美托洛爾聯(lián)合氯吡格雷對心肌缺血再灌注損傷小鼠的作用機(jī)制*

門汝梅 王艷林 張琳娜 門麗麗 蘭文達(dá) 孟慶蘭 于建才

(1.滄州市人民醫(yī)院心內(nèi)三科,河北 滄州 061099;2.滄州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院手顯微外二科,河北 滄州 061013;3.滄州市中心醫(yī)院心內(nèi)二科,河北 滄州 061017)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是冠心病中最嚴(yán)重、危害最大的病癥之一,具有發(fā)病急驟、進(jìn)展迅速、復(fù)雜多變、并發(fā)癥多、死亡率高等特點(diǎn)[1]。AMI治療方法通常為溶栓療法、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路移植術(shù)(冠脈搭橋術(shù))[2]。多數(shù)情況下,缺血后再灌注可使組織器官功能得到恢復(fù),損傷的結(jié)構(gòu)得到修復(fù),患者病情好轉(zhuǎn)康復(fù);但有時(shí)缺血后再灌注,不僅不能使組織、器官功能恢復(fù),反而加重組織、器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷[3]。這種在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷反而加重,甚至使心肌發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia reperfusion,MI/R)損傷。MI/R損傷是一個(gè)重要的臨床問題,尚缺乏有效的治療方案。研究表明β受體阻滯藥降低AMI病死率與減慢心率有關(guān),β受體阻滯藥美托洛爾能夠選擇作用于心臟,不增加周圍血管阻力和影響后負(fù)荷,且不增加支氣管阻力,故臨床上較常選用[4]。研究發(fā)現(xiàn)美托洛爾治療具有降低MI/R損傷引發(fā)的心肌梗死[5]。此外,AMI患者再灌注期間要常給予抗血小板藥物治療,避免血栓形成[6]。研究表明在MI/R損傷過程,血小板激活通過分泌血清素等促進(jìn)循環(huán)系統(tǒng)中性粒細(xì)胞激活,激活的中性粒細(xì)胞會浸潤至缺血再灌注區(qū)域心肌組織中,然后發(fā)生脫顆粒,引發(fā)心肌組織損傷[7]。因此,抗血小板藥物在抗凝的同時(shí)可能具有改善MI/R損傷的功能。本研究探討美托洛爾聯(lián)合抗血小板藥物氯吡格雷對MI/R損傷小鼠的作用,為臨床MI/R損傷藥物治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 75只10周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(京)2022-0009]。飼養(yǎng)條件:飼養(yǎng)盒內(nèi)飼養(yǎng),溫度20～26 ℃,濕度40%～60%。本研究獲滄州市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[審批號:K2022-批件-065(11.1)]。

1.2 動物分組及MI/R損傷模型復(fù)制 小鼠隨機(jī)化分為假手術(shù)組、模型組、美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組,每組15只。術(shù)前分別給予假手術(shù)組和模型組生理鹽水灌胃、美托洛爾組美托洛爾(阿斯利康制藥有限公司,10 mg/kg/d)灌胃、氯吡格雷組氯吡格雷(賽諾菲安萬特杭州制藥有限公司,20 mg/kg/d)灌胃、聯(lián)合組美托洛爾(10 mg/kg/d)和氯吡格雷(20 mg/kg/d)灌胃。各組小鼠吸入3%異氟烷麻醉誘導(dǎo),1.5%～2%異氟烷麻醉維持。方法:將小鼠以仰臥位放置,剪開左胸皮膚,鈍性分離胸肌,然后經(jīng)第4肋間隙開胸迅速暴露心腔,心包打開后,小鼠心臟暴露,用左手手指調(diào)整心臟位置使心尖朝向胸廓開口處,在心臟跳動的帶動下輕輕將心臟擠出至胸外,假手術(shù)組小鼠使用7-0絲線在距心底3 mm處左前降支冠狀動脈下穿線,不結(jié)扎。其余組小鼠使用7-0絲線在距心底3 mm處左前降支冠狀動脈下穿線結(jié)扎,形成活結(jié),然后將心臟迅速放回胸腔,手動排空氣,胸腔皮膚用4-0絲線縫合。缺血30 min時(shí),將心臟上7-0結(jié)扎絲線解開并移除。

