基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析生姜瀉心湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在作用

熊詩(shī)琳，林小荷，黃松，侯少貞，劉昌輝，姜小艷，梁健

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）發(fā)病始于直腸，通常以連續(xù)方式向近端延伸，穿過(guò)部分或整個(gè)結(jié)腸，是一種慢性結(jié)腸黏膜炎癥性疾病。近年來(lái)，UC 在全球的發(fā)病率不斷上升[1-2]。雖然目前臨床治療UC 的藥物選擇不斷增多，包括腫瘤壞死因子（TNF）和小分子藥物（Janus 激酶抑制劑）等[3-4]。但由于治療藥物存在價(jià)格昂貴、療效不穩(wěn)定和存在不良反應(yīng)等問(wèn)題，容易導(dǎo)致患者病情反復(fù)和產(chǎn)生耐藥性等，而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[5]。盡管藥物治療選擇擴(kuò)大了范圍，仍有10%～20%的UC 患者需要進(jìn)行手術(shù)切除治療[6]。而中醫(yī)治療可通過(guò)結(jié)合UC 的不同發(fā)病機(jī)制，發(fā)揮中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)等優(yōu)勢(shì)進(jìn)行治療[7]。

生姜瀉心湯源自于《傷寒論》，由生姜、半夏、黃芩、黃連、人參、干姜、炙甘草和大棗組成，該方寒熱并用，苦辛并施，是治療胃腸道疾病的常用方藥，具有使升降復(fù)、腸胃和之功[8-9]。由于中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路等特點(diǎn)，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，利用其從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，解析藥物及其治療對(duì)象之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律的優(yōu)點(diǎn)，高效篩選和預(yù)測(cè)生姜瀉心湯藥物成分靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)復(fù)方藥物有效成分與治療UC 相關(guān)靶點(diǎn)的作用機(jī)制，并采用分子對(duì)接技術(shù)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。為生姜瀉心湯臨床治療UC 以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco2 細(xì)胞）購(gòu)于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于5%二氧化碳37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器噻唑藍(lán)（MTT）、脂多糖（LPS）購(gòu)于碧云天生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol RNA 提取試劑和SYBR Green qPCR 試劑盒購(gòu)于瑞真生物科技有限公司；重組兔單克隆抗體p53（48599）、兔單克隆抗體AKT1/2（48888）購(gòu)自美國(guó)Signalway Antibody 公司；兔單克隆抗體IL-1β（EPR24895-116）購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。CFXRCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司；LSM800 蔡司激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Carl Zeiss 公司；賽默飛Multiskan FC 型酶標(biāo)儀、NanoDrop2000 核酸濃度檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

1.3.1 生姜瀉心湯活性成分及作用靶點(diǎn)篩選分別以生姜瀉心湯方所包括的單味中藥（如生姜、半夏、黃芩、黃連、人參、干姜、炙甘草和大棗）為檢索詞，通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/index.php）檢索其活性成分。篩選條件為：口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）中檢索各個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因名稱(chēng)，整合去重處理后獲得生姜瀉心湯活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.3.2 “復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”的靶點(diǎn)獲取及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過(guò)在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、TTD（https：//db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank（https：//go.drugbank.com/）、PharmGBK（https：//www.pharmgkb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入關(guān)鍵詞“ulcerative colitis”進(jìn)行檢索，將得到的所有靶點(diǎn)進(jìn)行整理、去重、匯總。利用R.4.0.3 軟件（https：//www.r-project.org/）篩選得到生姜瀉心湯和UC 的共同靶點(diǎn)，并利用Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建生姜瀉心湯治療UC 的“復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，以Degree 值排序獲取核心作用成分。

