紅花清肝十三味丸通過激活HNF4α改善肝功能的保肝機制研究

肖海軍，卞康坤，包 旭，包玉龍，王 利

（1.內蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，內蒙古 呼和浩特 010000；2.內蒙古烏蘭察布市中心醫(yī)院檢驗醫(yī)學科，內蒙古 烏蘭察布 012000）

肝損傷是一種臨床常見疾?。?］，是指由藥物濫用、 病毒感染和大量飲酒引起的肝細胞壞死、凋亡、脂肪變性、炎癥反應以及肝功能損害的嚴重疾?。?-3］。 持續(xù)或反復肝損傷可引起肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌［4-5］。 目前，一些肝保護劑已應用于臨床實踐，但很大一部分存在潛在的不良反應［6］，因此， 開發(fā)及篩選安全有效的肝損傷治療藥物具有重要的臨床意義。

肝細胞核因子4α （hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）在肝臟的正常發(fā)育及功能維持中起重要作用。 疾病狀態(tài)下，肝臟中HNF4α 的表達水平和活性會發(fā)生改變［7］。 肝臟特異性基因的表達受HNF4α 的調控，進而影響肝細胞的功能［8］。HNF4α能夠調控肝細胞功能相關基因群的表達， 并參與蛋白質的合成以及脂肪酸和膽汁酸的代謝等重要生理生化過程［9］。 開發(fā)能夠有效增強HNF4α 表達和活性的靶向藥物， 對于肝臟疾病的治療具有重要的臨床價值。

紅花清肝十三味丸（以下簡稱HHQG）為國家藥品標準名稱，又名古日古木-13、古日古木·朱蘇木［10］。 HHQG 先后被收入《內蒙古蒙成藥標準》和《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·蒙藥分冊》（1998 版），后者記載的功能與主治為：清肝熱，除“亞瑪”病，解毒。 該方劑的處方為：紅花60 g，丁香30 g，蓮子30 g，麥冬60 g，木香30 g，訶子30 g，川楝子30 g，梔子30 g，紫檀香30 g，人工麝香0.5 g，水牛角濃縮粉30 g，人工牛黃30 g，銀朱30 g［11］。HHQG 是目前臨床應用較多的傳統保肝蒙藥方劑，主要用于治療肝炎和肝功能衰竭［10］，對乙型肝炎［12-13］、中毒性肝炎［14］、酒精性和非酒精性脂肪肝［15-17］，以及蒙醫(yī)赫依盛型肝病、熱盛型肝?。?8］具有顯著的療效。 然而，關于HHQG 治療急性肝損傷方面的研究仍然匱乏。 本研究旨在通過建立四氯化碳 （CCl4） 誘導的小鼠肝損傷模型， 研究HHQG 對肝損傷的保護作用， 并初步探究其作用機制，以期為該藥物的臨床合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物

6～8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠45 只， 體重為（22±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司， 動物生產合格證號： 北京百善SCXK （京）2021-0006。 飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22 ℃， 相對濕度為60%，光照12 h/黑暗12 h 交替，自由攝食、飲水。試驗開始前預飼養(yǎng)1 周。

1.1.2 藥物與試劑

HHQG 購自內蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院。 谷丙轉氨酶（ALT）（批號：C009-2-1）、谷草轉氨酶（AST）（批號：C010-2-1）、總超氧化物歧化酶（SOD）（批號：A001-1-2）活力測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 HHQG 灌胃液：稱取0.616 5 g HHQG，用10 mL 無菌蒸餾水溶解，用前搖勻。肝損傷造模液： 將CCl4與橄欖油按1∶4 的比例（V/V） 混勻。HNF4α 抗體（批號：ab181604）購自英國Abcam 公司；即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP 試劑盒（批號：KIT-9921）、DAB 顯色試劑盒（批號：DAB-0031）購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.1.3 儀器設備

全自動輪轉式切片機（型號：RM2255）、石蠟包埋機（型號：Arcadia）、烤片機（型號：HI1220）、展片機（型號：HI1210）、正置顯微鏡（型號：DM6B），均為德國Leica 公司產品；全自動數字切片掃描系統（型號：PRECICE 500），北京優(yōu)納科技有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 分組及給藥

將45 只C57BL/6J 小鼠隨機分為對照組、CCl4損傷組、HHQG 組，每組15 只。HHQG 組灌胃劑量為0.616 5 g/（kg·BW）的HHQG，每天1 次，持續(xù)7 d，對照組和CCl4損傷組灌胃等體積的無菌蒸餾水。

