CRISPR/Cas9系統(tǒng)在畜禽遺傳改良中研究進(jìn)展

鮑艷春，戴伶俐，劉在霞，馬鳳英，王宇，劉永斌，谷明娟，娜日蘇，張文廣,6

綜 述

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在畜禽遺傳改良中研究進(jìn)展

鮑艷春1,2，戴伶俐2,3，劉在霞1,2，馬鳳英1,2，王宇4，劉永斌5，谷明娟1,2，娜日蘇1,2，張文廣1,2,6

1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)基因組大數(shù)據(jù)工程研究中心，呼和浩特 010018 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，呼和浩特 010031 4. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018 5. 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021 6. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)作為一種高效的基因組編輯方法，在畜牧業(yè)遺傳改良領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)以高效、精準(zhǔn)的特點(diǎn)，為畜牧業(yè)發(fā)展帶來了一場革命。目前，基于CRISPR/Cas9的基因敲除、基因敲入和基因修飾等已被廣泛應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對畜禽物種的重要生產(chǎn)性狀進(jìn)行精準(zhǔn)改良。本文介紹了CRISPR/Cas9技術(shù)的工作原理及發(fā)展歷程，重點(diǎn)介紹了該技術(shù)在畜禽肌肉生長發(fā)育、絨毛纖維生長、乳品質(zhì)成分、抗病育種以及動物福利中的研究進(jìn)展，旨在為更深入地了解CRISPR/Cas9技術(shù)在畜禽基因編輯上的應(yīng)用提供參考。

CRISPR/Cas9；基因編輯；畜禽；遺傳改良；經(jīng)濟(jì)性狀

基因編輯是一種極具發(fā)展前景的生物工程技術(shù)，通過人為方式在有機(jī)體的基因組特定位置上刪除、添加或改變堿基，以達(dá)到編輯基因組的目的。理想的基因組編輯方法需要高效并準(zhǔn)確地改變基因組序列，并盡量減少或避免產(chǎn)生脫靶效應(yīng)[1]。隨著鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc-finger endonuclease，ZFN)[2]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator like effector nuclease，TALEN)[3]和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(clustered regularly inter spaced short palidromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9)[4,5]等基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，為應(yīng)對人類對蛋白質(zhì)日益增長的需求問題提供了潛在的解決途徑。與ZFN和TALEN不同，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有成本低廉、操作簡單、高效以及可對多個靶基因進(jìn)行同時編輯等優(yōu)勢，目前已被廣泛應(yīng)用于分子育種、疾病防治、遺傳改良和制藥等領(lǐng)域[6～11]。

近年來CRISPR/Cas9技術(shù)在畜牧業(yè)方面的應(yīng)用帶來了諸多突破，包括生成轉(zhuǎn)基因動物、改良基因組特征、提高動物抗病能力以及改善農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)等?？蒲腥藛T通過對特定基因進(jìn)行編輯和調(diào)控，增強(qiáng)了動物的生產(chǎn)潛力和生態(tài)適應(yīng)性。此外，該技術(shù)的可靠性也在不斷取得進(jìn)展，例如通過堿基修飾來實(shí)現(xiàn)單堿基突變的插入，而無需依賴復(fù)雜的DNA供體。這意味著CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用更加簡便和高效。CRISPR/Cas9技術(shù)的快速發(fā)展極大地推動了畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域的革新和發(fā)展，為未來的畜牧業(yè)發(fā)展提供了更廣闊的應(yīng)用前景。本文對CRISPR/Cas9技術(shù)的工作原理及進(jìn)展進(jìn)行了概述，著重介紹了目前該技術(shù)在主要家養(yǎng)動物基因組中的應(yīng)用進(jìn)展，為CRISPR/Cas9技術(shù)在畜禽遺傳改良的研究提供參考依據(jù)。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展歷程和原理

