黃芩苷通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

蘇大為 劉玲 楊志龍

(1.蘭州市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,甘肅 蘭州 730050;2.甘肅省中心醫(yī)院心血管內(nèi)科,甘肅 蘭州 730080;3.蘭州市第一人民醫(yī)院健康管理中心,甘肅 蘭州 730050)

心力衰竭是各種心臟疾病終末階段所表現(xiàn)出來(lái)的一種綜合征,具有高患病率、致殘率及死亡率,且病情復(fù)雜,預(yù)后差,是威脅人類健康的重大疾病之一[1]。目前治療心力衰竭的主要手段是藥物治療,西藥以利尿劑、強(qiáng)心劑、擴(kuò)血管劑等為主,但往往由于心力衰竭合并癥多且病情反復(fù)、藥物耐受性不良等因素影響療效[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心衰總病機(jī)是“氣虛血瘀水停”,治療總原則以益氣活血利水為法[3]。中藥提取物黃芩苷是從黃芩中提取的一種酮類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。近年來(lái)已發(fā)現(xiàn),在各種心血管疾病治療中表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)、抗炎以及保護(hù)心肌細(xì)胞等作用[4],例如,黃芩苷可對(duì)心臟驟停后缺血性心肌損傷提供心臟保護(hù)[5],對(duì)心肌衰竭大鼠心律失常、心室重構(gòu)、凋亡起保護(hù)作用[6]。目前,雖有較多文獻(xiàn)證實(shí)黃芩苷對(duì)心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用,但具體的作用機(jī)制尚不清楚。Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2/STAT3)信號(hào)通路是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族,可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)特性及炎性反應(yīng)等。研究表明,JAK2/STAT3信號(hào)通路參與調(diào)控心肌炎心肌損傷的發(fā)展[7],在腦缺血再灌注損傷炎性反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用[8]。但黃芩苷對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路作用尚未可知。基于此,進(jìn)行了本研究實(shí)驗(yàn),旨在為心肌損傷的體外研究提供新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、藥品與試劑 大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)購(gòu)自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。胎牛血清(FBS)(貨號(hào):10270-106)、DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào):12100)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,黃芩苷(貨號(hào):B20570)、LPS(貨號(hào):S11060-10mg)、JAK2/STAT3通路抑制劑AG490(貨號(hào):S31521)、JAK2/STAT3通路激活劑colivelin(貨號(hào):867021-83-8)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):ST067)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Hochest 33258染色試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)(貨號(hào):40203ES80)購(gòu)自上海翌圣生物有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):R312-02)、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(貨號(hào):Q711-02)購(gòu)自杭州主諾生物技術(shù)有限公司,RIPA裂解液(貨號(hào):R0010)購(gòu)自北京索萊寶公司,BCA蛋白試劑盒(貨號(hào):ab207001)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,鼠抗人[JAK2(貨號(hào):SAB4501601,稀釋比例:1∶1 000)購(gòu)自Sigma公司、STAT3(貨號(hào):TA347058,稀釋比例:1∶5 000)購(gòu)自北京中杉金橋公司、p-JAK2(貨號(hào):WL02997,稀釋比例:1∶500)購(gòu)自萬(wàn)類生物科技有限公司、p-STAT3(貨號(hào):sc-8059,稀釋比例:1∶1 000)購(gòu)自SantaCruz公司、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)(貨號(hào):66470-2-Ig,稀釋比例:1∶3 000)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(貨號(hào):60186-1-Ig,稀釋比例:1∶5 000)及β-actin一抗(貨號(hào):66009-1-Ig,稀釋比例:1∶5 000)購(gòu)自武漢三鷹生物有限公司]、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(二抗)(貨號(hào):ab6789,稀釋比例:1∶5 000)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。DM1000型倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司),MCO18AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)公司),7Champ Gd5000型凝膠成像系統(tǒng)(杭州賽智科技有限公司),500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(美國(guó)ABI公司),酶標(biāo)儀(Multiskan FC,美國(guó)Thermo公司)等。