1.3.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲈?/p>

STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）導(dǎo)入交集靶點(diǎn)，并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。同時(shí)，將該物種設(shè)置為“homo sapiens”，所需的最小交互得分設(shè)置為0.9，并刪除斷開(kāi)的節(jié)點(diǎn)。然后，將復(fù)雜蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系文件數(shù)據(jù)輸入到Cytoscape 3.7.0 軟件中，使用插件CytoNCA 計(jì)算節(jié)點(diǎn)的六個(gè)參數(shù)，即介數(shù)中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）和局部平均連通性（LAC）。最后，根據(jù)候選靶點(diǎn)的6 個(gè)參數(shù)應(yīng)高于中位值原則來(lái)篩選核心靶點(diǎn)。

1.3.4 分子對(duì)接驗(yàn)證根據(jù)以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，對(duì)核心組分以及核心蛋白進(jìn)行模擬虛擬分子對(duì)接。于PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取核心化學(xué)組分的3D 結(jié)構(gòu)式（包括AKT1、TP53 和IL-1β），于RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB，https：//www.rcsb.org/）獲取靶點(diǎn)結(jié)晶結(jié)構(gòu)。將其結(jié)果利用Maestro 軟件進(jìn)行結(jié)果處理和可視化。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.4.1 MTT 分析將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco2（1×103個(gè)/孔）細(xì)胞種于96 孔板中，培養(yǎng)12 h 后，加入不同濃度的生姜瀉心湯（0、12.5、25、50、100、200 和400 μg/mL），干預(yù)24 h 后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），并于培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，吸掉培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，隨后使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量每孔吸光度。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco2（1×103個(gè)/孔）細(xì)胞種于96 孔板中，培養(yǎng)12 h 后，給予LPS（1 mg/mL）刺激，同時(shí)加入不同濃度的生姜瀉心湯（12.5、25、50、100、200 和400 μg/mL），干預(yù)24 h 后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），并于培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，吸掉培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，隨后使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量每孔吸光度。

1.4.2 RT-PCR 分析生姜瀉心湯干預(yù)后基因的表達(dá)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco2（1×105個(gè)/孔）細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為Ctrl 組、LPS組、LPS+生姜瀉心湯25 μg/mL 組、LPS+生姜瀉心湯50 μg/mL 組和LPS+生姜瀉心湯100 μg/mL 組5 組；Ctrl 組細(xì)胞給予等體積的培養(yǎng)基，LPS 組加入等體積的培養(yǎng)基（含有1 mg/mL 的LPS），各濃度的生姜瀉心湯組加入對(duì)應(yīng)濃度的生姜瀉心湯，同時(shí)加入1 mg/mL 的LPS，干預(yù)24 h；收集每組細(xì)胞，用Trizol 試劑提取總RNA，測(cè)定RNA 的濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 引物如下：AKT1 正向?yàn)?′-AGCGACGTGG CTATTGTGAAG-3′，AKT1 反向?yàn)?′-GCCATCATTCT TGAGGAGGAAGT-3′；IL-1β 正向?yàn)?′-ATGATGGCT TATTACAGTGGCAA-3′，IL-1β 反向?yàn)?′-GTCGGAG ATTCGTAGCTGGA-3′；TP53 正向?yàn)?′-CAGCACAT GACGGAGGTTGT-3′，TP53 反向?yàn)?′-TCATCCAAA TACTCCACACGC-3′，GAPDH 作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；循環(huán)40 次。根據(jù)公式2-△△CT計(jì)算目標(biāo)基因的表達(dá)情況。