日本科學(xué)家在1987年對大腸桿菌()的基因進(jìn)行研究時，首次在位于基因3′端側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了5個高度同源的特殊結(jié)構(gòu)，由29個核苷酸序列排列成的重復(fù)序列組成。由于當(dāng)時在原核生物中還未發(fā)現(xiàn)與這些序列同源的序列，因此對這些序列的生物意義是未知的[12]。1991年，Pavletich等[13]通過解析Zif268蛋白與DNA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，首次揭示了鋅指蛋白與DNA識別的分子機(jī)制。隨后，1996年Kim等[14]首次成功制造了嵌合型核酸內(nèi)切酶——鋅指核酸酶。2002年，CRISPR首次被正式命名，并發(fā)現(xiàn)這種新型的DNA序列家族在細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛存在[15]，具有抵御病毒或外源物質(zhì)入侵的功能，其存在形式及作用機(jī)理均不相同。同年，利用ZFN技術(shù)成功地在果蠅()中實(shí)現(xiàn)了基因的誘變[16,17]。之后，Barrangou等[18]確認(rèn)CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種原核生物特有的天然適應(yīng)性防御機(jī)制。2010年，Christian等[19]將TALE蛋白和酶嵌合創(chuàng)造出了一種新的基因組編輯技術(shù)——TALEN。直到2011年，CRISPR/Cas9的作用機(jī)制才被揭示。當(dāng)病毒首次入侵機(jī)體時，細(xì)菌會將外源基因的一段序列整合到自身CRISPR序列的間隔區(qū)；在病毒再次入侵時，CRISPR序列會轉(zhuǎn)錄生成前體crRNA(pre-crRNA)，pre-crRNA通過加工形成含有與外源基因匹配序列的crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識別后，介導(dǎo)Cas蛋白結(jié)合并且對其進(jìn)行切割，從而保護(hù)機(jī)體免受病毒的入侵[20,21](圖1)。2013年，在哺乳動物細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了II型Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的研究[22]。由于傳統(tǒng)的基因篩選方法(如RNAi)在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除較為困難，因此，Koike-Yusa等[23]于2014年首次將全基因組CRISPR/ Cas9應(yīng)用于小鼠()胚胎干細(xì)胞中，成功鑒定出一些與抗毒素相關(guān)的基因。2016年，Komor等[24]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9通常需要通過引發(fā)雙鏈斷裂(double strand break，DSB)來實(shí)現(xiàn)DNA修飾。然而，DSB可能引發(fā)細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制，并導(dǎo)致不可預(yù)測的變異。因此，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新方法，稱為堿基編輯器(base editing，BE)，旨在精確修改基因組DNA的單個堿基。具體而言，通過使用Cas9蛋白和特定的單鏈RNA引導(dǎo)子，將化學(xué)修飾核苷酸修飾酶(cytidine deaminase)定向到目標(biāo)堿基上，并將目標(biāo)堿基從胞嘧啶(C)改變?yōu)猷奏?T)。這項(xiàng)技術(shù)為CRISPR/Cas9的發(fā)展提供了一個創(chuàng)新性突破。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)又開發(fā)了一種名為“Target-AID”的單核苷酸編輯系統(tǒng)，它通過引入特定的修飾酶，能夠直接將一種堿基轉(zhuǎn)化為另一種堿基。Anzalone等[25]設(shè)計了適用于特定目標(biāo)序列的編輯引導(dǎo)RNA，將Target-AID定向到目標(biāo)堿基上，再使用Target-AID修飾酶將目標(biāo)堿基替換為編輯后的堿基。由于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)通常需要數(shù)個小時完成基因編輯，Liu等[26]提出了一種新策略，即使用籠狀RNA策略(caged RNA，cgRNA)。該策略在RNA序列中添加光敏基團(tuán)，限制了Cas9酶的功能，直到引入光源。光源激活后，光敏基團(tuán)解離，使得Cas9酶能夠在幾秒內(nèi)快速切割目標(biāo)DNA。這種新方法被稱為超快速CRISPR基因編輯方法(very fast CRISPR，vfCRISPR)。這一研究成果為CRISPR/Cas9領(lǐng)域帶來了變革性的科學(xué)進(jìn)展。目前，科研人員仍在努力研發(fā)更為高效且具有更低脫靶率的基因編輯技術(shù)(圖2)。

圖1 噬菌體CRISPR/Cas9適應(yīng)性免疫系統(tǒng)