1.2.2 肝損傷模型的建立

末次灌胃4 h 后， 對照組小鼠腹腔注射劑量為5 mL/（kg·BW）的橄欖油，CCl4損傷組和HHQG組小鼠腹腔注射相同劑量的CCl4與橄欖油混合液進行肝損傷造模。 小鼠腹腔注射前24 h 禁食不禁水。分別在造模后第2、5、7 天，每組選取5 只小鼠，處死后收集血液及肝臟組織樣本。 將血液樣本以3 500 r/min 離心10 min，取上清液，用于后續(xù)試驗。

1.2.3 體重監(jiān)測

從造模后第0 天開始至第7 天，每天8：00 對各組小鼠進行稱重，記錄體重數據。

1.2.4 肝功能及抗氧化應激指標的檢測

嚴格按照試劑盒說明書檢測血清ALT、AST、SOD 活力。

1.2.5 肝臟組織形態(tài)學觀察

取小鼠肝臟大葉組織1/3， 于4%組織固定液中固定，經組織脫水、透蠟、包埋、切片、脫脂、脫蠟后，分別進行HE 染色和Masson 染色，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織的結構變化。

1.2.6 免疫組織化學技術分析肝臟組織中HNF4α 蛋白的表達情況

石蠟切片用3%山羊血清在室溫下封閉30 min，一抗（HNF4α，1∶200）4 ℃過夜孵育；切片用PBS 溶液洗滌后，辣根過氧化物酶（HRP）-聚合物抗小鼠/兔二抗室溫孵育50 min；切片在PBS 溶液中浸泡5 min，DAB 染色，蘇木精復染；切片在1%鹽酸乙醇分化液中浸泡3 s，自來水沖洗后拍照并保存。

1.2.7 轉錄組測序（RNA-seq）分析

分別提取各組小鼠造模后第2 天相同部位的肝葉組織（每組獨立3 次重復樣本）的總RNA，用于創(chuàng)建RNA 文庫并進行RNA 測序。 基于至少2次具有相同趨勢的成對比較， 運用DESeq2 軟件包， 基于統計學分析方法， 篩選出表達變化高于1.5 倍的基因（P＜0.01），即差異表達基因，用于后續(xù)研究分析。 RNA-seq 分析委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 統計學分析

試驗數據用“平均值±標準差”的形式表示，采用Student′s t 檢驗（SPSS 13.0 統計學軟件）進行差異顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 HHQG 對肝損傷小鼠體重的影響

由表1 可知，與對照組相比，在肝損傷造模后第1～4 天以及第6～7 天，CCl4損傷組小鼠體重顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01 或P<0.001）降低；與CCl4損傷組相比， 在肝損傷造模后第4 天以及第6～7 天，HHQG 組小鼠體重顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）增加。

表1 肝損傷造模后不同時間各組小鼠體重測定結果（n=3） 單位：g

2.2 HHQG 對肝損傷小鼠肝功能指標的影響

由表2 和表3 可知，與對照組相比，在肝損傷造模后第2 天，CCl4損傷組小鼠血清ALT 和AST活力極顯著（P<0.001）升高；與CCl4損傷組相比，在肝損傷造模后第2 天，HHQG 組小鼠血清ALT和AST 活力顯著（P<0.05）降低；在肝損傷造模后第5、7 天，各組小鼠血清ALT 和AST 活力無顯著（P>0.05）差異。

表2 肝損傷造模后不同時間各組小鼠血清ALT 活力檢測結果（n=3） 單位：U/L

表3 肝損傷造模后不同時間各組小鼠血清AST 活力檢測結果（n=3） 單位：U/L

2.3 HHQG 對肝損傷小鼠抗氧化應激指標的影響

由表4 可知，與對照組相比，在肝損傷造模后第2 天，CCl4損傷組小鼠血清SOD 活力顯著 （P<0.05）降低；與CCl4損傷組相比，在肝損傷造模后第2 天，HHQG 組小鼠血清SOD 活力顯著 （P<0.05）升高；在肝損傷造模后第5、7 天，各組小鼠血清SOD 活力無顯著（P>0.05）差異。

