紅花清肝十三味丸通過抑制炎性細(xì)胞浸潤改善小鼠肝損傷的研究

包 旭，卞康坤，肖海軍，王 利，包玉龍

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

紅花清肝十三味丸（以下簡稱HHQG）是經(jīng)典的蒙藥保肝良方， 以涼血益肝良藥紅花為主藥［1］，佐以梔子、丁香、川楝子、木香、麥冬、蓮子、訶子、紫檀香、人工麝香、水牛角濃縮粉、人工牛黃、銀朱［2］，被收錄于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》（1998 版）。HHQG 在臨床上已經(jīng)被廣泛用于治療各類肝炎、肝損傷以及肝衰竭［3］，但其作用途徑與機(jī)理尚不完全明確。

筆者所在課題組前期運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 （ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）技術(shù)對HHQG 醇提取物進(jìn)行了鑒定， 并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法對HHQG 在治療肝損傷中發(fā)揮的作用及潛在的靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測與探究； 結(jié)果顯示，從HHQG 醇提取物中分析鑒定出747 種化學(xué)成分，目前認(rèn)為可對肝損傷起作用的靶點(diǎn)有38 個， 這些在肝損傷治療中發(fā)揮潛在作用的化學(xué)成分，主要集中在抗炎、抗氧化、肝功能代謝等方面，提示HHQG可以通過抗炎作用達(dá)到保肝效果［4］。 本研究通過建立四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型，比較肝損傷模型組與HHQG 保肝組的肝臟功能及病理損傷情況，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR （RT-qPCR） 技術(shù)、 轉(zhuǎn)錄組測序分析（RNA-Seq） 方法對炎性細(xì)胞浸潤情況以及炎性因子和相關(guān)黏附分子表達(dá)情況進(jìn)行分析，進(jìn)一步研究HHQG 對肝損傷后中性粒細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤的影響， 以期為明晰HHQG 的抗炎保肝作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6～8 周齡雄性C57BL/6 小鼠54 只，體重20～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度（20±2）℃、相對濕度60%～70%、12 h光照/12 h 黑暗循環(huán)。

1.1.2 主要試劑

HHQG 購自內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院；CCl4購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 無水乙醇、二甲苯、異丙醇、橄欖油、氯仿、鹽酸購自天津市化學(xué)試劑研究所有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活力測定試劑盒購自南京建成科技有限公司；HE 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒及Mayer 蘇木素染色液購自北京索萊寶科技有限公司；FastKing 一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；PerfectStartRGreen qPCR SuperMix 購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司； 粉劑型PBS 磷酸鹽緩沖液、DAB 底物顯色試劑盒、 粉劑型檸檬酸修復(fù)液、即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP 試劑盒、中性樹膠購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；CD11b 抗 體、F4/80 抗 體、TNF-α 抗 體 購 自 美 國Abcam 公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

全自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、烤片機(jī)、展片機(jī)、正置顯微鏡購自德國Leica 公司；水平搖床購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司； 全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)購自杭州科洛碼光電科技有限公司；高溫高壓滅菌鍋、制冰機(jī)、-80 ℃超低溫冰箱、-20 ℃/-30 ℃醫(yī)用低溫冰箱購自日本Panasonic 公司； 實(shí)時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司；普通PCR 儀購自德國Analytikjena 公司； 微量移液器、 高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國Biotek 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將54 只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為對照組、 模型組和HHQG 保肝組，每組18 只。經(jīng)過7 d 的飼養(yǎng)適應(yīng)期后，HHQG 保肝組小鼠連續(xù)7 d 每天灌胃1 次HHQG， 劑量為0.616 5 g/（kg·BW）（筆者所在課題組前期試驗(yàn)確定的最適劑量）［5］， 對照組和模型組小鼠每天灌胃1 次等體積的生理鹽水。在第7 天灌胃4 h 后，對照組腹腔注射橄欖油，劑量為0.1 mL/（10g·BW），模型組和HHQG 保肝組均腹腔注射等劑量的CCl4橄欖油混合物（CCl4∶橄欖油=1∶4，V/V）［6］。分別在注射后第2、5、7 天每組選取3 只小鼠，處死后采血并取肝臟用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 血清AST 和ALT 活力測定

