新疆維吾爾自治區(qū)阿拉爾市某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)豬乳源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及其毒力、耐藥性分析

陳俊凱，于月通，楊 彬，王澤坤，李 靜，陀海欣，徐俊飛，齊 萌

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見(jiàn)的人獸共患革蘭陽(yáng)性菌， 可引起人和動(dòng)物的胃腸道疾病、創(chuàng)傷和血液感染，造成化膿灶、腹膜炎和菌血癥等病癥［1-2］。 治療由金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病通常采用抗菌藥物療法，不科學(xué)、不合理甚至濫用抗菌藥物導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，呈現(xiàn)多重耐藥性。 此外，生物被膜的形成使得細(xì)菌對(duì)抗菌藥物和宿主免疫系統(tǒng)的防御更具有耐受性，有助于菌株在環(huán)境或者宿主中持續(xù)存在［3］。 金黃色葡萄球菌對(duì)不同宿主表現(xiàn)出不同致病性。 金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一。 由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺感染持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，不僅導(dǎo)致奶牛淘汰率上升，還可能對(duì)牛奶品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響，引發(fā)食物中毒， 從而對(duì)食品衛(wèi)生安全和人類健康構(gòu)成潛在威脅［4］。 豬感染金黃色葡萄球菌后，常表現(xiàn)出流涕、氣喘、皮膚發(fā)炎等癥狀，其在豬和人類之間傳播所造成的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題已引起人們的關(guān)注［5］。 目前，我國(guó)豬乳源金黃色葡萄球菌的相關(guān)報(bào)道較少。 本研究對(duì)從新疆維吾爾自治區(qū)阿拉爾市某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)分離到的豬乳源金黃色葡萄球菌進(jìn)行生物被膜形成能力檢測(cè)，并對(duì)其致病性及耐藥性進(jìn)行分析， 以期為豬乳源金黃色葡萄球菌的病原生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本來(lái)源

2022 年10 月， 在新疆維吾爾自治區(qū)阿拉爾市某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)選取外觀健康的哺乳母豬，使用碘酊和75%酒精對(duì)其乳房進(jìn)行消毒后， 用一次性塑料手套擠出乳液，收集至50 mL 的無(wú)菌離心管內(nèi)。 共收集6 份新鮮豬乳樣本，標(biāo)記信息后置4 ℃冷藏箱，送至實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保存。

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923 和具有強(qiáng)生物被膜形成能力的表皮葡萄球菌ATCC 35984，由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

胰蛋白胨大豆液體 （TSB） 培養(yǎng)基、Mueller-Hinton（MH）肉湯培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂（MSA）培養(yǎng)基，奧博星生物技術(shù)（北京）有限責(zé)任公司產(chǎn)品；PCR 擴(kuò)增引物、DL 2 000 DNA Marker、2×Easy Taq PCR Super Mix（+dye）、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，全式金生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品；藥敏片均購(gòu)自溫州市泰康生物科技有限公司； 革蘭染色試劑，實(shí)驗(yàn)室自行配制；PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀購(gòu)自Bio-Rad 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳樣處理

取2 mL 乳樣在12 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心2 min后，吸取10 μL 下層乳液，加入5 mL TSB 培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫振蕩搖床中過(guò)夜培養(yǎng)增菌。

1.2.2 細(xì)菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定

將富集好的菌液劃線接種到MSA 培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后， 觀察菌落形態(tài)，挑取單一菌落劃線接種于MSA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)， 純化完成后挑選形態(tài)良好的單菌落進(jìn)行革蘭染色，用普通光學(xué)顯微鏡觀察染色特征，初步鑒定細(xì)菌種類。

1.2.3 細(xì)菌生化鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察后，參考吳自豪等［6］報(bào)道的方法對(duì)疑似金黃色葡萄球菌的菌株進(jìn)行觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)和甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)。以金黃色葡萄球菌ATCC 25923 為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌雙蒸水為空白對(duì)照。

1.2.4 細(xì)菌基因組DNA 提取和16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增

對(duì)經(jīng)表型鑒定初步判定為金黃色葡萄球菌的分離菌株，按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA 提取。 參照劉肖利等［7］報(bào)道的引物序列， 設(shè)計(jì)合成細(xì)菌16S rDNA 通用引物，以分離菌株的基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）12.5 μL， 上、 下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，DNA 模板1 μL，陰性對(duì)照為ddH2O。 PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。 將陽(yáng)性產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序， 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)分析后鑒定分離細(xì)菌的種類。

1.2.5 金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力檢測(cè)

分別以表皮葡萄球菌ATCC 35984 和雙蒸水為陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，參考Ren 等［8］報(bào)道的方法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行生物被膜形成能力檢測(cè)與判定。 生物被膜形成能力分為4 個(gè)等級(jí)：強(qiáng)（+++；OD570nm值>0.39）、中等（++；0.39>OD570nm值>0.26）、弱（+；0.26>OD570nm值>0.13）和陰性（-；OD570nm值<0.13）。