表4 肝損傷造模后不同時間各組小鼠血清SOD 活力檢測結果（n=3） 單位：U/L

2.4 HHQG 對肝損傷小鼠肝臟組織形態(tài)學的影響

HE 染色顯示（見圖1），對照組小鼠的肝小葉結構完整，肝實質細胞輪廓清晰，細胞核為藍色，細胞質為紅色，核質分布均勻，肝細胞排列整齊。在肝損傷造模后第2 天，CCl4損傷組的肝門靜脈周圍形成大面積彌漫性變性壞死， 邊緣的肝細胞排列混亂，多數呈水腫狀態(tài)，并有膠原纖維物質沉積，可見部分炎性細胞浸潤；此時，HHQG 組的肝損傷及壞死面積明顯減小， 并且膠原纖維物質沉積也明顯減少。在肝損傷造模后第5 天，雖然CCl4損傷組的肝臟損傷壞死面積比第2 天減小， 但是損傷區(qū)域仍可見大量炎性細胞浸潤；此時，HHQG組的肝損傷面積更小， 并且炎性細胞浸潤和膠原纖維物質沉積也受到了明顯抑制。 在肝損傷造模后第7 天，CCl4損傷組的損傷區(qū)域通過肝細胞增殖進行組織修復， 大部分沉積的膠原纖維物質被降解，在損傷修復后，炎性細胞浸潤減少，炎癥開始消退； 此時，HHQG 組的肝損傷修復基本完成，無炎癥反應。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理學變化HE 染色觀察結果（200×）

Masson 染色顯示（見圖2），與對照組相比，在肝損傷造模后第2 天，CCl4損傷組小鼠肝臟的大面積彌漫性壞死區(qū)域有大量膠原纖維物質沉積；在肝損傷造模后第5 天，損傷雖然有所減輕，但是膠原纖維物質沉積明顯增加， 并且在損傷區(qū)域周圍出現大量炎性細胞浸潤； 在肝損傷造模后第7天，膠原纖維物質逐漸降解，大部分壞死區(qū)域已被修復， 但門管區(qū)與中央靜脈周圍仍有部分膠原纖維物質沉積和炎性細胞浸潤。相比之下，HHQG 組小鼠肝臟膠原纖維物質的沉積得到明顯改善，并且炎性細胞浸潤被抑制， 肝臟組織的損傷狀況明顯減輕。

圖2 各組小鼠肝臟組織病理學變化Masson 染色觀察結果（200×）

2.5 肝臟組織差異基因KEGG 信號通路富集分析

如圖3 所示， 與CCl4損傷組相比，HHQG 組上調的前20 個信號通路分別為：過氧化物酶體增殖物激活受體，脂肪酸降解，脂肪酸代謝，丁酸鹽代謝，脂肪消化和吸收，過氧化物酶體，α-亞麻酸代謝，碳代謝，丙酸鹽代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解， 果糖和甘露糖代謝，β-丙氨酸代謝，不飽和脂肪酸生物合成，酮體合成與降解，賴氨酸降解，晝夜節(jié)律，胰島素抵抗，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，晝夜節(jié)律誘導，成年發(fā)病型糖尿病。此外，與CCl4損傷組相比，HHQG 組下調的前20 個信號通路分別為：核糖體、甘油磷脂代謝、甲狀腺癌、癌癥中的異常轉錄調控、p53 信號通路、 膠質瘤、脂肪細胞因子信號通路、甘露糖型O-聚糖生物合成、小細胞肺癌、收集導管酸分泌、腎細胞癌、突觸囊泡周期、非小細胞肺癌、甲狀腺激素信號通路、SNARE 在膀胱運輸中的相互作用、 非洲錐蟲病、亞油酸、晝夜節(jié)律、慢性髓性白血病、FoxO 信號通路。 KEGG 信號通路富集分析結果進一步表明，HHQG 能夠促進肝臟功能的恢復。

圖3 HHQG 組與CCl4 損傷組肝臟組織差異基因KEGG 信號通路富集分析

2.6 HHQG 對肝損傷小鼠肝臟功能相關基因表達的影響

如圖4 所示， 與CCl4損傷組相比，HHQG 組小鼠肝臟組織中與肝細胞分化相關的基因群顯著上調， 包括HNF4α、ATF5、Cebpb、Rxra、Tsc22d3、Jun、Nr1i2、Nr2f6、Rela、Stat5b、Nfix、Nr5a2、Gpbp1l1、Foxo3、Nr4a1、Irf6、Foxo4、Foxp4、Zscan26、Rora、Elk4、Tsc22d2、Foxo1、Foxn3、Nfib、Tsc22d1、Fosl2、Crem、Myrf、Jdp2、Zkscan1、Nfia、Nfat5、Smad9、Fosb、Nr6a1、Nr4a2、Nr4a3。

圖4 HHQG 促進肝損傷小鼠肝細胞分化的相關基因群分析

2.7 HHQG 對肝損傷小鼠肝臟組織HNF4α 蛋白表達的影響

免疫組織化學分析表明 （見圖5），HNF4α 在正常肝細胞的細胞核中均勻表達； 在肝損傷造模后第2 天，與對照組相比，CCl4損傷組肝損傷區(qū)域周邊快速增殖的肝細胞中HNF4α 不表達，而HHQG 組的HNF4α 表達量有所增加；在肝損傷造模后第5 天，CCl4損傷組可見HNF4α 表達量增加，HHQG 組的HNF4α 表達增加更明顯； 在肝損傷造模后第7 天，CCl4損傷組和HHQG 組的HNF4α 表達基本恢復正常。以上結果提示，HHQG可以使增殖后的肝細胞迅速表達HNF4α，促進肝細胞分化，維持肝細胞的功能，從而減輕肝損傷。

