BRCA1/2胚系突變對三陰性乳腺癌患者放療后第二原發(fā)腫瘤的影響

胡曉鈺，蔡毓文，葉富貴，邵志敏，胡偉剛，余科達

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

乳腺癌如今已超越肺癌成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1］。根據(jù)美國癌癥協(xié)會的數(shù)據(jù)，其發(fā)病率仍在以每年約0.5%的速率增長［2］。不表達雌激素受體、孕激素受體以及人表皮生長因子受體2的乳腺癌為三陰性乳腺癌，占所有乳腺癌的10%～20%，是乳腺癌中預后最差的類型［3］?，F(xiàn)階段對于乳腺癌臨床上首選治療為手術治療，但對于中晚期患者而言，單獨行乳腺癌根治術效果并不理想，因此為確保病灶清除率，多對乳腺癌術后患者進行放療，以延緩癌癥進展［4］。

乳腺癌易感基因1（BRCA1）與乳腺癌易感基因2（BRCA2）的致病突變是乳腺癌與卵巢癌的高危因素［5-6］。中國人群中BRCA總陽性突變率為5%［4］。BRCA1和BRCA2基因的編碼產物在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用，即確保細胞的遺傳完整性不會因染色體DNA的意外丟失、復制或重排而受損［7］。有鑒于此，我們推測BRCA1/2基因突變在使腫瘤對放療的敏感性增加的同時也可導致機體對放射線的脆弱度增加，從而誘發(fā)第二原發(fā)腫瘤［8］。本研究旨在探索BRCA1/2基因胚系突變三陰性乳腺癌患者術后接受放射治療是否為發(fā)生第二原發(fā)腫瘤的風險因素。

1 資料和方法

1.1 研究對象

基于復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院三陰性乳腺癌隊列開展回顧性研究［3］，為2007年1月1日—2014年12月31日于復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院就診的患者。入組標準：① 診斷為單側乳腺浸潤性導管癌的女性三陰性乳腺癌患者；② 基于免疫組織化學與原位雜交的方法對雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）以及人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）進行評估。由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科的2位專家進行評估，三陰性乳腺癌定義為ER、PR及HER2陰性。其中ER與PR陰性定義為免疫組織化學檢測結果小于1%的腫瘤細胞染色陽性；HER2陰性定義為免疫組織化學檢測結果為0或1 + 、或免疫組織化學檢測結果為2 + 且原位雜交結果為陰性；③ 確診時未發(fā)生遠處轉移；④ 可獲得足夠的冷凍組織用于后續(xù)研究。乳腺原位癌以及炎性乳腺癌患者被排除在外。本研究所有樣本的獲得與使用均得到復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準（050432-4-2108），且所有患者均簽署知情同意書?；颊叩呐R床信息包括：手術時年齡（age_at_surgery，連續(xù)變量）、月經(jīng)狀態(tài)（menopause，分類變量）、腫瘤級別（grade，連續(xù)變量）、腫瘤大?。╯ize_cm，連續(xù)變量）、陽性淋巴結數(shù)目（LN_positive，連續(xù)變量）、是否接受化療（chemotherapy，分類變量）、手術方式（surgery，分類變量）、復旦方案分子分型（mRNA_subtype，分類變量）以及是否接受放療（radiotherapy，分類變量）。

1.2 基因檢測

從組織和匹配的白細胞樣本中制備合格的基因組DNA，用于全外顯子組測序。基于Qubit熒光分光光度計定量的DNA樣本（300 ng/樣本）首先在生物攝取器 + 超聲系統(tǒng)（Diage-node,Liege,Belgium）上破碎。破碎后的DNA使用Agilent SureSelectXT Library Prep 試劑盒（美國Agilent公司）進行末端修復、A尾和適配器的連接。隨后，使用Agilent SureSelect Human All Exon V6（美國Agilent公司）探針捕獲準備好的DNA（750 ng），并用索引引物對捕獲的文庫進行擴增。通過帶有DNA芯片的Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent公司）進行質量控制。用Qubit 3.0熒光分光光度計（美國斯巴德市英杰公司）定量分析后，在Illumina HiSeq測序平臺（美國Illumina公司）上對文庫進行測序。對于組織來源的文庫，單通道上裝載12個樣本；對于血液來源的文庫，單通道上裝載20個樣本。