1.2.6 金黃色葡萄球菌藥物敏感性試驗(yàn)

采用K-B 紙片擴(kuò)散法檢測(cè)10 類12 種抗菌藥物對(duì)分離菌株的敏感性， 包括β-內(nèi)酰胺類：青霉素、頭孢西?。宦让顾仡悾郝让顾?；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、替米考星；利福霉素類：利福平；四環(huán)素類：四環(huán)素；氟喹諾酮類：環(huán)丙沙星；林可酰胺類：克林霉素；酰胺醇類：氟苯尼考；氨基糖苷類：慶大霉素；磺胺類：磺胺甲噁唑。 以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923 為質(zhì)控菌株。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南（CLSI，2021）發(fā)布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)操作和結(jié)果判定。

1.2.7 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測(cè)

參照文獻(xiàn)［9-10］報(bào)道的引物序列，設(shè)計(jì)5 種耐藥基因引物，采用PCR 法檢測(cè)金黃色葡萄球菌分離株的耐藥基因攜帶情況，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 檢測(cè)的耐藥基因包括慶大霉素耐藥基因ant（4）、紅霉素耐藥基因ermA、頭孢西丁耐藥基因mecA、 利奈唑胺耐藥基因optrA和克林霉素耐藥基因ermS。耐藥基因PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系同“1.2.4”項(xiàng)下；PCR 擴(kuò)增程序均為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。 PCR 擴(kuò)增結(jié)束后， 采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，使用凝膠成像儀拍照。

1.2.8 金黃色葡萄球菌毒力基因檢測(cè)

參照文獻(xiàn)［11-14］報(bào)道的引物序列，設(shè)計(jì)20種毒力基因引物，采用PCR 法檢測(cè)金黃色葡萄球菌分離株的毒力基因攜帶情況， 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 毒力基因包括編碼葡萄 球 菌 腸 毒 素 的 基 因sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei 和sej，毒性休克綜合征毒素基因tsst-1，剝脫毒素基因eta 和etb，Panton-Valentine 殺白細(xì)胞素基因lukF，溶血素基因hla 和hlb，纖連蛋白結(jié)合蛋白基因fnbA 和fnbB， 凝聚因子基因clfA 和clfB， 以及膠原蛋白黏附素基因cna。 毒力基因PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序同“1.2.8”項(xiàng)下。 PCR 擴(kuò)增結(jié)束后， 采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，使用凝膠成像儀拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察和生化鑒定結(jié)果

在6 份豬乳樣本中， 有2 份樣本經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)后在MSA 培養(yǎng)基中出現(xiàn)圓形、 大小一致、淺黃色或者米黃色的菌落（見(jiàn)圖1）；分別挑取2 份樣本獲得的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢， 鏡下觀察到了革蘭陽(yáng)性球菌，呈單個(gè)、短鏈或葡萄串狀排列（見(jiàn)圖2）。 生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，2 株分離菌的觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)和甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)均為陽(yáng)性。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生化鑒定結(jié)果，2 株分離菌初步鑒定為金黃色葡萄球菌。

圖1 分離菌株在MSA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 分離菌株的革蘭染色鏡檢結(jié)果（1 000×）

2.2 分離菌株的16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增、測(cè)序及比對(duì)

基于細(xì)菌16S rDNA 序列，對(duì)2 株疑似金黃色葡萄球菌基因組DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 經(jīng)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，2 株分離菌的16S rDNA 序列均與埃及人源金黃色葡萄球菌 （GenBank 登錄號(hào)：OP809639） 分離株的16S rDNA 序列同源性為100%。 結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果、 生化鑒定結(jié)果和16S rDNA 序列分析結(jié)果，將分離到的2 株細(xì)菌判定為金黃色葡萄球菌， 分離率為33.33%（2/6），分別命名為No.1 菌株和No.2 菌株（見(jiàn)圖3）。

圖3 分離菌株的16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的藥物敏感性試驗(yàn)

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在12 種抗菌藥物中， 分離到的2 株金黃色葡萄球菌均對(duì)利福平敏感，均對(duì)青霉素、頭孢西丁、四環(huán)素、紅霉素、替米考星、克林霉素和磺胺甲噁唑耐藥，對(duì)慶大霉素、氟苯尼考、氯霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率為50%（見(jiàn)表1）。 2 株分離菌均對(duì)3 類以上抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，因此，為多重耐藥菌。

表1 2 株豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的生物被膜形成能力測(cè)定

根據(jù)結(jié)晶紫半定量測(cè)定結(jié)果，2 株分離菌的OD570nm值>0.800，由“1.2.5”項(xiàng)下生物被膜形成能力的判定標(biāo)準(zhǔn)可知，2 株金黃色葡萄球菌均有形成生物被膜的能力。

2.5 豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的耐藥基因檢測(cè)

在檢測(cè)的5 種耐藥基因中，2 株金黃色葡萄球菌分離株均攜帶ant（4）基因和mecA 基因（見(jiàn)圖4），未檢測(cè)出ermA、ermS、optrA 基因。