1.3 心臟超聲檢查 采用VeVo 2100小動物超聲儀(VisualSonics公司)檢測再灌注24 h后小鼠心功能。將小鼠用3%異氟烷誘導(dǎo)麻醉,然后用1.5%～2%異氟烷維持麻醉狀態(tài)。將小鼠以仰臥位放置,在其胸部涂上超聲耦合劑,通過超聲儀檢測心臟功能和心室結(jié)構(gòu),評估左心室射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction,EF)和左心室縮短分?jǐn)?shù)(Fraction shortening,FS)。

1.4 心臟伊文思藍(lán)及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 MI/R 24 h后,用1%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉小鼠,按缺血時(shí)的位置、寬度和深度結(jié)扎左前降支冠狀動脈,通過升主動脈將2%的伊文思藍(lán)染料200 μL注入心臟。取下其心臟并用PBS漂洗,吸水紙吸干心臟表面的水分。將心臟在-80 ℃冷凍30 min以上,然后將結(jié)扎線以下的心臟組織橫向平均切成五片。切片置于1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(索萊寶生物科技有限公司)中,37 ℃避光孵育10 min,然后用10%福爾馬林固定2～4 h。對染色后的心臟組織進(jìn)行拍照記錄。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測 MI/R 24 h后,取50 μL各組小鼠外周血,分別加入0.5 μL FITC標(biāo)記的抗小鼠CD41a抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠CD62p抗體,冰上孵育30 min,然后4 ℃ 400 g離心5 min,將沉淀細(xì)胞用FACS緩沖液重懸,流式上機(jī)檢測。所有抗體均購于Biolegend公司。

1.6 免疫熒光及TUNEL染色 MI/R 24 h后,取小鼠心臟,采用10%福爾馬林溶液固定組織24 h,然后將固定的組織脫水,石蠟包埋,制備石蠟切片。免疫熒光染色:取石蠟切片,脫蠟、固定,山羊血清(中杉金橋)進(jìn)行封閉,然后分別使用兔抗小鼠Ly6G抗體(Abcam公司)、大鼠抗小鼠CD41抗體對組織中性粒細(xì)胞和血小板進(jìn)行染色,4 ℃孵育16 h,洗片后再使用Alex Flour488標(biāo)記的抗兔IgG抗體(中杉金橋)及Alex Flour594標(biāo)記的抗大鼠IgG抗體(中杉金橋)室溫孵育1 h,洗片后用DAPI封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。TUNEL染色:石蠟切片經(jīng)二甲苯透明和梯度乙醇脫蠟水化處理后,使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色FITC標(biāo)記熒光檢測法,凱基生物)對小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析,具體方法參照試劑盒說明書,通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡狀況。

1.7 Western blot檢測 MI/R 24 h后,取小鼠心臟,然后加入1 mL RIPA裂解液,使用組織勻漿機(jī)對組織進(jìn)行勻漿,勻漿后的組織放于冰上裂解10 min,之后4 ℃,12 000 g離心5 min,取上清液;然后往上清液中加入上樣緩沖液;SDS-PAGE跑膠、轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)印蛋白的膜用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h,之后抗小鼠Caspase 3抗體(1∶1 000)、PARP-1抗體(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)抗體4 ℃孵育12 h(GAPDH、Caspase 3和PARP-1抗體均購于Abcam公司),然后使用HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h,最后加入ECL發(fā)光液曝光檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心功能變化 MI/R損傷手術(shù)前各組小鼠左心室EF值和FS值無顯著性差異(P>0.05)。手術(shù)后(再灌注24 h后),模型組、美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組小鼠左心室EF值、FS值相比于手術(shù)前顯著降低(P<0.05);美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組小鼠左心室EF值、FS值顯著高于模型組(P<0.05);聯(lián)合組小鼠左心室EF值、FS值分別顯著高于美托洛爾組、氯吡格雷組(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠左心室EF和FS比較

2.2 各組小鼠缺血再灌注區(qū)心肌梗死面積比較 伊文思藍(lán)-TTC染色結(jié)果顯示,再灌注24 h后,假手術(shù)組、模型組、美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組小鼠缺血危險(xiǎn)區(qū)面積/心臟總面積無顯著性差異(P>0.05);模型組、美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組小鼠缺血區(qū)心肌梗死面積顯著高于假手術(shù)組(P<0.05);美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組小鼠缺血區(qū)心肌梗死面積顯著低于模型組(P<0.05);聯(lián)合組小鼠缺血區(qū)心肌梗死面積分別顯著低于美托里爾組和氯吡格雷組(P<0.05),見圖1。