CRISPR基因序列主要由前導(dǎo)序列(leader)、重復(fù)序列(repeat)和間隔序列(spacer)構(gòu)成。前導(dǎo)序列位于CRISPR基因上游，被認(rèn)為是CRISPR的啟動子，其富含AT堿基[17]。重復(fù)序列的長度約為20～50 bp，包括5～7 bp回文序列[27]，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，從而穩(wěn)定RNA的二級結(jié)構(gòu)[20]。間隔序列是由細(xì)菌捕獲的外源性DNA序列[15]。目前，在細(xì)菌免疫防御中根據(jù)Cas蛋白的作用將CRISPR系統(tǒng)分為兩大類，又分為6種不同類型(I～VI)，并且子類型的數(shù)目還在持續(xù)增長[17]。I類系統(tǒng)包括的I、III和IV型系統(tǒng)的crRNA效應(yīng)復(fù)合物由多個亞基組成，而II類系統(tǒng)包括的II型、V型和VI系統(tǒng)的crRNA效應(yīng)復(fù)合物僅由單亞基組成[28,29]。Cas9蛋白是II類系統(tǒng)所需的唯一蛋白質(zhì)，Cas9與crRNA-tracrRNA雙鏈體結(jié)合，可用于高效的基因組編輯。這種雙RNA結(jié)構(gòu)與Cas9蛋白形成RNP復(fù)合體，識別與crRNA互補(bǔ)的PAM序列，將DNA雙鏈解鏈，crRNA將與互補(bǔ)鏈雜交，而另一條DNA鏈則保持游離狀態(tài)。之后，Cas9蛋白負(fù)責(zé)準(zhǔn)確切割目標(biāo)PAM序列，再切割與crRNA互補(bǔ)的DNA單鏈，最終在Cas9的作用下DNA發(fā)生DSB，導(dǎo)致切割位點(diǎn)上的小片段序列的插入和/或缺失[30]，此外，它還可以通過機(jī)體的同源定向修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致外源DNA的表達(dá)沉默，從而實(shí)現(xiàn)對病毒的防御[5,11,15,31]。Yu等[32]將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功運(yùn)用于基因組編輯，借助其在病毒防御中的原理，為基因編輯和研究領(lǐng)域帶來了新的可能性和機(jī)遇。主要流程如下：(1)構(gòu)建相關(guān)基因的sgRNA文庫，并將sgRNA整合到慢病毒中，制備慢病毒文庫；(2)使用低感染度感染細(xì)胞，使sgRNA整合到細(xì)胞基因組中。隨著基因組DNA的復(fù)制，sgRNA被復(fù)制并傳遞給細(xì)胞后代。通過抗生素或其他特定篩選條件，篩選出感染病毒的細(xì)胞；(3)根據(jù)特定的表型需求，如耐藥性、增殖能力、存活能力和帶有特定標(biāo)記基因等，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞；(4)提取細(xì)胞核基因組，準(zhǔn)備進(jìn)行下一步的建庫。通過高通量測序?qū)◣斓募?xì)胞核基因組進(jìn)行測序；(5)通過各種生物信息學(xué)分析方法，從測序數(shù)據(jù)中獲取目標(biāo)基因的相關(guān)信息，進(jìn)一步研究和理解其功能(圖3)。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在畜禽遺傳改良中的應(yīng)用

近年來，基因組編輯技術(shù)CRISPR的迅速發(fā)展使得該技術(shù)在畜禽的多方面應(yīng)用提供了可能性，通過CRISPR/Cas9技術(shù)，畜禽肌肉生長可以得到促進(jìn)，這使得肉類產(chǎn)量得到提高。綿羊毛和山羊絨的質(zhì)量也得到改良，使得纖維產(chǎn)品更具商業(yè)價值。此外，通過編輯動物基因，牛奶和羊奶的品質(zhì)可以得到改善，從而提供更健康和高營養(yǎng)價值的乳制品。該技術(shù)還有助于提高畜禽的抗病能力，減少疾病對養(yǎng)殖業(yè)的影響，進(jìn)而提高養(yǎng)殖效益。此外，通過增強(qiáng)畜禽的生長和健康狀況，CRISPR/Cas9技術(shù)也有助于改善動物福利。

