KDM4A通過(guò)下調(diào)BMP9促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231的遷移和侵襲

陳遠(yuǎn)香，余 濤，楊詩(shī)雨，曾 濤，魏 蘭，張 彥

重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016

乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展涉及遺傳背景、激素紊亂和環(huán)境影響等多種因素，發(fā)病原因復(fù)雜［1-3］。因此，尋找新的有效治療靶點(diǎn)對(duì)改善乳腺患者的生存至關(guān)重 要。

組蛋白甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳修飾，不同組蛋白不同位點(diǎn)的甲基化修飾可導(dǎo)致其所在DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性改變，從而激活或抑制其基因表達(dá)。賴氨酸特異性去甲基化酶4A（lysine specific demethylase 4A，KDM4A）在多種癌癥中呈高表達(dá)，其在人乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且癌變程度越深，其表達(dá)越高［4-5］，提示KDM4A可作為潛在的乳腺癌治療新靶標(biāo)。有研究［6-7］顯示，KDM4A可特異性識(shí)別組蛋白H3賴氨酸4號(hào)位三甲基化（H3K4me3）或組蛋白H3賴氨酸36號(hào)位三甲基化/二甲基化（H3K36me3/2），去除甲基基團(tuán)引起甲基化水平下降，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受到抑制。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bone morphogenetic protein 9，BMP9）是一種屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的信號(hào)分子，參與調(diào)控血管生成［8］、骨骼發(fā)育［9］、肝臟功能［10］和腫瘤生長(zhǎng)［11-12］等生物學(xué)過(guò)程。研究［11，13-17］發(fā)現(xiàn)，BMP9在乳腺癌中常呈低表達(dá)甚至表達(dá)缺失，而外源性BMP9能抑制人乳腺癌細(xì)胞在體外的惡性生物學(xué)行為，調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞代謝，抑制乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移等。因此，本研究探索表觀遺傳修飾的組蛋白KDM4A在乳腺癌中的表達(dá)及作用，探究KDM4A與BMP9之間的關(guān)系及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，并明確其對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用乳腺癌細(xì)胞系由重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自重慶賽米克生物科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)CLARK Bioscience公司，KDM4A小干擾RNA及GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，RNA快速提取試劑盒購(gòu)自上海奕杉生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自日本Takara公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）檢測(cè)試劑盒、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，兔抗人E-cadherin、vimentin、KDM4A、H3K36me3、H3K4me3、H3K36me抗體和鼠抗人β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，兔抗人BMP9抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，放線菌素D及放線菌酮購(gòu)自美國(guó)Selleck公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞用含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待生長(zhǎng)密度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，待生長(zhǎng)密度達(dá)60%～80%時(shí)，依據(jù)GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后檢測(cè)mRNA的表達(dá)情況，48 h后檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

1.2.3 RNA提取和RTFQ-PCR檢測(cè)

使用RNA快速提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于RTFQ-PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 siRNA及RTFQ-PCR引物序列Tab.1 Sequences of siRNA and RTFQ-PCR primer

1.2.4 Western blot

收集并裂解細(xì)胞獲取總蛋白并定量，以30 μg蛋白上樣量進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。蛋白樣品在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中分離后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h后加入相應(yīng)一抗4 ℃靜置過(guò)夜，第2天以HRP標(biāo)記的山羊抗兔/鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體37 ℃溫育1 h，洗膜后用顯影儀顯影。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞處理24 h后，消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以雙無(wú)培養(yǎng)基制備細(xì)胞混懸液，對(duì)于transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，提前1 h在小室中加入35 μL基質(zhì)膠稀釋液（基質(zhì)膠∶雙無(wú)培養(yǎng)基=1∶9），transwell遷移實(shí)驗(yàn)則不需要。隨后將細(xì)胞懸液加入小室上室，完全培養(yǎng)基加入小室下室，37 ℃溫育24 h后固定并用結(jié)晶紫染色，于倒置顯微鏡下拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞處理24 h后鋪于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，使用10 μL移液器吸嘴在6孔板中間劃線，采用磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）清洗去除漂浮的細(xì)胞后加入雙無(wú)培養(yǎng)基，此時(shí)于鏡下拍照計(jì)作0 h，待24、48 h時(shí)在相同位置各拍1次照。使用CorelDRAW軟件分析各個(gè)時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度，計(jì)算平均劃痕愈合率，計(jì)算公式為：平均劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度/48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 ChIP