1.2 方法

1.2.1 H9C2細(xì)胞培養(yǎng) 心肌細(xì)胞株H9C2接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,并置于70%～80%濕度,5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔2～3 d更換一次培養(yǎng)液,生長(zhǎng)密度達(dá)>80%時(shí)傳代,達(dá)到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組與干預(yù) 將心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組和LPS+5、10、20、40 μmol/L黃芩苷組。對(duì)照組細(xì)胞不做干預(yù),LPS組以1 μg/mL LPS刺激24 h構(gòu)建體外炎癥模型,LPS+5、10、20、40 μmol/L黃芩苷組在LPS組的基礎(chǔ)上加入5、10、20、40 μmol/L黃芩苷。篩選出最適濃度黃芩苷后,再次分組:對(duì)照組、LPS組、LPS+10 μmol/L黃芩苷組、LPS+AG490組、LPS+10 μmol/L黃芩苷+AG490組和LPS+10 μmol/L黃芩苷+colivelin組。LPS+AG490組是在LPS組的基礎(chǔ)上,加入20 μmol/L AG490,LPS+10 μmol/L黃芩苷+AG490組在LPS組的基礎(chǔ)上,加入10 μmol/L黃芩苷,同時(shí)加入20 μmol/L AG490,LPS+10 μmol/L黃芩苷+colivelin組在LPS組的基礎(chǔ)上,加入10 μmol/L黃芩苷,同時(shí)加入0.5 μmol/L colivelin,復(fù)孔為3個(gè),培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37 ℃,5% CO2)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定H9C2細(xì)胞因子表達(dá)情況 細(xì)胞分組方法同1.2.2,干預(yù)24 h的細(xì)胞,取各組細(xì)胞上清液,分別遵循白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒說(shuō)明書操作步驟,測(cè)定細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平。

1.2.4 CCK-8法測(cè)定H9C2細(xì)胞活力 取干預(yù)24和48 h的各組細(xì)胞,加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng),2 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處各孔的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(LPS組或5、10、20、40 μmol/L黃芩苷組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.5 EdU法測(cè)定H9C2細(xì)胞增殖率 各組細(xì)胞EdU處理:去除培養(yǎng)液后4%多聚甲醛固定(0.5 mL,室溫15 min),BSA洗滌(0.5 mL 3%,3次);TritonX-100去除BSA(0.5 mL 0.3% )后室溫10 min,BSA洗滌(3次);加200 μL Click反應(yīng)液(現(xiàn)配現(xiàn)用,12孔板),室溫孵育30 min(避光)后去除Click反應(yīng)液;每孔加入0.5 mL Hoechst(室溫孵育10 min),去除Hoechst;拍照(熒光顯微鏡,Zen處理圖片)。細(xì)胞增殖率(%)=(紅光細(xì)胞/藍(lán)光細(xì)胞)×100%。

1.2.6 Hochest 33258染色法測(cè)定H9C2細(xì)胞的凋亡情況 取各組干預(yù)24 h的細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞2次(每次5 min),加入新鮮配置4%多聚甲醛,4 ℃固定10 min。PBS洗滌細(xì)胞3次(每次5 min),Hochest 33258染色液(5 mg/L)染色10 min,PBS洗滌細(xì)胞3次(每次5 min),封固后熒光顯微鏡觀察、隨機(jī)選擇3個(gè)視野拍照,分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡特征為核體積濃縮變小,染色不均濃染且所發(fā)熒光較強(qiáng),呈亮藍(lán)色。細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定H9C2細(xì)胞中Cyclin D1、Caspase-3 信使RNA相對(duì)表達(dá)量 RNA抽提試劑盒提取各組干預(yù)24 h后的細(xì)胞總RNA,測(cè)定其濃度阿純度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR檢測(cè)(上樣量=2 μL)程序?yàn)?預(yù)變性(95 ℃)10 min,變性(95 ℃)10 s,退火(60 ℃)20 s,延伸(72 ℃)34 s。40個(gè)循環(huán)(復(fù)孔=5個(gè))。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH,以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Cyclin D1和Caspase-3引物序列

