分為 TS、DS、WS-1、WS-2。迅速把載桿從液氮中去除,放入TS解凍培養(yǎng)基,待細胞完全皺縮后,依次將胚胎轉(zhuǎn)移至DS(3 min) 、WS-1(5 min) 、WS-2(5 min)中,待胚胎形態(tài)完全恢復,然后將胚胎轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液中等待移植。

1.3 患者子宮內(nèi)膜準備 本中心以自然周期及激素替代周期兩種內(nèi)膜準備方案為主。自然周期是有規(guī)律月經(jīng)周期的患者在月經(jīng)第11～12 d進行B超監(jiān)測,評估卵泡和內(nèi)膜發(fā)育情況,于排卵日(自然排卵/HCG扳機后)給予黃體酮(30 mg,每天2次)支持,3～5 d后行胚胎移植。激素代替周期一般是在月經(jīng)周期或采用藥物行撤退性出血的第2～3 d 起開始口服戊酸雌二醇(4 mg,每天1次),根據(jù)B超監(jiān)測患者子宮內(nèi)膜生長情況調(diào)整劑量,當口服戊酸雌二醇11～12 d、子宮內(nèi)膜厚度≥7.0 mm時,開始加黃體酮(30 mg,每天2次)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜,3～5 d 后解凍胚胎行FET。

1.4 胚胎質(zhì)量的評估 根據(jù)Puissant[5]的胚胎等級標準,解凍后胚胎卵裂球數(shù)≥50%冷凍前卵裂球數(shù)量為存活胚胎;卵裂期胚胎有6～10個細胞2級及以上的為優(yōu)質(zhì)胚胎;囊胚分期在4期或以上,外滋養(yǎng)層及內(nèi)細胞團為B級或A級囊胚。

1.5 各項指標計算公式 胚胎存活率=解凍后存活胚胎/解凍胚胎數(shù)×100%;胚胎完好率=解凍后完好胚胎數(shù)/解凍胚胎數(shù)×100%;解凍后/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率=解凍后優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)×100%;種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同玻璃化冷凍時間的凍胚移植周期一般情況比較 與胚胎冷凍時間較短的A組相比較,胚胎冷凍時間較長的D組、E組AMH顯著增高(P<0.05)。其余各項指標,各組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

2.2 不同玻璃化冷凍時間胚胎移植的復蘇結(jié)局比較 與A、B、C組比較,胚胎冷凍時間較長的D組胚胎存活率及胚胎完好率顯著降低(P<0.05);與A、B組比較,胚胎冷凍時間較長的E組胚胎存活率、胚胎完好率及解凍后/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著降低(P<0.05);E組較C組胚胎完好率顯著降低(P<0.05);E組較D組解凍后/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著降低(P<0.05),見表2。

2.3 不同玻璃化冷凍時間移植優(yōu)質(zhì)胚胎的妊娠結(jié)局比較 在保證至少移植一枚優(yōu)質(zhì)胚胎的情況下,各組間的胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率及早產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異,見表3。

2.4 不同玻璃化冷凍時間移植優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的妊娠結(jié)局比較 在移植至少一枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎時,各組間胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學意義。相較于胚胎冷凍時間較短的B組,胚胎冷凍時間較長的E組早產(chǎn)率顯著升高(P<0.05),見表4。

表1 不同玻璃化冷凍時間的凍胚移植周期一般情況比較

表2 不同玻璃化冷凍時間胚胎移植的復蘇結(jié)局比較(%)

表3 不同玻璃化冷凍時間移植優(yōu)質(zhì)胚胎的妊娠結(jié)局比較(%)

表4 不同玻璃化冷凍時間移植優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的妊娠結(jié)局比較(%)

2.5 不同玻璃化冷凍時間移植優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠結(jié)局比較 在移植至少一枚優(yōu)質(zhì)囊胚時,各組間胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學意義。相較于胚胎冷凍時間較短的A組,胚胎冷凍時間較長的C組早產(chǎn)率顯著升高(P<0.05),見表5。