圖2 基因編輯技術(shù)發(fā)展歷程圖

圖3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作的主要流程

2.1 在畜禽肌肉生長和發(fā)育上的研究進(jìn)展

肌肉抑制素(myostatin，MSTN)是一種肌肉生長抑制因子，它對肌肉的生長和發(fā)育起到負(fù)調(diào)控的作用。基因突變、缺失或敲除可以導(dǎo)致肌肉細(xì)胞增殖和分化的增加，從而促進(jìn)肌肉的生長和發(fā)育[33]。通過CRISPR/Cas9基因編輯以及優(yōu)化Cas9:sgRNA (向?qū)NA)傳遞系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了綿羊()的雙等位基因敲除，與野生型(WT)綿羊相比，敲除綿羊具有更大的肌肉質(zhì)量和肌肉纖維直徑，但其肉質(zhì)品質(zhì)和口感等方面未受到影響[34]。同樣，在牛()中也實(shí)現(xiàn)將sgRNA和Cas9的合成mRNA體外顯微注射到受精牛胚胎，出生健康犢牛的突變率高達(dá)99.9%，表現(xiàn)出雙等位基因突變和雙肌肉表型[35]。在山羊()中也有各項(xiàng)研究表明，抑制基因的表達(dá)，可促進(jìn)雙肌肉表型的形成[36～41]。在豬()的研究中，Li等[42]使用特異性靶向編輯技術(shù)，通過設(shè)計特定的sgRNA，對兩廣小花豬胚胎中的MSTN信號肽進(jìn)行基因編輯。編輯后的小豬與未編輯的小豬相比，顯示出明顯增加的肌肉量，同時其發(fā)育和健康狀態(tài)與未編輯的小豬無明顯差異。在雞()中，使用D10A-Cas9 nickase介導(dǎo)的方法，選擇性地引入DSB，從而生成了基因敲除的雞群，這些敲除突變雞的肌肉生長顯著增加，生長和繁殖均正常[43]。在馬()中，一般會通過編輯基因來增強(qiáng)肌肉生長和改善運(yùn)動表現(xiàn)[44]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)除對基因進(jìn)行編輯之外，還在肌原細(xì)胞分化蛋白1(myogenic differentiation 1，MYOD1)[45]、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)[46]、胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)[47,48]和抗肌肉生長因子抗體(follistatin，F(xiàn)ST)[49]等編碼與肌肉發(fā)育或分化相關(guān)蛋白的基因功能調(diào)控上得到了應(yīng)用。

過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子，可通過激活脂肪細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子(如FABP4和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白)以及增強(qiáng)和基因的表達(dá)來促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，從而調(diào)控脂肪沉積。Gu等[50]通過隨機(jī)插入和CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因克隆程序在兩個豬模型中成功地肌肉特異性過表達(dá)了過氧化物酶增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)，該編輯豬肌內(nèi)脂肪含量顯著增加，瘦肉比例無變化。此外，在肉牛中成功地實(shí)現(xiàn)了對基因的位點(diǎn)定向突變的同時進(jìn)行了位點(diǎn)的定向敲入，突變對生長性狀和肌肉發(fā)展產(chǎn)生了顯著的影響[51]，而敲入對這些性狀的影響較小[52]。

2.2 在絨毛生長發(fā)育中的研究進(jìn)展

綿羊和山羊作為重要的畜禽資源，為人類提供了用于生產(chǎn)各種服裝和紡織品的寶貴的纖維來源。成纖維細(xì)胞生長因子5 (fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5)是影響羊毛長度的主要因子。目前，通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功生成了敲除綿羊。該敲除綿羊所有細(xì)胞系都存在基因突變，同時還檢測到5、13和33個堿基對的基因缺失，這些結(jié)果導(dǎo)致FGF5蛋白高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響其正常功能，從而引起敲除綿羊的羊毛長度明顯長于WT綿羊[53]。另外，Li[54]等和Wang等[55]的研究也確認(rèn)了這一事實(shí)，即CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因缺失不僅導(dǎo)致其活性的喪失，還能促進(jìn)綿羊毛和山羊絨的生長，從而增加它們的長度和產(chǎn)量。刺鼠信號蛋白(agouti signaling protein，ASIP)是調(diào)節(jié)皮膚和毛發(fā)色素的蛋白，其主要功能是調(diào)控皮膚和毛囊中色素產(chǎn)生。Zhang等[56]成功地干擾了中國美利奴羊ASIP的正常功能，導(dǎo)致羊毛的顏色發(fā)生了變化，這一突破為產(chǎn)生具有理想羊毛顏色的品種培育提供了機(jī)會。

有研究表明，在位點(diǎn)敲入血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，并使用和的組合能夠顯著提高CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源定向修復(fù)效率，通過該技術(shù)獲得了一只在位點(diǎn)整合了基因的具有突出絨毛性能的絨山羊[57]。此外，通過將胸腺素4 (thymosin β4，Tβ4)基因特異性插入山羊趨化因子受體(chemokine receptor 5，CCR5)基因位點(diǎn)，培育出了高產(chǎn)絨山羊，羊絨產(chǎn)量提高了74.5%[58]，細(xì)度和質(zhì)量不受影響。在雙基因敲除絨山羊模型中，Wang等[59]使用CRISPR/Cas9技術(shù)，在受精卵中引入了設(shè)計好的特異性靶向RNA和DNA片段。這些靶向RNA和DNA片段與目標(biāo)基因的特定區(qū)域匹配，并促使CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)生基因編輯作用，成功地敲除了基因和基因，這使得絨山羊的肌肉發(fā)育得到顯著改善，并且觀察到了更多的次級毛囊的形成和更長的羊絨纖維，從而提高了絨山羊的商業(yè)價值和經(jīng)濟(jì)效益。