采集小鼠血液，室溫靜置后離心，分離血清。按照AST 和ALT 活力測定試劑盒說明書進(jìn)行操作并計(jì)算測定結(jié)果。

1.2.3 肝臟組織病理學(xué)HE 染色和膠原沉積Masson 染色

取小鼠相同部位的肝臟組織于4%多聚甲醛中固定24 h，再將沖洗好的組織脫水、浸蠟、包埋并制成厚度為4 μm 的切片。 按照HE 染色試劑盒及Masson 染色試劑盒說明書對制備好的肝臟組織切片進(jìn)行HE 染色和Masson 染色。

1.2.4 肝臟組織炎性細(xì)胞及TNF-α 免疫組織化學(xué)染色

取脫水浸蠟肝臟切片，脫蠟復(fù)水，檸檬酸微波熱激修復(fù)；將切片置于3%的H2O2溶液中室溫避光處理； 室溫下用3%山羊血清封閉； 加入一抗（CD11b 抗 體 按1∶200 比 例 稀 釋，F(xiàn)4/80 抗 體 按1∶200 比例稀釋，TNF-α 抗體按1∶200 比例稀釋），在4 ℃濕盒中過夜孵育； 二抗孵育；DAB 顯色劑顯色；Mayer 蘇木素染色液復(fù)染， 鹽酸乙醇分化液處理，脫水透明，中性樹膠封片，室溫保存。

1.2.5 RT-qPCR 檢測TNF-α基因及黏附分子基因mRNA 相對表達(dá)水平

提取小鼠肝臟組織總RNA， 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR 獲取cDNA。 根據(jù)PerfectStartRGreen qPCR SuperMix 試劑盒說明書推薦的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）。 以β-actin 為內(nèi)參基因， 通過比較閾值（2-ΔΔCT） 的方法計(jì)算TNF-α、VCAM-1、ICAM-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量。qPCR 所用引物信息如表1 所示。

表1 qPCR 所用引物信息

1.2.6 RNA-seq 分析

采集造模后第5 天小鼠的肝臟組織，分別提取各組小鼠相同部位肝葉組織（每組獨(dú)立3 次重復(fù)樣本） 的總RNA 用于創(chuàng)建RNA 文庫并進(jìn)行RNA 測序。 基于至少2 次具有相同趨勢的成對比較，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，篩選出表達(dá)變化高于1.5 倍的基因（P<0.01），即差異表達(dá)基因，用于后續(xù)研究分析。RNA-seq 分析委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 的形式表示， 使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清中AST 和ALT 活力檢測結(jié)果

由圖1 和圖2 可知，在CCl4誘導(dǎo)肝損傷后第2天，與對照組相比，模型組小鼠血清中AST 和ALT活力極顯著（P<0.01）升高；與模型組相比，HHQG保肝組小鼠血清中AST 和ALT 活力極顯著 （P<0.01）降低。在CCl4誘導(dǎo)肝損傷后第5 天和第7 天，模型組與對照組、HHQG 保肝組與模型組小鼠血清中AST 和ALT 活力均無顯著（P>0.05）差異。

圖1 小鼠血清AST 活力測定結(jié)果

圖2 小鼠血清ALT 活力測定結(jié)果

2.2 肝臟組織病理學(xué)HE 染色及膠原沉積Masson 染色觀察結(jié)果

2.2.1 肝臟組織病理學(xué)HE 染色觀察結(jié)果

HE 染色結(jié)果顯示（見圖3），對照組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞輪廓清晰，核質(zhì)分布均勻，肝細(xì)胞排列整齊。肝損傷后第2 天，模型組小鼠的肝門靜脈周圍形成大面積彌漫性變性壞死，邊緣的肝細(xì)胞排列混亂，多數(shù)呈水腫狀態(tài)，可見部分炎性細(xì)胞浸潤； 此時，HHQG 保肝組小鼠的肝臟損傷及壞死面積明顯減小。 肝損傷后第5 天，與模型組相比，HHQG 保肝組小鼠肝損傷區(qū)門靜脈炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。 肝損傷后第7 天，模型組小鼠的肝損傷區(qū)域通過肝細(xì)胞增殖進(jìn)行組織修復(fù)，炎性細(xì)胞浸潤減少，炎癥開始消退；此時，HHQG 保肝組小鼠的肝損傷修復(fù)基本完成，無炎癥反應(yīng)。