圖4 豬乳源金黃色葡萄球菌部分耐藥基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.6 豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的毒力基因檢測(cè)

在檢測(cè)的20 種毒力基因中，2 株金黃色葡萄球菌分離株均攜帶seg、sei、hlb、fnbA、clfA 基因；No.1菌株還攜帶hla 基因， 而No.2 菌株不攜帶hla 基因（見(jiàn)圖5）；2 株菌均未檢測(cè)出sea、seb、sec、sed、see、seh、sej、tsst-1、eta、etb、lukF、fnbB、clfB、cna 基因。

圖5 豬乳源金黃色葡萄球菌部分毒力基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

金黃色葡萄球菌主要引起豬的乳腺炎、 關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)口感染， 近年來(lái)有關(guān)豬源金黃色葡萄球菌分離鑒定和耐藥情況的報(bào)道不斷增多。 在印度，Zehra 等［15］分離得到27 株豬肉源金黃色葡萄球菌，分離率為20.61%（27/131），對(duì)8 種藥物呈現(xiàn)耐藥，表現(xiàn)出多重耐藥性。 在我國(guó)，蔣松宏等［16］自重慶市某養(yǎng)殖場(chǎng)的106 份豬鼻拭子樣本中分離得到7 株耐大觀霉素金黃色葡萄球菌，分離率為6.60%（7/106），對(duì)4 種藥物呈現(xiàn)耐藥，攜帶7 種耐藥基因，表現(xiàn)出多重耐藥性。 Zhang 等［17］自廈門市分離得到130 株豬肉源金黃色葡萄球菌， 發(fā)現(xiàn)123 株攜帶1 個(gè)或多個(gè)葡萄球菌腸毒素基因，78 株攜帶毒力基因seb， 未發(fā)現(xiàn)毒力基因sed、sej、seo、sep、ser 和seu。 在波蘭，Banaszkiewicz 等［18］分離得到121 株野豬源金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)16 個(gè)分離株攜帶1 個(gè)或多個(gè)葡萄球菌腸毒素基因， 分別有2株、2 株、4 株和11 株攜帶毒力基因seb、sec、see和seh。 在希臘，Pexara 等［19］在屠宰豬扁桃體中分離得到26 株金黃色葡萄球菌， 發(fā)現(xiàn)21 株攜帶葡萄球菌腸毒素基因sea、seb、seg、seh、sei、sej 和中毒性休克綜合征毒素-1 基因（tst）。 該試驗(yàn)所獲2株豬乳源金黃色葡萄球菌均攜帶seg、sei、hlb、fnbA 與clfA 基因，其中1 株還攜帶hla 基因。 上述研究結(jié)果表明， 不同國(guó)家和地區(qū)以及豬源不同部位/組織中都能分離到的金黃色葡萄球菌，但菌株攜帶的毒力基因存在較大差異， 這與宿主生存環(huán)境、用藥情況和地理分布等因素密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)， 金黃色葡萄球菌多重耐藥情況越來(lái)越嚴(yán)重。 Xu 等［20］自湖北省分離得到230 株豬源金黃色葡萄球菌， 對(duì)其中127 株分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)復(fù)方新諾明、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素和苯唑西林的耐藥率分別為100.00%（127/127）、98.43%（125/127）、91.34%（116/127）、91.34%（116/127）、74.80%（95/127）、62.99%（80/127）、34.65%（44/127）和16.54%（21/127）。Zhang 等［21］自湖南省分離得到163 株豬源金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)對(duì)鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、青霉素、克林霉素、克林霉素、四環(huán)素、氨芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明耐藥率均大于63.19%（103/163）；163 株金黃色葡萄球菌均攜帶耐藥基因gyrA、aac（6）/aph（2）、tetk；還攜帶耐藥基因blaZ（96.93%，158/16）、tetM（93.87%，153/163）、LinE（88.96%，145/163）、ermA（82.82%，135/168）、sull （72.39%，118/163）、MsrA （17.18%，28/163）和mecA（4.29%，7/163）；Zheng 等［22］自我國(guó)東部地區(qū)分離得到63 株豬源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，對(duì)克林霉素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素以及利奈唑胺的耐藥率分別為95.24%（60/63）、76.19% （48/63）、49.21% （31/63）、3.17% （2/63） 和1.59%（1/63）。

本研究中2 株豬乳源金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素、頭孢西丁、四環(huán)素、紅霉素、替米考星、克林霉素以及磺胺甲噁唑耐藥率均為100%，均攜帶耐藥基因blaZ、ant（4）和mecA，具有多重耐藥性，與上述報(bào)道結(jié)果相一致，提示在臨床生產(chǎn)中，在對(duì)患病動(dòng)物進(jìn)行藥物治療時(shí)，應(yīng)合理用藥，避免致病菌產(chǎn)生更多的耐藥性。

4 結(jié)論

阿拉爾市某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)豬乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力強(qiáng)， 攜帶多種毒力基因和耐藥基因，表現(xiàn)為多重耐藥性。