依據(jù)ChIP試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用1%甲醛溶液室溫固定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（約1×106個(gè)）10 min，使DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián)，然后進(jìn)行超聲處理將DNA裂解，4 ℃溫育過(guò)夜進(jìn)行免疫沉淀。后續(xù)獲得沉淀的染色質(zhì)DNA后通過(guò)ChIP-PCR瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。用于ChIP-PCR的正向引物序列為5’-AGTCAGGTCCATAGTCCTTCAT-3’，反向引物序列為5’-TGGATTGTCCTCCACTTGTGC-3’。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，以siKDM4A小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并設(shè)置對(duì)照組。24 h后換液并加入放線菌素D，使終濃度為5 μg/mL，分別處理細(xì)胞0、30、60、90和120 min后，提取各時(shí)間點(diǎn)的RNA并進(jìn)行定量檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 CHX蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，以siKDM4A小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并設(shè)置對(duì)照組。48 h后換液并加入放線菌酮，使終濃度為100 μg/mL，分別處理細(xì)胞0、30、60、90和120 min后，提取各時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)并對(duì)蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，各組內(nèi)兩兩比較采用Studentt檢驗(yàn)，兩組及兩組以上組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KDM4A在乳腺癌中異常高表達(dá)

通過(guò)檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancerpku.cn/）分析KDM4A在乳腺癌中的表達(dá)。結(jié)果顯示，KDM4A在乳腺癌組織中的表達(dá)高于正常組織（圖1A～1B），但KDM4A在乳腺癌各期表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1C），提示KDM4A參與了乳腺癌整個(gè)發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。RTFQ-PCR及Western blot結(jié)果均顯示，KDM4A在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著高于乳腺正常永生化上皮細(xì)胞MCF-10A（圖1D～1E）。

圖1 KDM4A在乳腺癌中呈高表達(dá)Fig.1 KDM4A highly expressed in breast cancer

2.2 KDM4A與BMP9表達(dá)存在相關(guān)性

檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，KDM4A與BMP9在不同癌癥中呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其在乳腺癌中也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖2A～2C）。RTFQ-PCR及Western blot結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中敲低KDM4A后，BMP9的mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)水平均顯著上調(diào)（圖2D～2E）。以上結(jié)果提示KDM4A與BMP9呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖2 KDM4A與BMP9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)Fig.2 The expression of KDM4A is negatively correlated with BMP9

2.3 KDM4A可發(fā)揮去甲基化作用沉默BMP9表達(dá)

Western blot檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中組蛋白甲基化水平，發(fā)現(xiàn)敲低KDM4A后，H3K36me3、H3K4me3水平均升高，H3K36me水平降低（圖3A），說(shuō)明KDM4A可以發(fā)揮去甲基化酶作用，降低組蛋白基因甲基化水平。以IgG抗體沉淀為陰性對(duì)照、Input為陽(yáng)性對(duì)照，H3K36me3、H3K4me3抗體沉淀為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中敲低KDM4A后，H3K36me3在BMP9基因啟動(dòng)子區(qū)域顯著富集，而H3K4me3則沒(méi)有顯著變化（圖3B）。這說(shuō)明KDM4A可以通過(guò)發(fā)揮其去甲基化作用下調(diào)BMP9基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K36me3而不是H3K4me3組蛋白甲基化水平，從而沉默BMP9表達(dá)。

圖3 KDM4A下調(diào)組蛋白甲基化水平Fig.3 KDM4A downregulatd histone methylation status

2.4 KDM4A可抑制BMP9基因的轉(zhuǎn)錄但不影響其mRNA的穩(wěn)定性

鑒于敲低KDM4A可以上調(diào)BMP9的mRNA水平，本研究擬進(jìn)一步探究KDM4A是否能發(fā)揮去甲基化酶以外的作用影響B(tài)MP9的表達(dá)。首先對(duì)KDM4A是否影響B(tài)MP9的mRNA穩(wěn)定性進(jìn)行探究，在分別使用放線菌素D處理MDA-MB-231細(xì)胞后檢測(cè)BMP9的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，敲低KDM4A與否對(duì)BMP9的mRNA穩(wěn)定性無(wú)明顯影響（圖4A）。

2.5 敲低KDM4A可增加BMP9蛋白的穩(wěn)定性

前期發(fā)現(xiàn)敲低KDM4A可上調(diào)BMP9的蛋白表達(dá)水平，其可能對(duì)BMP9表達(dá)水平的調(diào)控存在一定的翻譯后修飾作用。本研究又對(duì)KDM4A是否影響B(tài)MP9的蛋白穩(wěn)定性進(jìn)行探究。結(jié)果顯示，在用蛋白合成酶抑制劑CHX處理MDA-MB-231細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)敲低KDM4A能明顯延長(zhǎng)BMP9蛋白的半衰期（圖4B）。上述結(jié)果提示，KDM4A能夠降低BMP9蛋白的穩(wěn)定性，而敲低KDM4A可使BMP9蛋白的穩(wěn)定性顯著提高。