2.2.2 肝臟組織膠原沉積Masson 染色觀察結(jié)果

Masson 染色結(jié)果顯示（見圖4），肝損傷后第2天，與對照組相比，模型組小鼠肝臟組織大面積彌漫性壞死的區(qū)域有大量膠原纖維合成；肝損傷后第5 天，損傷區(qū)域周圍出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤的門靜脈與中央靜脈軸系存在大量膠原沉積；肝損傷后第7 天，膠原纖維物質(zhì)逐漸降解，大部分壞死區(qū)域已被修復(fù)，但門管區(qū)與中央靜脈周圍仍存在部分膠原纖維沉積和炎性細(xì)胞浸潤，相比之下，HHQG 保肝組小鼠肝臟組織的炎性細(xì)胞浸潤被抑制，膠原沉積改善，肝臟組織的損傷狀況明顯減輕。

2.3 肝臟組織炎性細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果

2.3.1 中性粒細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色觀察

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示（見圖5），與對照組相比，模型組小鼠自肝損傷后第2 天開始，損傷區(qū)域的門靜脈壁周圍出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤；此時，HHQG 保肝組小鼠的門靜脈周圍損傷區(qū)域中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少。 肝損傷后第5 天，模型組小鼠肝臟組織的受損區(qū)域可見部分中性粒細(xì)胞浸潤；此時，HHQG 保肝組小鼠的肝臟組織基本無中性粒細(xì)胞浸潤。 肝損傷后第7 天，模型組和HHQG 保肝組均無中性粒細(xì)胞浸潤。

圖5 肝臟組織中性粒細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色觀察（200×）

2.3.2 單核/巨噬細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色觀察

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示（見圖6），對照組小鼠肝臟中庫普弗細(xì)胞均勻地分布在血竇中。模型組小鼠自肝損傷后第2 天開始，損傷區(qū)域的門靜脈壁周圍逐漸出現(xiàn)單核/巨噬細(xì)胞浸潤； 此時，HHQG保肝組小鼠肝損傷區(qū)域門靜脈周圍幾乎沒有單核/巨噬細(xì)胞浸潤。 肝損傷后第5 天，模型組小鼠肝臟的受損區(qū)域可見大量的單核/巨噬細(xì)胞浸潤；此時，HHQG 保肝組小鼠的單核/巨噬細(xì)胞浸潤明顯減少，僅在門靜脈周圍損傷區(qū)域可見少量浸潤。 肝損傷后第7 天， 模型組小鼠肝臟組織單核/巨噬細(xì)胞浸潤逐漸消退，但門靜脈和中央靜脈周圍仍可見部分單核/巨噬細(xì)胞浸潤；此時，HHQG 保肝組小鼠的單核/巨噬細(xì)胞浸潤基本完全消退， 肝血竇中巨噬細(xì)胞分布均勻。

圖6 肝臟組織單核/巨噬細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色觀察（400×）

2.4 TNF-α 免疫組織化學(xué)染色觀察及TNF-α 基因mRNA 相對表達(dá)量檢測結(jié)果

2.4.1 TNF-α 免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示（見圖7），對照組小鼠肝臟組織中TNF-α 幾乎不表達(dá)； 與對照組相比，肝損傷后第2 天，模型組小鼠門靜脈壁周圍的損傷區(qū)域TNF-α 表達(dá)量迅速增加，而HHQG 保肝組小鼠相關(guān)區(qū)域TNF-α 的表達(dá)量明顯下降。 肝損傷后第5 天，模型組小鼠肝臟組織的受損區(qū)域仍有比較明顯的TNF-α 過表達(dá)；此時，HHQG 保肝組小鼠肝臟組織受損區(qū)域TNF-α 基本不表達(dá)。 肝損傷后第7 天， 模型組小鼠肝臟組織的受損區(qū)域TNFα 仍有少部分過表達(dá)， 而HHQG 保肝組小鼠肝臟組織的受損區(qū)域TNF-α 幾乎不表達(dá)。

圖7 肝臟組織TNF-α 免疫組織化學(xué)染色觀察（200×）

2.4.2 TNF-α基因mRNA 相對表達(dá)量檢測結(jié)果

由圖8 可知，在CCl4誘導(dǎo)肝損傷后的第2、5、7天，與對照組相比，模型組小鼠肝臟組織中TNF-α基因的mRNA 相對表達(dá)量極顯著（P<0.01）升高；與模型組相比， 肝損傷后第2、7 天以及第5 天，HHQG 保肝組的肝臟組織中TNF-α基因的mRNA相對表達(dá)量分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）降低。

