分心木乙醇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響

白 娜，田麗麗，吳 靜，李文婷，張傳林

(湖北省十堰市太和醫(yī)院1.感染科；2.心功能科，湖北 十堰 442000)

肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，也是相關(guān)癌癥中死亡的第三大原因，具有高侵襲、轉(zhuǎn)移和惡化程度差等特點(diǎn)[1-2]。目前，臨床上常見的治療方案有肝切除、肝移植和放療等，但5年預(yù)后效果不甚理想，因此，尋找副作用較小的天然藥物具有重要的意義[3]。分心木是胡桃科核桃果核的內(nèi)質(zhì)隔膜，質(zhì)地輕薄，占核桃總質(zhì)量的4%～5%，具有健脾固腎，利尿清熱等功效[4]，其化學(xué)成分豐富，具有潛在的抗炎、抗氧化和抗腫瘤的作用[5]。有研究表明，分心木不同有機(jī)提取物(包括乙醇提取物，DJFEE)明顯抑制人肝癌細(xì)胞7404、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和人結(jié)腸癌細(xì)胞Hct116、Caco-2的增殖[6]，但是關(guān)于分心木乙醇提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞Huh7的研究尚無明確報(bào)道。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是多種疾病的關(guān)鍵通路，與多種腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有密切的聯(lián)系[7]，如丹參酮ⅡA免疫納米粒通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲[8]。因此，本研究以肝癌細(xì)胞Huh7為研究對(duì)象，主要探究分心木乙醇提取物可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，旨在為肝癌細(xì)胞的研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 人肝癌細(xì)胞Huh7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；胎牛血清、杜爾貝科改良鷹式培養(yǎng)基(DMEM)、0.25 %胰酶和Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑LiCl購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；MTT試劑盒、凋亡試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天公司；Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；PCNA抗體、MMP-9抗體和MMP-14抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；Cleaved caspase3抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、Wnt1抗體、β-catenin抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 分心木乙醇提取物制備 取核桃果核內(nèi)部的木質(zhì)隔膜分心木，在研缽內(nèi)磨碎，經(jīng)過60目過篩后，然后取適量置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入適量75 %乙醇溶液，避光反應(yīng)48 h。充分溶解后，過濾，941×g離心6 min后收集上清液，烘干，稱重。取1 mL的DMSO溶液加入溶解(DMSO終濃度≤0.05%)，調(diào)整分心木乙醇提取物相應(yīng)濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將人肝癌細(xì)胞Huh7在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，置于恒溫密閉培養(yǎng)內(nèi)37℃、5% CO2條件下孵育培養(yǎng)，每隔2天更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至75%，0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

取制備的分心木乙醇提取物，然后將濃度調(diào)整為：50、100、200 μg/mL加入Huh7細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)分為4組，分別為：空白對(duì)照組(control)：加入10 μL DMSO培養(yǎng)基處理細(xì)胞，分心木乙醇提取物低劑量組(L-DJFEE)：加入50 μg/mL分心木乙醇提取物處理細(xì)胞，分心木乙醇提取物中劑量組(M-DJFEE)：加入100 μg/mL分心木乙醇提取物處理細(xì)胞、分心木乙醇提取物高劑量組(H-DJFEE)：加入200 μg/mL分心木乙醇提取物處理細(xì)胞。采用200 μg/mL的分心木乙醇提取物和10 mmol/L的Wnt/β-catenin激動(dòng)劑LiCl處理細(xì)胞，記為DJFEE+LiCl組，以200 μg/mL的分心木乙醇提取物(DJFEE組)作為對(duì)照。

1.4 MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh7細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為1×105/mL，加入細(xì)胞懸液重懸細(xì)胞，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)48 h和72 h后，加入0.5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μL 的DMSO，酶標(biāo)儀450 nm下檢測(cè)細(xì)胞OD值，細(xì)胞抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白OD)/(對(duì)照組OD值-空白OD)×100%?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)：將各組Huh7細(xì)胞以每孔500個(gè)/細(xì)胞接種至6孔中，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)14 d，肉眼觀察到克隆形成時(shí)終止培養(yǎng)，甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，沖洗自然晾干，將其倒置在顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.5 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：收集培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞，置于不含血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，在Transwell小室的上室內(nèi)加入200 μL細(xì)胞懸液，密度為2×105/mL；Transwell小室的下室加入600 μL含有血清的DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h，加入適量甲醇固定，25 min后加入結(jié)晶紫染色，10 min后使用棉簽輕輕擦拭小室內(nèi)側(cè)非遷移細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察遷移細(xì)胞數(shù)目并計(jì)數(shù)。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：取出已經(jīng)稀釋好的Matrigel膠，鋪板于Transwell小室的上室內(nèi)在加入40 μL的Matrigel稀釋液，在培養(yǎng)箱內(nèi)至Matrigel稀釋液烘干，其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)一致。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh7細(xì)胞懸液，PBS清洗，離心棄上清，PBS清洗，加入細(xì)胞結(jié)合液重懸細(xì)胞，接種至6孔板內(nèi)，密度為2×106/mL。按照凋亡試劑盒說明步驟，加入10 mg/L Annexin V-FITC和PI，遮光反應(yīng)，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞PCNA、MMP-9、MMP-14、Cleaved caspase3、Bax、Bcl-2、Wnt1和β-catenin蛋白的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh7細(xì)胞，加入200 μL蛋白裂解液，冰浴裂解30 min，離心取上清，使用BCA定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品凝膠調(diào)用分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉孵育2 h，加入一抗蛋白(PCNA、MMP-9、MMP-14、Cleaved caspase3、Bax、Bcl-2、Wnt1、β-catenin)，4℃過夜孵育，第2天加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h，加入發(fā)光液顯影，GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞增殖的影響 與Control組相比，L-DJFEE、M-DJFEE和H-DJFEE各劑量組Huh7細(xì)胞的細(xì)胞抑制率顯著增加(P<0.05)，克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05，見圖1)。