1.4.3 免疫熒光分析生姜瀉心湯干預(yù)后蛋白的表達(dá)將Caco2（1×104個(gè)/孔）細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后，分為Ctrl 組、LPS 組及生姜瀉心湯組。LPS 組及生姜瀉心湯組給予LPS 刺激，此外生姜瀉心湯組給予100 μg/mL 的生姜瀉心湯干預(yù)24 h。各組細(xì)胞用4%多聚甲醛常溫固定15 min，封閉、通透30 min，4 ℃過(guò)夜孵育一抗（anti-AKT1、anti-TP53和anti-IL-1β），室溫孵育熒光二抗2 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染，經(jīng)共聚焦顯微鏡觀察生姜瀉心湯對(duì)靶蛋白的作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用成組t檢驗(yàn)，同組治療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（ANOVA），若數(shù)據(jù)方差齊，采用LSD 檢驗(yàn)；方差不齊，采用Dunnett′sT3 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生姜瀉心湯活性成分及其治療UC 潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1A。通過(guò)GeneCards 檢索并使用中位數(shù)獲取UC 核心靶點(diǎn)，得到靶點(diǎn)5 332 個(gè)，檢索OMIM得到靶點(diǎn)7 個(gè)，檢索TTD 得到靶點(diǎn)40 個(gè)，檢索PharmGKb 得到靶點(diǎn)15 個(gè)，檢索DrugBank 得到靶點(diǎn)11 個(gè)，合并去重得到UC 靶點(diǎn)5 186 個(gè)。見(jiàn)圖1B。通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索等方式，以O(shè)B值和DL 值為依據(jù)，共得生姜瀉心湯有效活性成分215 個(gè)。其中半夏13 個(gè)，大棗29 個(gè)，甘草91 個(gè)，干姜5 個(gè)，黃連14 個(gè)，黃芩36 個(gè)，人參22 個(gè)，生姜5 個(gè)，將所有活性成分整合去重后得到191 種唯一的活性成分，其中191 種唯一活性成分中有247 個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。根據(jù)篩選去重后的生姜瀉心湯有效活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，利用Venny 2.1 繪制韋恩圖，得到UC 靶點(diǎn)與生姜瀉心湯藥物活性成分靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)171 個(gè)，即生姜瀉心湯治療UC 的潛在作用靶點(diǎn)。

圖1 生姜瀉心湯治療UC 的潛在靶點(diǎn)

2.2 “復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”的靶點(diǎn)獲取及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果見(jiàn)圖2。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建生姜瀉心湯治療UC 的“復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，生姜瀉心湯活性成分-UC 靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)存在338 個(gè)節(jié)點(diǎn)與2 416 條關(guān)系。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果見(jiàn)圖3。在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到171 個(gè)交集重疊蛋白，并生成一個(gè)復(fù)雜的PPI 網(wǎng)絡(luò)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果見(jiàn)圖4A。Cytohubba 分析PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重疊蛋白，發(fā)現(xiàn)AKT1、TP53、EGFR、HIF1A、JUN、CTNNB1、CASP3、IL-1β 和STAT3 等蛋白具有更高的重疊程度。見(jiàn)圖4B。根據(jù)拖拓?fù)鋮?shù)（6 個(gè)參數(shù)，包括Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC 和Network）排序，最終確定AKT1、TP53、IL-1β 為核心靶點(diǎn)。

圖4 交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證見(jiàn)圖5。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中活性成分Degree 值和Cytohubba 分析，采用分子對(duì)接分析姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素與AKT1、TP53 和IL-1β 蛋白間的結(jié)合。結(jié)果顯示，姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素與AKT1 蛋白穩(wěn)定結(jié)合，結(jié)合親和力分別為-4.1 kJ/mol、-4.8 kJ/mol、-4.0 kJ/mol、-4.5 kJ/mol 和-5.7 kJ/mol；同樣，IL-1β 蛋白與姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素化合物也顯示出穩(wěn)定結(jié)合，其結(jié)合力分別為-3.3 kJ/mol、-3.1 kJ/mol、-3.4 kJ/mol、-1.4 kJ/mol 和-2.0 kJ/mol；此外，柚皮素與TP53 活性殘基的結(jié)合力最強(qiáng)，其次是漢黃芩素、山柰酚、姜烯酮A 和槲皮素。