1.3 第二原發(fā)腫瘤

本研究所關注的第二原發(fā)腫瘤包括：同側及對側乳房第二原發(fā)腫瘤（對接受保乳手術患者而言，排除真性復發(fā)，但仍納入其他象限發(fā)生的乳房內第二原發(fā)腫瘤），以及其他第二原發(fā)腫瘤（即除乳腺癌之外的任何部位的原發(fā)癌種）。末次隨訪時間為2023年2月17日。

1.4 統(tǒng)計學處理

⑴ 在非BRCA1/2胚系突變患者中，通過多元logistic回歸分析評估以下因素是否影響第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生：年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤級別、腫瘤大小、陽性淋巴結數(shù)目、是否化療、手術方式、分子分型（復旦四分型）、以及是否接受術后放療。模型構建代碼主體如下：“glm(Recurrence～Age_at_surgery + Menopause + Grade + Size_cm + LN_positive + Chemotherapy + Surgery + mRNA_Subtype + Radiotherapy”

⑵ 在BRCA1/2胚系突變患者中，通過多元logistic回歸分析評估以下因素是否影響第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生：年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤級別、腫瘤大小、陽性淋巴結數(shù)目、手術方式、分子分型（復旦四分型）、以及是否接受術后放療。模型構建代碼主體如下：“glm(Recurrence～Age_at_surgery + Menopause + Grade + Size_cm +LN_positive + Surgery + mRNA_Subtype +Radiotherapy)”

⑶ 對上述兩分析結果進行交互作用分析，以判斷BRCA1/2胚系突變與術后放療是否對第二原發(fā)腫瘤有著交互作用。應用interactionR包進行交互作用分析。首先應用如下代碼構建模型“glm(Recurrence～Age_at_surgery + Menopause +Grade + Size_cm + LN_positive + Chemotherapy + S urgery + mRNA_Subtype +BRCA1.2.MUT.201607 18*Radiotherapy,family=binomial (link='logit') ,data=clinical1)”,隨后應用interactionR進行交互作用分析，參數(shù)設置如下: ci.type="mover",ci.level=0.95。相乘交互作用的統(tǒng)計學指標ORA*B=OR11/(OR10*OR01)。

本研究除特殊說明外，均采用雙側顯著性檢驗且檢驗水準α=0.05。所有分析均使用R語言進行。

2 結 果

2.1 研究對象基本信息

本研究共納入292例具備BRCA1/2突變信息的女性三陰性乳腺癌患者，中位年齡52歲，94例患者術后接受放療。隨訪患者中共有7例發(fā)生了第二原發(fā)腫瘤事件（表1），其中同側乳房內第二原發(fā)腫瘤1例，對側乳房內第二原發(fā)腫瘤3例，其他部位第二原發(fā)腫瘤3例。

表1 研究對象基線特征Tab.1 Baseline characteristics of enrolled patients

2.2 非BRCA1/2胚系突變人群多元logistic回歸

非BRCA1/2胚系突變患者共261例。多元logistic回歸分析結果顯示，患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤級別、腫瘤大小、陽性淋巴結數(shù)目、是否化療、手術方式、分子分型（復旦四分型）以及是否放療對第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生均無顯著影響（表2）。

表2 BRCA1/2 非胚系突變三陰性乳腺癌患者中影響第二原發(fā)腫瘤的多元logistic回歸分析Tab.2 Multivariate logistic regression analysis of second primary cancer in triple-negative breast cancer patients without BRCA1/2 germline mutation

2.3 BRCA1/2胚系突變人群多元logistic回歸

BRCA1/2胚系突變患者共31例，多元logistic回歸分析結果顯示，年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤級別、腫瘤大小和手術方式等因素對第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生均無顯著影響。陽性淋巴結數(shù)目［比值比（odds ratio，OR）=0.852，95% CI：0.784～0.926，P=0.007］與腔面雄激素受體（luminal androgen receptor，LAR）亞型 ［相對于基底樣免疫抑制（basal-like and immune-suppressed，BLIS）亞型，OR=0.390，95% CI: 0.285～0.534，P＜0.001］可顯著降低第二原發(fā)腫瘤的風險。接受術后放療（相對于未接受術后放療：OR=2.479，95%CI：1.971～3.118，P＜0.001）以及免疫調節(jié)型（immunomodulatory，IM）亞型 ［相對于BLIS亞型），OR=1.211，95% CI：1.023～1.433，P＜0.001］可顯著增加第二原發(fā)腫瘤風險（表3）。