*：與Control組比較(采用單因素方差分析)，P<0.05；n=9。圖1 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 Transwell結(jié)果顯示，與Control組相比，L-DJFEE、M-DJFEE和H-DJFEE各劑量組Huh7細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)目和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低(P<0.05，見圖2)。

A：遷移細(xì)胞數(shù)；B：侵襲細(xì)胞數(shù)；C：遷移、侵襲；*：與Control組比較(采用單因素方差分析)，P<0.05。圖2 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.3 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞PCNA、MMP-9和MMP-14蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，L-DJFEE、M-DJFEE和H-DJFEE各劑量組Huh7細(xì)胞的PCNA、MMP-9和MMP-14蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，見圖3)。

*：與Control組比較(采用單因素方差分析)，P<0.05。 圖3 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞PCNA、MMP-9和MMP-14蛋白表達(dá)的影響

2.4 分心木乙醇提物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與Control組相比，L-DJFEE、M-DJFEE和H-DJFEE各劑量組Huh7細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P<0.05，見圖4)。

*：與Control組比較(采用單因素方差分析)，P<0.05。圖4 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞Cleaved caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，L-DJFEE、M-DJFEE和H-DJFEE各劑量組Huh7細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved caspase3、Bax蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05，見圖5)。

*：與Control組比較(采用單因素方差分析)，P<0.05。圖5 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞Cleaved caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.6 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，L-DJFEE、M-DJFEE和H-DJFEE各劑量組Huh7細(xì)胞的Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，見圖6)。

*：與Control組比較(采用單因素方差分析)，P<0.05。圖6 分心木乙醇提取物對(duì)Huh7肝癌Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)的影響

2.7 分心木乙醇提取物通過Wnt/β-catenin調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲 與DJFEE組相比，DJFEE+LiCl組的克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)目、侵襲細(xì)胞數(shù)目、PCNA、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞抑制率顯著降低(P<0.05，見圖7)。

A：細(xì)胞抑制率；B：遷移、侵襲；C：PCNA、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)；*：與DJFEE組比較， P<0.05。圖7 分心木乙醇提取物通過Wnt/β-catenin調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

2.8 分心木乙醇提取物通過Wnt/β-catenin調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡 與DJFEE組相比，DJFEE+LiCl組的Bax蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，見圖8)。

A：細(xì)胞凋亡率；B：Cleaved caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)；*：與DJFEE組比較， P<0.05。圖8 分心木乙醇提取物通過Wnt/β-catenin調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡

3 討論

目前，多種天然抗腫瘤藥物在腫瘤治療中已取得了明顯的作用效果，如吉馬酮、芝麻素、淫羊藿素和褐藻多糖硫酸酯等，可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。分心木是核桃內(nèi)部干燥的木質(zhì)隔膜，常用于治療失眠多夢(mèng)、瀉痢等癥狀，其化學(xué)成分也十分豐富，如黃酮類、多糖和有機(jī)提取物等[10]。Meng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，分心木多糖明顯抑制肝癌細(xì)胞HepG2和胃癌細(xì)胞BGC-823增殖。劉亞娜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，分心木乙醇提取物作用結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116后，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)和PARP蛋白裂解,下調(diào)Bcl2蛋白表達(dá)，分心木乙醇提取物明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。PCNA是增殖核抗原，與細(xì)胞DNA合成有關(guān)，可以反映細(xì)胞情況；MMP-9、MMP-14屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，與細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。Bcl-2和Bax蛋白同屬于Bcl-2蛋白家族，可控制線粒體途徑中細(xì)胞色素C釋放，促進(jìn)caspase-3活化加速細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，分心木乙醇提取物低、中、高各劑量作用Huh7肝癌細(xì)胞后，明顯降低細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目，增加細(xì)胞抑制率、凋亡率，下調(diào)PCNA、MMP-9、MMP-14和Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax和Cleaved caspase3蛋白表達(dá)，這說明分心木乙醇提取物能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)其凋亡，這與之前的報(bào)道相似。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在多種癌癥中發(fā)揮著重要作用，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等病理過程[15-16]。Wnt蛋白現(xiàn)在已報(bào)道的有19種的相關(guān)蛋白，Wnt1蛋白參與經(jīng)典的信號(hào)通路，可以作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的起始信號(hào)蛋白，Wnt1在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，可以激活下游β-catenin蛋白，大量聚集后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)[17-18]。蔡蕤[19]研究結(jié)果顯示，靈芝三萜可以通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。葉興濤等[20]研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素通過抑制Wnt2/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲。本研究通過Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，分心木乙醇提取物低、中、高各劑量呈劑量依賴性降低肝癌細(xì)胞中Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)。加入Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活劑LiCl后，結(jié)果顯示，增加肝癌細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)目、侵襲細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞抑制率、凋亡率明顯降低，上調(diào)PCNA、MMP-9、MMP-14、Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)，這說明說明分心木乙醇提取物可以調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮在肝癌細(xì)胞中的作用。

綜上所述，分心木乙醇提取物通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。