2.3 在乳品質(zhì)改良上的應(yīng)用進(jìn)展

人體對牛奶或羊奶過敏主要是由于人體免疫系統(tǒng)對奶中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)所造成的。β-乳球蛋白(beta-lactoglobulin，BLG)被認(rèn)為是一種重要的致敏性物質(zhì)，因此可以通過基因編輯技術(shù)對乳品質(zhì)進(jìn)行改善。科研人員使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，通過對牛的基因進(jìn)行修改來改變牛奶的成分和性質(zhì)。例如：Alessio等[60]將引入轉(zhuǎn)座子中，催化合成ω-3和ω-6酸，然后，通過CRISPR/ Cas9技術(shù)，實(shí)現(xiàn)靶向敲除BLG蛋白，成功地修改了牛的基因，提高了牛奶中的脂肪和蛋白質(zhì)含量。Silaeva等[61]著重于減少牛奶中引起過敏的成分，在BLG中引入雙鏈gap，從而產(chǎn)生了過敏原含量更低的牛奶。Singina等[62]在牛胚胎成纖維細(xì)胞中成功獲得了敲除BLG蛋白和β-乳球蛋白樣蛋白基因細(xì)胞集落，未來將被用于生產(chǎn)缺乏BLG蛋白的牛。在山羊上，將Cas9 mRNA和sgRNA共注射到胚胎中生成BLG蛋白敲除山羊，發(fā)現(xiàn)在雙鏈sgRNA引導(dǎo)的靶向?qū)嶒?yàn)的編輯效率比單鏈sgRNA低，并且基因以及其他乳蛋白編碼基因在敲除山羊乳腺中的相對表達(dá)顯著降低，此外，大部分編輯的胎兒是嵌合體，表明編輯效果可以在多個組織中實(shí)現(xiàn)[63]。

山羊奶含有豐富的不飽和脂肪酸，是合成乳脂的必需因子。而硬脂酰輔酶A去飽和酶1 (stearoyl- CoA desaturase 1，SCD1)是催化單不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，對乳脂代謝至關(guān)重要。Tian等[64]使用CRISPR/Cas9技術(shù)在山羊乳腺上皮細(xì)胞(goat mam-mary epithelial cells，GMEC)中敲除了SCD1酶，導(dǎo)致三酰甘油、膽固醇含量降低和脂肪酸的去飽和酶指數(shù)減少，但對其他乳汁成分沒有影響。通過乳脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SCD1敲除降低了三酰甘油和二酰甘油水平，并在甘油脂和甘油磷脂代謝途徑中引起了差異。此外，Tian等[65]還揭示了SCD1通過影響脂質(zhì)代謝基因表達(dá)和脂質(zhì)代謝途徑來調(diào)控山羊乳脂和不飽和脂肪酸的合成。MicroRNA(miRNA)可通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝途徑中的關(guān)鍵基因來調(diào)控乳腺細(xì)胞的脂肪酸代謝，敲除和后，可以上調(diào)靶基因，同時上調(diào)并影響脂肪酸代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)。這些作用有助于調(diào)節(jié)脂滴、甘油三酯和膽固醇的合成，并對C18:0、C18:2以及C20多不飽和脂肪酸的含量產(chǎn)生了影響[66～68]。敲除GMEC中的ASIP蛋白也可以促進(jìn)中長鏈脂肪酸合成增加，而敲除丙二酰/乙酰轉(zhuǎn)移酶(malonyl/ acetyltransferase，MAT)降低甘油三酯和中鏈脂肪酸的含量?？傮w而言，這些因子在調(diào)節(jié)GMEC的脂質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵作用，這可能會進(jìn)一步影響山羊奶中脂質(zhì)的成分。

2.4 在畜禽抗病力研究中的應(yīng)用

全球范圍內(nèi)畜禽傳染病會降低動物生產(chǎn)能力和質(zhì)量，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)巨大損失。宿主可以通過特定的基因編碼的抗微生物肽或蛋白質(zhì)，直接破壞或抑制病原微生物，或者阻斷病原微生物進(jìn)入宿主細(xì)胞所需的受體。此外，還可以通過干擾病原微生物的生命周期過程，阻礙正常生存和復(fù)制，從而降低其對宿主的傷害程度。這兩種策略都是宿主自身的機(jī)制來保護(hù)自己免受感染。因此，如何從源頭上進(jìn)行疾病的預(yù)防是目前農(nóng)牧業(yè)面臨的關(guān)鍵問題[69]。

黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5 (melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)、線粒體抗病毒信號(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)蛋白和干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)均為細(xì)胞對抗病原微生物感染相關(guān)的蛋白質(zhì)，它們在細(xì)胞內(nèi)形成一個信號傳遞網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)免疫反應(yīng)的激活和病原微生物的清除。雞的先天免疫系統(tǒng)具有兩種主要的病原體識別受體，即Toll樣受體3(toll-like receptor 3，TLR3)和MDA5，通過敲除雞DF-1成纖維細(xì)胞中和MDA5蛋白，與WT細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)雙敲除細(xì)胞中AOAV-1病毒的復(fù)制率明顯提高[70]。粘病毒抵抗基因(myxovirus resistance，Mx)被證明具有廣泛的抗病毒和GTP酶活性。為了研究雞對新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染的影響，使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建了敲除基因的DF-1細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)敲除的細(xì)胞中NDV的病毒滴度更高，并促進(jìn)了一些免疫因子的表達(dá)。表明在防止病毒侵入中發(fā)揮了重要的作用[71]。此外，敲除基因后，牛乳腺上皮細(xì)胞對鳥分枝桿菌副結(jié)核病(subsp.，MAP)菌株細(xì)胞溶解物的炎癥反應(yīng)減弱，表現(xiàn)出更低的炎癥因子的產(chǎn)生，這暗示在MAP感染誘導(dǎo)的牛乳腺炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可能對抗MAP菌株感染具有潛在保護(hù)作用[72]。敲除也影響牛乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)、增殖、遷移和β-酪蛋白分泌，能夠減少乳腺炎的發(fā)生[73]。對患有糖原分支酶缺乏癥(glycogen branching enzyme deficiency，GBED)的馬進(jìn)行基因組篩查，檢測到這些馬在GBE1基因有一個點(diǎn)突變，隨后，使用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)來針對這個點(diǎn)突變進(jìn)行修復(fù)，成功地恢復(fù)了基因的正常表達(dá)和功能，并實(shí)現(xiàn)了對GBED馬的治療，這項(xiàng)研究也暗示，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是對畜禽遺傳疾病進(jìn)行研究和治療的有效工具[74]。

豬β-防御素2(porcine beta-defensin 2，PBD-2)是一種重要的天然免疫分子，具有廣譜的抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)功能。研究人員使用CRISPR/Cas9和Cre/loxP系統(tǒng)生成無標(biāo)記的PBD-2敲入豬的基因座，再通過體細(xì)胞核移植產(chǎn)生克隆仔豬，發(fā)現(xiàn)PBD-2在轉(zhuǎn)基因仔豬不同組織中的表達(dá)水平顯著高于WT仔豬，并且克隆豬的豬耳成纖維細(xì)胞的抗菌特性顯著增加[75]。在一項(xiàng)關(guān)于非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)研究中，發(fā)現(xiàn)了5種豬干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(SwIFITM1a、-1b、-2、-3和-5)敲除增強(qiáng)了ASFV的復(fù)制，這表明SwIFITMs對ASFV具有強(qiáng)烈的抗病毒作用[76]。自然抵抗相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1 (natural resistance-associated macrophage protein 1，NRAMP1)在抗菌免疫中發(fā)揮重要作用。通過使用Cas9剪切酶的單個活性位點(diǎn)，在牛的基因組中插入NRAMP1蛋白，顯著降低離靶效應(yīng)并提高基因編輯的精確性，獲得了具有強(qiáng)抗結(jié)核病的轉(zhuǎn)基因牛[77]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立組蛋白脫乙酰酶9(histone deacetylases 9，HDAC9)敲除BHK-21細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在口蹄疫病毒感染后各病毒相關(guān)指標(biāo)均增長，這說明HDAC9在宿主抗病毒先天免疫應(yīng)答中有至關(guān)重要的作用[78]。

馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)是家禽中一種常見的傳染性疾病，對家禽產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通過敲除MDV關(guān)鍵基因，研究人員成功阻斷了MDV的復(fù)制和傳播，從而有效抑制了馬立克病病毒的感染。這項(xiàng)研究為控制馬立克病的傳播和疫苗開發(fā)提供了新的思路和方法[79]。在牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)方面，一篇研究探討了黃病毒科瘟病毒屬內(nèi)不同病毒在宿主細(xì)胞中的進(jìn)入機(jī)制。該報道顯示，牛補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白46 (complement regulatory protein 46，CD46BOV)在不同病毒中具有不同的作用。CD46BOV作為HoBi樣瘟病毒(HoBi-like pestiviruses，HoBiPeV)的主要細(xì)胞進(jìn)入因子，而不是起源于肯尼亞的長頸鹿瘟病毒(giraffe pestivirus，GPeV)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，、、和的病毒分離株能夠通過使用硫酸乙酰肝素進(jìn)入宿主細(xì)胞來適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)條件。這表明不同的牛瘟病毒使用不同的宿主細(xì)胞進(jìn)入機(jī)制[80]。偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是一種嗜神經(jīng)病毒，可引起豬的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在PRV進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中，血小板反應(yīng)蛋白3 (thrombospondin 3，THBS3)起著重要作用。THBS3是一種新的PRV的共受體，可以與PRV的包膜糖蛋白相互作用，啟動PRV進(jìn)入細(xì)胞的過程。通過在不同細(xì)胞中敲除或過表達(dá)THBS3來驗(yàn)證其在PRV感染中的作用，結(jié)果顯示THBS3通過與PRV的特定蛋白相互作用，促進(jìn)了病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合和膜融合[81]。

通過多基因編輯可以使家畜對多種主要病毒具有抗性。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reprodu-ctive and respiratory syndrome virus，PRRSV)和傳染性腸胃炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是兩種對全球養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失的高傳染性病毒。對CD163和pAPN進(jìn)行雙基因敲除的豬，發(fā)現(xiàn)DKO豬對PRRSV和TGEV具有完全耐藥性。在肉質(zhì)和繁殖性能方面，野生型和雙基因敲除豬沒有差異，并且敲除豬對豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)的易感性也降低了[82]。

2.5 在動物福利改善中的研究進(jìn)展

執(zhí)行動物福利的必要性是基于人們對動物的道德責(zé)任和尊重。動物是有感知和情感的生物，應(yīng)該受到適當(dāng)?shù)年P(guān)愛和保護(hù)。隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展，基因編輯技術(shù)可以避免牲畜遭受一些比如犢牛去角、雄性閹割、奶牛去尾、墮胎或剔除不需要的性別等不必要的痛苦[83]。

安格斯牛的1號染色體上P等位基因的變異由212 bp的DNA重復(fù)序列組成，取代了無角位點(diǎn)的10 bp序列導(dǎo)致了其自然無角。Hennig等[84]通過CRISPR/Cas9技術(shù)采用雙sgRNA刪除了一個包括在無角位點(diǎn)缺失的10 bp的133 bp區(qū)域，隨后進(jìn)行133 bp缺失胚胎的移植，最終獲得了缺失133 bp的雙等位基因胎兒，但均顯示出角芽發(fā)育，因此還需進(jìn)一步研究尋找其他引發(fā)無角表型的因素。

通常，為了削除腥臭味，用于豬肉供應(yīng)的雄性仔豬會進(jìn)行手術(shù)閹割。然而，這可能導(dǎo)致雄性仔豬的感染和身體的痛苦。Flórez等[85]將KiSS-1轉(zhuǎn)移抑制因子(KiSS-1 metastasis suppressor，KISS1)作為目標(biāo)，通過使用CRISPR/Cas9技術(shù)，在豬的基因組中編輯了基因，成功地導(dǎo)致其功能受損，編輯后的豬表現(xiàn)出下丘腦性性腺功能減退癥(hypogo-nadotropic hypogonadism)的特征，即性腺功能不正常。該研究為提供一種無需進(jìn)行去勢的方法來控制豬的繁殖特征提供了可能性。

熱應(yīng)激可能導(dǎo)致動物的脫水、電解質(zhì)紊亂、增加患病風(fēng)險等健康問題，還可能導(dǎo)致如減少活動和出現(xiàn)不安行為等行為改變，并且導(dǎo)致如生長速度減緩、產(chǎn)蛋量下降。因此，亟需采取相應(yīng)的措施解決熱應(yīng)激對家養(yǎng)動物的影響，從而保障健康、行為和生產(chǎn)能力。催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)和熱休克蛋白(heat shock 70 kDa protein 1-like，HSPA1L)的突變可賦予牛良好的體溫調(diào)節(jié)和細(xì)胞保護(hù)能力。通過基因編輯技術(shù)將這些特定基因轉(zhuǎn)移給無法適應(yīng)高溫氣候的品種，有望減少熱應(yīng)激對牛類生產(chǎn)的影響[86]。