表3 BRCA1/2胚系突變三陰性乳腺癌患者中影響第二原發(fā)腫瘤的多元logistic回歸分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of second primary cancer in triple-negative breast cancer patients with BRCA1/2 germline mutation

2.4 交互作用

BRCA1/2胚系突變與放療對第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生無顯著的交互作用（OR=9.71，95% CI：0.32～295.25；P=0.193，表4）。

表4 三陰性乳腺癌患者中，BRCA1/2突變及是否放療影響第二原發(fā)腫瘤的交互作用Tab.4 Interaction impact of BRCA1/2 germline mutation and postoperative radiation on the incidence of second primary cancer

3 討 論

本研究結果顯示，BRCA1/2胚系突變患者術后接受放療可顯著地增加罹患第二原發(fā)腫瘤的風險，而對于非BRCA1/2胚系突變患者術后放療不存在該效應。BRCA1/2胚系突變與放療不存在顯著的交互作用。

BRCA1和BRCA2基因的編碼產物在維持基因組的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要的作用。我們推測BRCA1和BRCA2基因突變可增加患者基因組對放射治療的脆弱度，從而提高放療后發(fā)生第二原發(fā)腫瘤的風險。既往同類型的研究主要關注BRCA1和BRCA2基因突變對放療敏感性的影響，所關注的事件主要為放療后緩解率，且不同研究得出的結論并不一致：丁高峰等［9］回顧性分析了156例收治于鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院的患者，發(fā)現(xiàn)BRCA1基因突變陽性率與放療的高敏感性相關；而李賀等［10］分析112例收治于河南科技大學第一附屬醫(yī)院的非小細胞癌患者則發(fā)現(xiàn)癌組織的BRCA1基因突變陽性率越高，對放療的敏感性越差。本研究主要觀察BRCA1和BRCA2胚系突變對患者全身的影響，即放療后身體任何部位發(fā)生第二原發(fā)腫瘤的風險。既往研究大部分未區(qū)分原發(fā)腫瘤與第二原發(fā)腫瘤。Seynaeve等［11］發(fā)現(xiàn)，與散發(fā)性乳腺癌病例相比，遺傳性病例發(fā)生同側乳腺癌的風險在隨訪5年后顯著增高，且這些同側乳腺癌與原發(fā)腫瘤不在同一象限，提示為第二原發(fā)腫瘤。Bernstein等［12］進行了一項巢式病例對照研究，結果顯示，BRCA1/2突變攜帶者接受放療并沒有增加罹患對側乳腺癌的風險。然而，另一項研究數(shù)據(jù)卻提示有以下DNA損傷修復基因（BRCA1、BRCA2、CHEK2或ATM）之一突變的攜帶者與未攜帶者相比，患對側乳腺癌的風險顯著增高［13］。這一差異可能是由入組人群特征的差異導致的。

本研究探討了BRCA1/2胚系突變與放療對發(fā)生第二原發(fā)腫瘤的交互作用，結果顯示，單從統(tǒng)計學分析結果而言，與未接受放療者相比，BRCA1/2基因胚系突變患者術后接受放療可增加罹患第二原發(fā)腫瘤的風險，但BRCA1/2胚系突變與放療對第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生并顯著的交叉作用，因而BRCA1/2胚系突變患者術后接受放療可能并不會增加罹患第二原發(fā)腫瘤的風險。但值得注意的是，本研究中第二原發(fā)腫瘤事件數(shù)較少，可能降低了統(tǒng)計學分析效能。本研究結論還有待更進一步的前瞻性隊列臨床驗證。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：胡曉鈺、蔡毓文、葉富貴：文獻調研與整理；分析解釋數(shù)據(jù)；起草、修訂論文。邵志敏、胡偉剛、余科達：提出研究方向；對文章知識性內容作批評性審閱；書寫論文。