圖8 肝臟組織中TNF-α 基因的mRNA 相對表達(dá)量測定結(jié)果

2.5 RNA-seq 分析HHQG 與黏附分子相關(guān)基因的表達(dá)

利用RNA-seq 技術(shù)分析了肝損傷后第5 天模型組和HHQG 保肝組與黏附分子相關(guān)的基因群。由圖9A 可知， 相較于模型組，HHQG 保肝組與黏附分子相關(guān)的基因群顯著下調(diào)， 相關(guān)基因包括Siglec1、H2-T24、H2-Q6、H2-DMb1、H2-Aa、Itgal、Sdc3、H2 -Ab1、Cd22、H2 -Eb1、Itga4、Selplg、H2 -DMa、Ptprc、Itgb7、Sell、Icam1、H2-T-ps、Vsir、Cd86、H2-T22、H2-D1、Cd40、Itga6、H2-Q2、Ptprm、Cdh4、H2-T23、Vcam1、Spn、Pecam1、H2-Q7、Jam2、Vcan、Vtcn1、Icam2、Cd2、Cdh5、Itga9。 如圖9B 所示，網(wǎng)絡(luò)中連線越多的節(jié)點(diǎn)發(fā)揮的作用越重要， 如細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1），因此，通過RT-qPCR 技術(shù)驗(yàn)證ICAM-1 和VCAM-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量變化。

圖9 HHQG 抑制黏附分子相關(guān)基因群分析

2.6 VCAM-1 和ICAM-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量檢測結(jié)果

由圖10 和圖11 可知， 在CCl4誘導(dǎo)肝損傷后的第2、5、7 天，與對照組相比，模型組小鼠肝臟組織中VCAM-1 和ICAM-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量均顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）升高；與模型組相比， 肝損傷后第2 天，HHQG 保肝組的肝臟組織中VCAM-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量無顯著（P>0.05） 差異， 但肝損傷后第5、7 天極顯著（P<0.01）降低；與模型組相比，肝損傷后第2 天以及第5、7 天，HHQG 保肝組的肝臟組織中ICAM-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量分別顯著（P<0.05）和極顯著（P<0.01）降低。

圖10 肝臟組織中VCAM-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量檢測結(jié)果

圖11 肝臟組織中ICAM-1 基因的mRNA 相對表達(dá)量檢測結(jié)果

3 討論

肝損傷是肝臟在受到肝炎病毒感染、有毒藥物或毒素侵害、酒精濫用等不良外源性因素作用引起的，以肝細(xì)胞凋亡或壞死、脂肪變性以及肝功能損害為主要特征的肝臟疾?。?］。 嚴(yán)重的急性肝損傷以及肝功能衰竭會誘發(fā)肝性腦病以及全身多器官衰竭等并發(fā)癥，從而危害人體健康［8］。 肝損傷的防治是肝病臨床治療工作的重要環(huán)節(jié)，控制肝損傷的發(fā)生和發(fā)展對肝病的治療具有重要的臨床意義。蒙藥HHQG 是目前臨床上廣泛應(yīng)用的經(jīng)典保肝方劑，但HHQG 發(fā)揮保肝作用的機(jī)理十分復(fù)雜，目前仍處于研究階段。 CCl4誘導(dǎo)的肝損傷、肝纖維化和肝硬化模型是評估保肝藥物效果的經(jīng)典模型［9-10］，因此，本研究使用CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型評估HHQG 的保肝作用。CCl4對肝臟的毒性作用初期表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶活力顯著升高，肝功能下降［11］。 本研究首先對各組小鼠血清中的ALT 和AST 活力進(jìn)行檢測， 結(jié)果顯示， 模型組小鼠血清中的ALT 和AST 活力在肝損傷早期迅速顯著升高，提示肝臟嚴(yán)重受損；此時，相較于模型組小鼠，HHQG 保肝組小鼠血清中的ALT 和AST 活力顯著降低， 這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似［12-14］。 有文獻(xiàn)報(bào)道，高劑量HHQG 可以減輕肝臟病理損傷程度［12-13，15］，因此，本研究分別對各組小鼠進(jìn)行肝臟組織病理學(xué)檢查，HE 染色和Masson 染色結(jié)果顯示，CCl4可以造成肝臟組織大面積彌漫性壞死，并伴有大量膠原纖維物質(zhì)沉積以及炎性細(xì)胞浸潤， 而接受HHQG 干預(yù)的小鼠肝臟組織的損傷壞死面積明顯縮小，膠原纖維物質(zhì)沉積與炎性細(xì)胞浸潤均明顯減少。在肝損傷過程中，除了毒物本身及其代謝產(chǎn)物對肝細(xì)胞的直接損傷外，損傷后引起的免疫炎癥反應(yīng)也對肝損傷的發(fā)展至關(guān)重要［14］。 本研究組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，HHQG 可以明顯改善CCl4誘導(dǎo)的肝損傷，這可能與HHQG 減輕炎癥細(xì)胞浸潤密切相關(guān)。