圖1 各組小鼠缺血再灌注區(qū)心肌梗死面積比較

2.3 各組小鼠外周血血小板活化水平比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測分析結(jié)果顯示,再灌注24 h后,模型組、美托洛爾組、氯吡格雷組外周血血小板活化水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),氯吡格雷組和聯(lián)合組外周血血小板活化水平顯著低于模型組(P<0.05),聯(lián)合組外周血血小板活化水平分別顯著低于美托洛爾組和氯吡格雷組(P<0.05),與假手術(shù)組水平接近(P>0.05),見圖2。

圖2 各組小鼠外周血血小板活化水平比較

2.4 各組小鼠缺血再灌注區(qū)血小板、中性粒細(xì)胞沉積水平比較 免疫熒光染色結(jié)果顯示,再灌注24 h后,模型組、美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組缺血再灌注區(qū)心肌組織血小板、中性粒細(xì)胞沉積顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),美托洛爾組、氯吡格雷組、聯(lián)合組缺血再灌注區(qū)心肌組織血小板、中性粒細(xì)胞沉積顯著低于模型組(P<0.05),氯吡格雷組比美托洛爾組下降更明顯,聯(lián)合組缺血再灌注區(qū)心肌組織血小板、中性粒細(xì)胞沉積分別顯著低于美托洛爾組和氯吡格雷組(P<0.05),見圖3。

圖3 各組小鼠缺血再灌注區(qū)血小板、中性粒細(xì)胞沉積水平比較

2.5 各組小鼠缺血再灌注區(qū)心肌細(xì)胞凋亡水平比較 TUNEL染色結(jié)果顯示,再灌注24 h后,模型組、美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組缺血再灌注區(qū)心肌組織凋亡心肌細(xì)胞顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組缺血再灌注區(qū)心肌組織凋亡心肌細(xì)胞顯著少于模型組(P<0.05),美托洛爾組比氯吡格雷組下降更明顯;聯(lián)合組缺血再灌注區(qū)心肌組織凋亡心肌細(xì)胞分別顯著低于美托洛爾組、氯吡格雷組(P<0.05),見圖4。

圖4 各組小鼠缺血再灌注區(qū)心肌組織TUNEL染色比較

2.6 各組小鼠缺血再灌注區(qū)凋亡調(diào)控蛋白水平比較 Western blot檢測結(jié)果顯示,再灌注24 h后,模型組、美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組缺血再灌注區(qū)心肌組織剪切的Caspase 3和PARP1水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),美托洛爾組、氯吡格雷組及聯(lián)合組缺血再灌注區(qū)心肌組織剪切的Caspase 3和PARP1水平顯著少于模型組(P<0.05),美托洛爾組比氯吡格雷組減少更明顯;聯(lián)合組缺血再灌注區(qū)心肌組織剪切的Caspase 3和PARP1水平分別顯著低于美托洛爾組、氯吡格雷組(P<0.05),見圖5。

3 討論

冠心病是臨床常見的缺血性心臟病,是指冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞,導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。各種血運(yùn)重建手段通過及時(shí)有效地恢復(fù)心肌血液灌注,可以減輕缺血導(dǎo)致的心肌損傷及壞死,然而心肌缺血后恢復(fù)血液再灌注本身也可進(jìn)一步導(dǎo)致MI/R損傷。病理性缺血與心肌梗死治療后再損傷的耦合性疾病,尤其難以治療。盡管心臟保護(hù)作用在動物實(shí)驗(yàn)中取得了成功,但事實(shí)證明將其轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐很困難[8]。目前為解決臨床MI/R損傷藥物治療問題,對現(xiàn)有心血管疾病藥物用于MI/R損傷治療的研究顯得尤為重要。