1.2.8 蛋白免疫印跡(WB)法檢測(cè)H9C2細(xì)胞中增殖、凋亡與JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞分組同1.2.2,干預(yù)24 h時(shí),收集各組細(xì)胞,提取蛋白并進(jìn)行定量后上樣,凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉2 h后參照抗體說(shuō)明書加入一定稀釋比例的一抗(JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3、Cyclin D1及β-actin),孵育過(guò)夜(4 ℃),第二天TBST洗滌,加二抗(山羊抗鼠IgG),孵育2 h后進(jìn)行洗滌(3次),顯影液顯色后拍照。G代表蛋白灰度值,蛋白相對(duì)表達(dá)量=(G目的蛋白/G內(nèi)參蛋白β-actin)。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的炎癥 ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS組和LPS+5、10、20、40 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞炎癥因子TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),LPS組和LPS+5、10、20 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞炎癥因子IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),LPS組和LPS+5、10 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞炎癥因子IL-1β表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,LPS+5、10、20、40 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平降低,其中LPS+5 μmol/L黃芩苷組的IL-6和IL-1β無(wú)顯著差異(P>0.05),LPS+10、20和40 μmol/L黃芩苷組均有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 ELISA法測(cè)定黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥因子的影響

2.2 黃芩苷促進(jìn)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞的活力 使用CCK-8法檢測(cè)黃芩苷對(duì)H9C2細(xì)胞活力的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干預(yù)24 h時(shí),與對(duì)照組比較,LPS組和LPS+5、10、20、40 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞活力顯著降低,除LPS+10 μmol/L黃芩苷組外其余組差異均有顯著性(P<0.05);與LPS組相比,LPS+10 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05),其余組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。干預(yù)48 h時(shí),與對(duì)照組比較,LPS組和5、10、20、40 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.05);與LPS組相比,5、10、20、40 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞活力無(wú)顯著性差異(P>0.05);與24 h相比,48 h LPS組和5、10、20、40 μmol/L黃芩苷組均顯著降低(P<0.05)(圖2)。為排除細(xì)胞活力對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響,選擇干預(yù)24 h與LPS組有顯著差異且較低濃度的LPS+10 μmol/L黃芩苷組加入JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490和通路激活劑colivelin進(jìn)行JAK2/STAT3通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

圖2 CCK-8法測(cè)定黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活力的影響

2.3 黃芩苷抑制JAK2/STAT3通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞的增殖 EdU法檢測(cè)細(xì)胞的增殖,干預(yù)24 h,LPS組EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變少,黃芩苷處理后EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變多(圖3A),定量后發(fā)現(xiàn)(圖3B),LPS組細(xì)胞增殖率較對(duì)照組顯著下降(P<0.05);LPS+10 μmol/L黃芩苷組和LPS+AG490組細(xì)胞增殖率較LPS組顯著上升(P<0.05);LPS+10 μmol/L黃芩苷+AG490組細(xì)胞增殖率較LPS+10 μmol/L黃芩苷組顯著增加(P<0.05),LPS+10 μmol/L黃芩苷+colivelin組較LPS+10 μmol/L黃芩苷組顯著下降(P<0.05)。

圖3 EdU法檢測(cè)黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖率的影響

2.4 黃芩苷抑制JAK2/STAT3通路減輕LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞的凋亡 干預(yù)24 h后,與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,LPS+10 μmol/L黃芩苷組和LPS+AG490組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與LPS+10 μmol/L黃芩苷組相比,LPS+10 μmol/L黃芩苷+AG490組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),LPS+10 μmol/L黃芩苷+colivelin組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 Hoechst檢測(cè)黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響

2.5 黃芩苷促進(jìn)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)并抑制Caspase-3蛋白表達(dá) 對(duì)增殖凋亡相關(guān)Cyclin D1和Caspase-3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,LPS組Cyclin D1蛋白水平較對(duì)照組顯著下降,而Caspase-3蛋白水平較對(duì)照組顯著上升(P<0.05);LPS+10 μmol/L黃芩苷組和LPS+AG490組Cyclin D1蛋白水平較LPS組顯著上升,Caspase-3蛋白水平較LPS組顯著下降(P<0.05);LPS+10 μmol/L黃芩苷+AG490組Cyclin D1蛋白水平較LPS+10 μmol/L黃芩苷組顯著上升,Caspase-3蛋白水平較LPS+10 μmol/L黃芩苷組顯著下降(P<0.05),LPS+10 μmol/L黃芩苷+colivelin組Cyclin D1蛋白水平較LPS+10 μmol/L黃芩苷組顯著下降,Caspase-3蛋白水平較LPS+10 μmol/L黃芩苷組顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中Cyclin D1和Caspase-3表達(dá)水平的影響