圖5 免疫組織化學技術分析肝損傷小鼠肝細胞中HNF4α 的表達情況（400×）

3 討論

肝臟是人類和動物體內最大而且是最重要的腺體，是由肝實質細胞、肝竇細胞、肝竇周細胞組成的復雜的關鍵器官。 在肝損傷的預防和治療方面， 民族醫(yī)藥復方因具有多靶點效應而顯示出獨特的優(yōu)勢。 蒙藥傳統保肝良方HHQG 對肝熱病的治療有著非常顯著的功效，在臨床中使用廣泛，但其作用機制尚不明確。 深入研究蒙藥方劑HHQG在肝損傷中的保護和促修復機制， 可為肝病的預防和治療開辟一個新的途徑。 CCl4誘導的動物肝臟病理損傷與人類肝病的癥狀具有相似性［19］，所以CCl4誘導的肝損傷、肝纖維化和肝硬化模型是評估藥物保肝活性的經典模型［20］。 本研究發(fā)現，CCl4損傷后小鼠血清中ALT 和AST 活力在損傷早期迅速顯著升高，SOD 活力顯著降低；病理組織切片觀察可見，CCl4損傷組小鼠肝小葉結構紊亂，中央靜脈周圍和小葉周圍帶可見多處壞死灶，多數肝細胞腫脹呈氣球樣變， 伴有混合性炎性細胞浸潤；以上結果表明小鼠肝損傷模型構建成功。在肝損傷早期，HHQG 組小鼠血清中ALT 和AST 活力顯著下降，SOD 活力顯著升高， 并且HHQG 能抑制CCl4引起的肝臟病理學改變，這一結果與文獻報道的結果一致［21］，表明HHQG 可以明顯改善CCl4誘導的肝損傷。

已有研究表明，HHQG 可通過提高抗氧化能力， 抑制JNK/c-Jun 信號通路與FasL/Fas 死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑，減少肝細胞凋亡，從 而 發(fā) 揮 保 肝 作 用［22］。 HHQG 也 可 通 過 平 衡MMP-1 和TIMP-1 細胞因子， 抑制脂質過氧化和調節(jié)肝纖維化發(fā)揮保肝作用［23］。 前期研究顯示，HHQG 對CCl4誘導的小鼠慢性肝損傷的保護作用可能與HHQG 增加肝再生增強因子， 抑制JNK信號通路激活有關［24］。 本研究RNA-seq 分析結果顯示，HHQG 組小鼠肝臟組織上調的基因富集于促進代謝以及細胞抗氧化等途徑， 這表明HHQG可以通過恢復肝臟代謝能力， 維持肝臟功能來改善CCl4誘導的肝損傷。

HNF4α 是肝臟特異性表達基因的主要調節(jié)因子，可促進肝細胞分化［25］，與肝臟代謝及肝功能維持密切相關［26］。 HNF4α 能夠在轉錄水平調控相關基因的表達， 有研究表明， 在小鼠中敲除HNF4α 基 因 后，PAH、EPO、APOA Ⅰ、APOA Ⅱ、APOB、APOCⅡ、APOCⅢ等與成熟肝細胞功能相關的基因不表達［27］。對肝細胞特異性HNF4α基因敲除的成年小鼠的研究結果表明，HNF4α 可以調節(jié)藥物代謝關鍵基因的表達，發(fā)揮維持細胞黏附、穩(wěn)定細胞增殖、抗凋亡的作用［28-29］。HNF4α 處于調控網絡中心的上游， 與多種靶基因的啟動子相互作用以調控與肝細胞功能相關的基因表達， 并參與膽汁酸代謝、蛋白質合成等過程，是肝細胞分化和功能維持的關鍵轉錄因子［9］。 本研究通過免疫組織化學技術分析發(fā)現，HHQG 可以明顯增加肝損傷小鼠肝臟組織中HNF4α 蛋白的表達， 同時，RNA-seq 分析結果也顯示， 與CCl4損傷組相比，HHQG 組小鼠肝臟組織中HNF4α基因表達水平顯著上調， 提示HNF4α 是HHQG 發(fā)揮保肝作用的靶點之一。

4 結論

HHQG 通過激活HNF4α， 抑制肝臟氧化損傷、促進肝臟組織修復以及維持肝臟功能，改善小鼠肝損傷，從而發(fā)揮保肝效應。