圖5核心分子對(duì)接模擬圖

2.6 各組細(xì)胞活性比較見(jiàn)圖6A。在無(wú)LPS 刺激的條件下，生姜瀉心湯提取物濃度在大于100 μg/mL時(shí)，能顯著降低Caco2 細(xì)胞活性（P＜0.05）。見(jiàn)圖6B。在LPS（1 μg/mL）刺激下，生姜瀉心湯提取物在濃度范圍25、50、100 μg/mL 能夠顯著地抑制LPS刺激引起細(xì)胞活性下降（P＜0.05）；而當(dāng)生姜瀉心湯濃度200、400 μg/mL，能顯著降低細(xì)胞活性（P＜0.05）。

圖6 各組細(xì)胞活性比較

2.7 各組細(xì)胞AKT1、TP53、IL-1β mRNA 表達(dá)水平比較見(jiàn)圖7。與Ctrl 組比較，LPS 組AKT1、TP53 和IL-1β mRNA 水平均升高（P＜0.05）；與LPS組比較，生姜瀉心湯50、100 μg/L 干預(yù)后，AKT1、TP53 和IL-1β mRNA 的表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖7 各組細(xì)胞AKT1、TP53、IL-1β mRNA 表達(dá)水平比較

2.8 各組細(xì)胞AKT1、TP53、IL-1β 蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)圖8。與Ctrl 組比較，LPS 組AKT1、TP53和IL-1β 蛋白表達(dá)水平均上調(diào)；與LPS 組比較，100 μg/mL 生姜瀉心湯干預(yù)后，生姜瀉心湯組AKT1、TP53 和IL-1β 蛋白表達(dá)水平明顯下降。

圖8 各組細(xì)胞AKT1、TP53、IL-1β 蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

本研究基于中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)作用的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)生姜瀉心湯的有效成分進(jìn)行篩選，結(jié)合UC 的發(fā)病機(jī)制，預(yù)測(cè)其治療UC 的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，并對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。首先，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，篩選出生姜瀉心湯治療UC 的有效成分171 種，核心有效成分包括姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素等。研究中獲得生姜瀉心湯治療UC 的可能作用靶點(diǎn)，通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選及拓?fù)浞治鲎罱K獲得HIF1A、STAT3、CTNNB1、CASP3、AKT1、IL-1β、TP53、EGFR、JUN 共9 個(gè)核心基因，其中AKT1、IL-1β 和TP53 起關(guān)鍵作用。前期大量的研究也已經(jīng)證明AKT1、IL-1β 和TP53 基因在UC 發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10-12]。進(jìn)一步采用分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果顯示，生姜瀉心湯中核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的親和力高，說(shuō)明生姜瀉心湯可能作用于以上靶點(diǎn)（AKT1、IL-1β 和TP53）治療UC。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證生姜瀉心湯可通過(guò)調(diào)控AKT1、IL-1β 和TP53 靶點(diǎn)治療UC。本研究采用生姜瀉心湯干預(yù)LPS 刺激Caco2 細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，生姜瀉心湯能夠劑量依賴(lài)性地抑制AKT1、IL-1β 和TP53 mRNA 的表達(dá)；同時(shí)，免疫熒光分析也同樣表明生姜瀉心湯能夠明顯地下調(diào)AKT1、IL-1β 和TP53 蛋白的表達(dá)，提示生姜瀉心湯干預(yù)后能夠顯著地抑制LPS 刺激Caco2 細(xì)胞AKT1、IL-1β 和TP53 基因和蛋白的表達(dá)，再次證實(shí)生姜瀉心湯可通過(guò)調(diào)控AKT1、IL-1β 和TP53 等靶點(diǎn)，改善UC。

綜上，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)為基礎(chǔ)，通過(guò)構(gòu)建“復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地對(duì)生姜瀉心湯中活性成分進(jìn)行研究，揭示中藥復(fù)方與UC 之間的關(guān)聯(lián)性。同時(shí)，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的部分預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，為深入探究生姜瀉心湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制提供參考。