美托洛爾是一種高選擇性β受體阻滯藥,它廣泛使用于心力衰竭和AMI的臨床治療,且有研究顯示美托洛爾治療能夠顯著減少AMI患者治療后的死亡率,且動物實(shí)驗(yàn)研究表明美托洛爾能夠減少M(fèi)I/R損傷后心肌梗死面積,其機(jī)制與抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[9-10]。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)美托洛爾干預(yù)能夠顯著改善小鼠MI/R損傷后心功能,減少心肌梗死面積。另外,AMI患者經(jīng)治療后心肌恢復(fù)血流后都會給予抗凝藥治療,避免術(shù)后血栓形成,引發(fā)二次堵塞,其中抗血小板抗凝劑氯吡格雷是常用的抗凝劑。氯吡格雷是通過抑制血小板表面的ADP受體(P2Y12),起到抑制血小板的作用以預(yù)防血栓形成。與其他抗血小板抗凝劑如阿司匹林相比,氯吡格雷具有抗血小板作用強(qiáng)、起效快等特點(diǎn),且長期使用氯吡格雷的安全性比阿司匹林更高[11]。研究表明血小板通過其受體P2Y12激活后,能夠調(diào)控機(jī)體中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞激活[12]。此外,在MI/R損傷過程中血小板介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)扮演至關(guān)重要角色。研究表明,當(dāng)缺血心臟恢復(fù)血流發(fā)生再灌注時(shí),小鼠循環(huán)系統(tǒng)中血小板被激活,激活的血小板釋放血清素,繼而激活循環(huán)系統(tǒng)中性粒細(xì)胞,使中性粒細(xì)胞浸入至缺血再灌注損傷區(qū)域,導(dǎo)致心肌梗死加重[13-14]。此外,在MI/R損傷過程激活的血小板會沉積在心臟微血管上,導(dǎo)致微血管堵塞,引發(fā)心臟微循環(huán)障礙,導(dǎo)致心肌梗死加重[15-16]。因此,抗血小板P2Y12受體的氯吡格雷可能具有改善MI/R損傷的作用。本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)給予氯吡格雷治療改善小鼠MI/R損傷后心功能,減少缺血再灌注區(qū)心肌梗死面積,其效果與單獨(dú)使用美托洛爾效果相當(dāng)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)美托洛爾聯(lián)合氯吡格雷改善MI/R損傷后心功能及減少心肌更面積的能力顯著優(yōu)于單獨(dú)使用美托洛爾或氯吡格雷。

MI/R損傷機(jī)制涉及炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞凋亡等[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),MI/R損傷小鼠外周血血小板激活水平及缺血再灌注區(qū)小鼠心肌血小板沉積顯著高于假手術(shù)組,美托洛爾或氯吡格雷單獨(dú)治療及氯吡格雷聯(lián)合美托洛爾治療小鼠外周血血小板活化水平、缺血再灌注區(qū)小鼠心肌血小板沉積顯著下降,但氯吡格雷單獨(dú)治療血小板活化程度弱于美托洛爾,提示氯吡格雷主要通過抑制血小板激活改善MI/R損傷。對缺血再灌注區(qū)心肌組織凋亡分析發(fā)現(xiàn),MI/R損傷小鼠缺血再灌注區(qū)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量及心肌組織剪切的Caspase 3、PARP1蛋白水平顯著高于假手術(shù)組,美托洛爾或氯吡格雷單獨(dú)及聯(lián)合治療小鼠缺血再灌注區(qū)小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量及心肌組織剪切的Caspase 3、PARP1蛋白水平顯著下降,但美托洛爾單獨(dú)治療小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量及心肌組織剪切的Caspase 3、PARP1蛋白水平少于氯吡格雷,提示美托洛爾主要是通過抑制心肌細(xì)胞凋亡改善MI/R損傷。有研究發(fā)現(xiàn)[19-20],MI/R損傷與Toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子κB(TLR4/NF-κB)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK/STAT-3)等信號通路有關(guān),其中心肌缺血后PARP蛋白上調(diào),并通過增強(qiáng)NF-κB活性和增加基質(zhì)金屬蛋白酶9的mRNA和蛋白表達(dá)造成再灌注損傷;MI/R后大鼠心肌組織NF-κB和Caspase-3活性明顯升高,而抑制JAK/STAT信號通路后心肌組織NF-κB和Caspase-3表達(dá)下調(diào),但目前有關(guān)美托洛爾聯(lián)合氯吡格雷通過調(diào)控上述信號通路來影響Caspase 3、PARP1蛋白表達(dá)的詳細(xì)機(jī)制仍有待完善。由于MI/R損傷具有復(fù)雜的分子機(jī)制,美托洛爾及氯吡格雷均展現(xiàn)了抑制心肌細(xì)胞凋亡及血小板活化,但是二者也都基于其藥物特點(diǎn),展現(xiàn)出相應(yīng)側(cè)重的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

美托洛爾聯(lián)合氯吡格雷治療心肌缺血再灌注損傷效果優(yōu)于美托洛爾或氯吡格雷單獨(dú)治療,其機(jī)制與抑制心肌細(xì)胞凋亡及血小板激活有關(guān)。