3 結(jié)語與展望

盡管CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組編輯領(lǐng)域的應(yīng)用被認(rèn)為是一項(xiàng)具有巨大潛力的革命性進(jìn)展，但在學(xué)術(shù)領(lǐng)域和公眾之間仍存在分歧，這些分歧包括技術(shù)應(yīng)用的安全性和可靠性問題。首先，安全性方面的問題主要涉及到對編輯動物基因組的全面評估。這包括檢查編輯基因?qū)游锉旧硪约爸車h(huán)境的潛在影響，并評估潛在的風(fēng)險。此外，還需要關(guān)注導(dǎo)入基因組的穩(wěn)定性和遺傳多樣性的維持，以避免不可逆的遺傳塑造和遺傳缺陷。通過全面的安全評估，可以確保編輯動物在健康和繁殖能力方面與非編輯群體一致，并減少任何可能的不良遺傳影響。其次，可靠性方面的問題涉及到技術(shù)本身的精確性和效率。CRISPR/Cas9技術(shù)在基因編輯方面具有準(zhǔn)確性和高效性的優(yōu)點(diǎn)，但仍需繼續(xù)改進(jìn)。除此之外，也需要集中精力解決編輯技術(shù)中的潛在誤差和副作用，以提高技術(shù)的可靠性和預(yù)測性。CRISPR/Cas9技術(shù)在基因編輯畜禽動物中未來發(fā)展的重要方向?yàn)檫M(jìn)一步研究基因功能和基因網(wǎng)絡(luò)的理解，以及CRISPR/ Cas9與其他基因編輯技術(shù)的結(jié)合。這些方向?qū)⒂兄谶M(jìn)一步拓寬畜禽遺傳改良的可能性?？傮w而言，隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，相信它將在畜牧業(yè)遺傳改良中發(fā)揮越來越重要的作用，并為提高畜禽生產(chǎn)效率和質(zhì)量做出貢獻(xiàn)。

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Progress on CRISPR/Cas9 system in the genetic improvement of livestock and poultry

Yanchun Bao1,2, Lingli Dai2,3, Zaixia Liu1,2, Fengying Ma1,2, Yu Wang4, Yongbin Liu5, Mingjuan Gu1,2, Risu Na1,2, Wenguang Zhang1,2,6

CRISPR/Cas9 gene editing technology, as a highly efficient genome editing method, has been extensively employed in the realm of animal husbandry for genetic improvement. With its remarkable efficiency and precision, this technology has revolutionized the field of animal husbandry. Currently, CRISPR/Cas9-based gene knockout, gene knock-in and gene modification techniques are widely employed to achieve precise enhancements in crucial production traits of livestock and poultry species. In this review, we summarize the operational principle and development history of CRISPR/Cas9 technology. Additionally, we highlight the research advancements utilizing this technology in muscle growth and development, fiber growth, milk quality composition, disease resistance breeding, and animal welfare within the livestock and poultry sectors. Our aim is to provide a more comprehensive understanding of the application of CRISPR/Cas9 technology in gene editing for livestock and poultry.

CRISPR/Cas9; gene editing; livestock and poultry; genetic improvement;economic traits

2024-01-17;

2024-02-25;

2024-02-29

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：2021ZD05)，內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項(xiàng)目(編號：2021GG0008)，內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(編號：2021ZD0009)，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院高水平成果培育專項(xiàng)(編號：BZX202201)和內(nèi)蒙古自治區(qū)直屬高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(編號：BR221024)資助[Supported by the Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region (No. 2021ZD05), the Science and Technology Plan Project of Inner Mongolia Autonomous Region (No. 2021GG0008), the Major Science and Technology Project of Inner Mongolia Autonomous Region (No. 2021ZD0009), the High Level Achievement Cultivation Project of College of Animal Science of Inner Mongolia Agricultural University (No. BZX202201) and the Basic Research Expenses of Universities Directly of Inner Mongolia Autonomous Region (No. BR221024)]

鮑艷春，博士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: byc107054@163.com

谷明娟，博士，講師，研究方向：肉牛分子育種。E-mail: gmj0119@yeah.net

娜日蘇，博士，副教授，研究方向：牛羊遺傳育種與繁殖。E-mail: narisu@swu.edu.cn

張文廣，博士，教授，研究方向：數(shù)量基因組學(xué)與生物信息學(xué)。E-mail: actgnmbi@aliyun.com

10.16288/j.yczz.24-021

(責(zé)任編委: 姜雨)