2.6 敲低KDM4A抑制乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力

劃痕愈合及transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低KDM4A相較于對(duì)照組可以顯著降低MDAMB-231細(xì)胞的劃痕愈合率、減少穿膜細(xì)胞數(shù)，且這種作用可被敲低BMP9部分逆轉(zhuǎn)（圖5A～5B）。上述結(jié)果提示，KDM4A可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲，且這種作用可因BMP9的敲低而被部分逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明KDM4A可通過(guò)下調(diào)BMP9促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。

3 討 論

在乳腺癌中，多種基因的表達(dá)與功能異?？纱龠M(jìn)乳腺癌的惡性生物學(xué)行為，而分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步使得有助于識(shí)別乳腺癌診斷和治療的更具體的生物標(biāo)志物成為可能，從而改善個(gè)體化治療［18］。因此，尋找高特異性的生物標(biāo)志物幫助醫(yī)師診斷及制訂治療計(jì)劃對(duì)提高治療成功率至關(guān)重要。

染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)由核小體定位、組蛋白組成和組蛋白修飾等過(guò)程調(diào)節(jié)［19］，帶正電荷的組蛋白修飾直接影響復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄和DNA損傷修復(fù)等過(guò)程。KDM4A是一種組蛋白去甲基化酶，在多種癌癥中呈高表達(dá)。有研究［20-21］顯示，KDM4A可以去除甲基化組蛋白H3上激活轉(zhuǎn)錄的H3K4/36me3標(biāo)記，直接引起癌癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄沉默或激活。例如，斑蝥素通過(guò)KDM4A依賴性組蛋白H3K36的去甲基化誘導(dǎo)DNA損傷，增強(qiáng)肝癌化療敏感性［20］；在非小細(xì)胞肺癌中KDM4A促進(jìn)DLX5啟動(dòng)子H3K4me3的去甲基化引起DLX5轉(zhuǎn)錄激活，導(dǎo)致癌基因Myc的表達(dá)，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)等［21］。此外，KDM4A還能作用于轉(zhuǎn)錄抑制性標(biāo)記H3K9me3，在骨肉瘤中通過(guò)控制SLC7A11啟動(dòng)子區(qū)域的H3K9me3去甲基化，調(diào)控SLC7A11的轉(zhuǎn)錄和癌細(xì)胞鐵死亡［22］；在宮頸癌中，KDM4A通過(guò)H3K9me3激活轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor protein 1，TFR1）和二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）啟動(dòng)子中的HRE序列，從而誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞鐵死亡［23］。除了以去甲基化組蛋白為底物，KDM4A還能以非組蛋白為底物，通過(guò)直接下調(diào)腫瘤抑制因子miR-491-5p促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)并抑制細(xì)胞凋亡［24］。KDM4A與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而其在乳腺癌中的作用尚不明確。本研究首先發(fā)現(xiàn)了KDM4A與BMP9之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，并明確了KDM4A在乳腺癌中對(duì)BMP9進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用，并且這種作用既可以依賴也可以獨(dú)立于其酶活性，但其影響B(tài)MP9蛋白穩(wěn)定性的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

BMP9是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的一員，在胚胎發(fā)育、組織再生和成年生理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BMP9在乳腺癌中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，BMP9可通過(guò)cMyc/SNHG3/mTOR信號(hào)軸促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬，抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲［12］；通過(guò)激活BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，BMP9可以下調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）抑制乳腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移［15］；PI3K/AKT、ERK1/2、ALK1等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也是BMP9靶向抑制乳腺癌的重要途徑［16，25-26］。BMP9能夠通過(guò)協(xié)調(diào)癌細(xì)胞與周圍微環(huán)境之間的通訊來(lái)促進(jìn)疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。通過(guò)降低脂肪前細(xì)胞/脂肪細(xì)胞中瘦素的表達(dá)，下調(diào)磷酸化STAT3、ERK1/2和AKT，抑制瘦素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)降低乳腺癌在脂肪微環(huán)境中的增殖和遷移［14］；BMP9通過(guò)RANK/RANKL和SDF-1（CXCL12）/CXCR4-PI3K信號(hào)軸調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞之間的串?dāng)_，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和增殖［13］。外源性BMP9能顯著抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，但其在乳腺癌中的表達(dá)卻極低甚至缺失，作為一種多功能的細(xì)胞因子，BMP9具有潛在的治療應(yīng)用前景，靶向BMP9在乳腺癌的診斷和治療中可能是一個(gè)重要手段。

本研究結(jié)果表明，KDM4A可以通過(guò)去除BMP9基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3上的甲基基團(tuán)、降低BMP9蛋白的穩(wěn)定性來(lái)下調(diào)BMP9的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：

陳遠(yuǎn)香：設(shè)計(jì)及操作全部實(shí)驗(yàn)，撰寫(xiě)文章。

余 濤：生物信息學(xué)分析。

楊詩(shī)雨：數(shù)據(jù)分析。

曾 濤：數(shù)據(jù)分析。

魏 蘭：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

張 彥：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，修改文章。