表5 不同玻璃化冷凍時間移植優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠結(jié)局比較(%)

3 討論

在新鮮胚胎移植周期中,胚胎分裂過快或過慢都因不能與子宮內(nèi)膜同步發(fā)育而無法作為胚胎移植的首選[6]。而冷凍胚胎移植為鮮胚移植失敗或卵巢過度刺激取消移植的人群提供了再次胚胎移植并獲得臨床妊娠的機會,且進行凍胚移植的患者患卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的風險更低[7]。因此,近年來,胚胎冷凍時間對復蘇結(jié)局及臨床妊娠結(jié)局的影響也更加受到關(guān)注。

本研究結(jié)果提示,較長的玻璃化冷凍時間會對胚胎復蘇結(jié)局產(chǎn)生不利影響。隨著玻璃化冷凍時間的延長,復蘇后的胚胎存活率、胚胎完好率及解凍后/冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著降低。有文獻指出,長期在液氮中保存會降低胚胎存活率[8]。較長凍存時間組胚胎解凍后的胚胎復蘇率顯著降低(P<0.05),且1～6個月組胚胎復蘇率最高(P<0.05)[2]。胚胎冷凍超過6年的復蘇率低于冷凍3～5年的胚胎(P<0.05)[9]。其原因是胚胎冷凍保存可能會影響基因的穩(wěn)定性,造成胚胎DNA碎片的增加、線粒體DNA的突變等[10]。在冷凍保存過程中,高滲應激可能導致DNA雙鏈斷裂頻率增加或抑制DNA修復,從而導致染色體畸變[11]。在真核生物中,DNA與組蛋白和非組蛋白染色體蛋白連接形成染色質(zhì)以確保DNA穩(wěn)定性,而低溫會改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),從而影響DNA的穩(wěn)定性。除了核基因組外,細胞還擁有線粒體DNA。冷凍保存會導致活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生[12-13],最終損傷線粒體DNA。除此之外,玻璃化冷凍誘導的應激,包括滲透性休克、溫度和pH值的變化以及冷凍保護劑的毒性,也可能誘導卵母細胞和胚胎的表觀遺傳學和轉(zhuǎn)錄組學變化[14]。以上因素可能是導致長時間冷凍胚胎的復蘇結(jié)局較短時間冷凍胚胎差的原因。另有研究表明,不同卵裂期胚胎復蘇率、胚胎解凍完整存活率均無統(tǒng)計學差異[15]。與本研究結(jié)果不同的原因可能在于分組及納入研究的胚胎形態(tài)不同。

本研究提示,在移植至少一枚優(yōu)質(zhì)凍胚后,各組間胚胎植入率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率及流產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異。有研究顯示,玻璃化冷凍卵裂期胚胎的時間對復蘇及妊娠結(jié)局沒有顯著影響[16-17]。凍囊胚的胚胎存活率、胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率[18]及新生兒結(jié)局[19]差異均無統(tǒng)計學意義。Wan[20]等人也認為:胚胎冷凍時間小于60天和大于60天2組的活產(chǎn)率、生化妊娠率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、晚期流產(chǎn)率和新生兒畸形率差異均無統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果與本研究結(jié)果一致。但其同時表明不同玻璃化冷凍時間對單胎早產(chǎn)率沒有影響,該結(jié)果與本研究不一致,其原因可能是對不同玻璃化冷凍時間分組不一致且納入樣本量較少有關(guān),仍需進一步研究。

綜上所述,相較于短期冷凍胚胎,較長的胚胎冷凍時間對凍胚復蘇結(jié)局有不利影響。然而在移植至少一枚優(yōu)質(zhì)胚胎后,凍胚移植的臨床妊娠結(jié)局并無顯著性差異,但長期冷凍保存的胚胎對后期子代安全性的影響尚未明確。這意味著對凍胚移植來說,臨床醫(yī)生擁有了更加自由靈活的移植時限。