筆者所在課題組前期開展的相關(guān)研究表明，HHQG 可能通過抗炎作用改善肝損傷［4］。 在此基礎(chǔ)上，本研究對HHQG 改善肝損傷、發(fā)揮抗炎保肝的作用機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探索。很多中藥通過抑制炎性因子表達(dá)發(fā)揮減輕炎癥的作用。 例如，追風(fēng)透骨膠囊通過抑制IL-1β、IL-6、TNF-α 和IFN-γ 等炎性因子表達(dá)緩解骨關(guān)節(jié)炎癥［16］，并通過減少單核/巨噬細(xì)胞浸潤達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)的效果；中草藥產(chǎn)品PhytodolorR（STW 1）通過降低脂多糖（LPS）激活的單核/巨噬細(xì)胞TNF-α 和PTGS2 分泌水平發(fā)揮抗炎作用［17］；槲皮素通過抑制中性粒細(xì)胞的過度炎癥活動緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［18］。

中性粒細(xì)胞［19-21］和單核/巨噬細(xì)胞［22-24］是炎癥反應(yīng)中最重要的固有免疫細(xì)胞，因此，抑制肝損傷后與中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞浸潤有關(guān)的炎癥反應(yīng)是臨床治療肝損傷需要解決的關(guān)鍵問題［25］。本研究發(fā)現(xiàn)HHQG 可以抑制CCl4誘導(dǎo)的肝損傷組織中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞浸潤，從而發(fā)揮抗炎、促進(jìn)受損肝組織修復(fù)的作用。 為了進(jìn)一步探究HHQG 的抗炎機(jī)制，本研究對小鼠肝臟組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析， 結(jié)果表明，HHQG 可以顯著下調(diào)大量黏附分子相關(guān)基因的表達(dá)水平。 ICAM-1 和VCAM-1 等黏附分子參與炎性細(xì)胞的運(yùn)輸［26］。VCAM-1 有助于調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的血管黏附和巨噬細(xì)胞的跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移［27］。 本研究通過RT-qPCR 試驗(yàn)驗(yàn)證，HHQG 可抑制黏附分子ICAM-1 和VCAM-1的基因表達(dá)，但具體作用機(jī)制尚不明確。 TNF-α 作為肝損傷中重要的炎性因子［28］，具有促炎的作用。在肝臟中，TNF-α 主要由庫普弗細(xì)胞產(chǎn)生［29］，其不僅可以直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡造成肝損傷［30］，促進(jìn)血液中的單核細(xì)胞向肝臟大量浸潤，而且可以誘導(dǎo)黏附分子ICAM-1 和VCAM-1 的 表達(dá)［31］，介 導(dǎo)進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)，加重肝損傷。 本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)和RT-qPCR 技術(shù)分析了小鼠肝臟組織中TNF-α 的表達(dá)情況，結(jié)果表明，HHQG 可在蛋白水平和基因水平上顯著降低TNF-α 的表達(dá)， 進(jìn)一步驗(yàn)證了HHQG 通過抑制炎性因子表達(dá)從而減輕肝臟炎癥反應(yīng)的作用機(jī)理。

4 結(jié)論

HHQG 通過減少以中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，下調(diào)肝損傷區(qū)域炎性因子TNF-α 的表達(dá)，以及抑制黏附分子的表達(dá)，減輕肝損傷后發(fā)生的炎癥，從而發(fā)揮抗炎保肝作用。 本研究為今后進(jìn)一步探索HHQG 改善肝損傷的多靶標(biāo)治療效應(yīng)提供了參考。