2.6 黃芩苷促進(jìn)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)并抑制Caspase-3 mRNA表達(dá) 對(duì)增殖凋亡相關(guān)基因Cyclin D1和Caspase-3 mRNA水平檢測(cè),結(jié)果顯示,LPS組Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低,而Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,LPS+10 μmol/L黃芩苷組和LPS+AG490組Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與LPS+10 μmol/L黃芩苷組相比,LPS+10 μmol/L黃芩苷+AG490組Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),LPS+10 μmol/L黃芩苷+colivelin組Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平顯著降低,Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中Cyclin D1和Caspase-3表達(dá)的影響

2.7 黃芩苷抑制LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞JAK2/STAT3通路的活化 為了確定黃芩苷對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路活化狀態(tài)的影響,本研究檢測(cè)了該通路的關(guān)鍵性蛋白JAK2、STAT3和p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)水平(圖7A),蛋白定量分析結(jié)果顯示(圖7B),各組間JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05);與對(duì)照組相比,LPS組p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,LPS+10 μmol/L黃芩苷組和LPS+AG490組p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與LPS+10 μmol/L黃芩苷組相比,LPS+10 μmol/L黃芩苷+AG490組p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),LPS+10 μmol/L黃芩苷+colivelin組p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

圖7 WB檢測(cè)黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來(lái)心力衰竭在我國(guó)發(fā)病率日益增高,已嚴(yán)重威脅人類的生命健康。目前抗心力衰竭的藥物很多,但該病仍不能被治愈,患者生活質(zhì)量和壽命未有顯著提升,國(guó)家醫(yī)療支出不斷增加,給患者家庭和社會(huì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)及經(jīng)濟(jì)壓力[9]。為此,尋找新的治療藥物尤為重要。在中藥辨證論治中,蔣梅先[10]將心力衰竭分期論治,分為兩期:慢性穩(wěn)定期、急性加重期。前者主要是氣虛血瘀、氣陰虧虛、心腎陽(yáng)虛,宜益氣養(yǎng)陰、益氣通絡(luò)、溫補(bǔ)心陽(yáng)。后者多陽(yáng)虛水泛、心血瘀滯、痰濁壅肺,宜溫陽(yáng)利水、活血散瘀、化痰降氣宣肺;黃芩苷為黃酮類化合物,主要從黃芩苷中提取而來(lái),其在糖尿病、冠心病、高血壓以及并發(fā)病中應(yīng)用廣泛,且有抗氧化、抗炎癥、抑制細(xì)胞凋亡的功能,不僅可抑制心梗,還能在缺血再灌注治療中保護(hù)心肌細(xì)胞,此外黃芩苷還可以抑制LPS和病毒性心肌炎誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡[11]。李萌芳等[12]研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷通過(guò)調(diào)控STIM1-SOCE鈣超載減輕LPS引起的心肌細(xì)胞凋亡。劉宇等[13]研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷可減輕慢性心肌衰竭大鼠心肌損傷,其作用機(jī)制可能與上調(diào)蛋白激酶B(Akt)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。Xue等[14]研究證實(shí),黃芩苷通過(guò)芳烴受體抑制炎癥并減輕心肌缺血損傷。提示黃芩苷對(duì)心肌細(xì)胞有廣泛的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平升高,24、48 h細(xì)胞活力降低,提示LPS誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功,且LPS可以降低細(xì)胞的活力。與LPS組相比,LPS+10、20和40 μmol/L黃芩苷組IL-6、IL-1β與TNF-α含量降低,24 h LPS+10 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞活力升高,說(shuō)明了10 μmol/L黃芩苷可以抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥,提高細(xì)胞的活力。因此,選擇干預(yù)24 h的濃度較低的10 μmol/L黃芩苷進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖受到抑制,細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo)增加,加入10 μmol/L黃芩苷處理后,顯著逆轉(zhuǎn)了這些指標(biāo)的變化,證明了黃芩苷可以促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的增殖,抑制其凋亡,有良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。Cyclin D1是細(xì)胞增殖過(guò)程中標(biāo)志蛋白,作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK)和CDK6的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的作用來(lái)調(diào)節(jié)從G1期到S期的轉(zhuǎn)變,Cyclin D1的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。細(xì)胞凋亡是一種多種因素誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的生物學(xué)過(guò)程,Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子,活化后切割多種底物,調(diào)節(jié)有絲分裂后神經(jīng)元(PMN)和神經(jīng)前體細(xì)胞(NPC)中的程序性細(xì)胞死亡(PCD),在細(xì)胞凋亡中起重要作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞Cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低,Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高,加入10 μmol/L黃芩苷處理后,顯著逆轉(zhuǎn)了Cyclin D1和Caspase-3的表達(dá),提示黃芩苷可能是通過(guò)上調(diào)Cyclin D1表達(dá)和下調(diào)Caspase-3表達(dá)來(lái)促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的增殖,抑制其凋亡,研究結(jié)果與Xue等[14]研究相一致。

JAK2/STAT3信號(hào)通路是廣泛參與細(xì)胞分化、炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)的重要通路。研究證實(shí),JAK2/STAT3信號(hào)通路在心肌細(xì)胞的多種損傷中起關(guān)鍵作用,抑制該通路能明顯降低脂質(zhì)化過(guò)氧化產(chǎn)物的生成,進(jìn)而降低細(xì)胞凋亡,減輕心肌細(xì)胞損傷[17]。Das等[18]研究發(fā)現(xiàn),雷帕毒素可通過(guò)調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。Hattori等[19]發(fā)現(xiàn)缺血處理可激活JAK2/STAT3信號(hào)通路,明顯增加p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2表達(dá),減少Bax和Caspase-3表達(dá),從而減少心肌細(xì)胞凋亡,改善心臟缺血后收縮功能。另有研究發(fā)現(xiàn),感染性休克時(shí)會(huì)釋放促炎細(xì)胞因子,并通過(guò)JAK/STAT3通路損害心臟功能,環(huán)磷酸腺苷交換蛋白1(Epac1)過(guò)表達(dá)可抑制JAK/STAT3通路,減輕心肌細(xì)胞損傷[20]。以上研究證明了JAK2/STAT3信號(hào)通路與心肌細(xì)胞的損傷密切相關(guān)。此外,有研究表明,黃芩苷可通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo),減少炎癥因子的釋放,減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎[21]。但目前黃芩苷通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)心肌損傷的影響鮮有報(bào)道。因此,本研究分析了黃芩苷對(duì)JAK2/STAT3通路的影響,發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)升高,加入10 μmol/L黃芩苷處理后,p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)降低,提示了黃芩苷可能抑制了JAK2/STAT3通路活化狀態(tài)。所以在LPS+10 μmol/L黃芩苷組中加入JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490和激活劑colivelin進(jìn)行JAK2/STAT3通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與LPS+10 μmol/L黃芩苷組相比,AG490增強(qiáng)了黃芩苷對(duì)細(xì)胞增殖、Cyclin D1表達(dá)水平的升高,細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)的降低,colivelin則削弱了這些變化,以上結(jié)果均說(shuō)明黃芩苷可能通過(guò)下調(diào)p-JAK2、p-STAT3、Caspase-3蛋白表達(dá)水平,上調(diào)Cyclin D1蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這些研究結(jié)果與Jin等[20]和Sun等[21]結(jié)果相符。

4 結(jié)論

黃芩苷可抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化并上調(diào)Cyclin D1和下調(diào)Caspase-3表達(dá)促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌H9C2細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,并緩解其炎癥。本研究從細(xì)胞功能方面揭示了黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中的作用,表明了黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌損傷的治療有一定積極效果,并且補(bǔ)充了黃芩苷作用LPS誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞的一個(gè)新的作用機(jī)制,但是否存在其他機(jī)制參與心肌細(xì)胞的生物學(xué)行為有待進(jìn)一步研究。