LINC00943調(diào)節(jié)miR-331-3p/KMT2A軸對宮頸癌細胞惡性生物學(xué)行為和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

葛新苗，高倩，刁叢，溫美俠，李帥

(保定市第二中心醫(yī)院產(chǎn)科,保定 072750)

宮頸癌(CC)是常見的癌癥之一,在全球女性發(fā)病率中排名第四[1]。對于CC患者,免疫治療已成為CC治療的新熱點,但其治療效果仍不理想[2]。由于CC具有高復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性等特點,導(dǎo)致CC患者總體預(yù)后較差。在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中,細胞外基質(zhì)(ECM)降解導(dǎo)致腫瘤細胞遷移、侵襲和擴散到各組織繼發(fā)部位[3]。因此,了解CC發(fā)生和發(fā)展機制對尋找新的診斷生物標志物和有效治療方案至關(guān)重要。長鏈非編碼核糖核酸(LncRNA)是具有200多個核苷酸的核糖核酸(RNA)轉(zhuǎn)錄本,其已被證實與CC的發(fā)生及患者的預(yù)后密切相關(guān)[4]。LINC00943是一種新型的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄物[5]。文獻報道,CC免疫相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)網(wǎng)絡(luò)(包含LINC00943),在細胞增殖、凋亡和程序性細胞死亡中顯著富集[6]。微小RNA(miRNA)是高度保守的小非編碼RNA,其已成為診斷CC的潛在生物標志物[7]。據(jù)報道,miR-331-3p在HeLa細胞中高表達,miR-331-3p靶向調(diào)控NRP2抑制CC細胞增殖、遷移和侵襲[8]。此外,研究顯示,前列腺癌和膠質(zhì)瘤中LncRNA UCA1、LncRNA GAPLINC均可通過調(diào)節(jié)miR-331-3p促進細胞進展[9-10]。賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2A(KMT2A)是表觀遺傳機制的一員,主要負責H3K4甲基化進行轉(zhuǎn)錄激活[11]。據(jù)報道,敲低KMT2A可抑制CC細胞的增殖和遷移,并抑制腫瘤的生長[12]。然而,LINC00943對CC惡性生物學(xué)行為及miR-331-3p、KMT2A的影響尚不清楚。因此,本研究旨在探討LINC00943在CC中的作用以及具體機制,以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞及動物來源:正常宮頸上皮細胞Ect1/E6E7和人CC細胞系HeLa、SiHa、C33A、CaSki購自美國ATCC細胞庫;4周齡BALB/c裸鼠購自湖北省實驗動物研究中心,許可證號:SCXK(鄂)2020—0018。

2.主要試劑:LINC00943短發(fā)夾RNA(sh-LINC00943)和陰性對照(sh-NC)、miR-331-3p抑制劑(miR-331-3p inhibitor)和陰性對照(NC inhibitor)、miR-331-3p模擬物(miR-331-3p mimics)和陰性對照(miR-NC)、KMT2A過表達質(zhì)粒及對照(pcDNA)購自上?？蒲派锟萍加邢薰?Nuclear/Cytosol Fractionation Kit(K266-100)購自上海起源生物科技有限公司;PrimeScript RT試劑盒(RR036A)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(DRR820A)購自日本TaKaRa公司;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062S)、MTT(C0009S)、Dual-LumiTMⅡ雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(RG089S)、Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑(C0526)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人KMT2A多抗(ab272023)、兔抗人E-cadherin單抗(ab76319)、兔抗人N-cadherin單抗(ab76011)、HRP標記的IgG(ab150077)購自英國Abcam公司。

3.主要儀器:熒光倒置顯微鏡(型號IX71)購自日本Olympus公司;PCR儀(型號:T100TM)、流式細胞儀(型號ZE5)購自美國Bio-Rad公司。

二、研究方法

1.細胞培養(yǎng):將正常宮頸上皮細胞Ect1/E6E7和人CC細胞系HeLa、SiHa、C33A、CaSki細胞放置在含10% FBS和1%的青鏈霉素的DMEM中,置于37℃、5% 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1 d更換培養(yǎng)基,待細胞貼壁達70%～80%,用胰蛋白酶進行傳代培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.細胞轉(zhuǎn)染:將HeLa細胞分為sh-NC組、sh-LINC00943組、sh-LINC00943+NC inhibitor組、sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor組、miR-NC組、miR-331-3p mimics組、miR-331-3p mimics+pcDNA組、miR-331-3p mimics+KMT2A組。收集各組HeLa細胞,用0.25%胰蛋白酶消化重懸,并接種在6孔板中(每孔1.2×106個),待細胞融合度為70%～80%時,使用Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染細胞,轉(zhuǎn)染48 h后,提取各組細胞總RNA,實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)檢測轉(zhuǎn)染效率。

3.LINC00943在HeLa中的定位:收集HeLa細胞,預(yù)冷PBS沖洗,離心后取細胞沉淀,使用Nuclear/Cytosol Fractionation Kit試劑盒分離細胞核、細胞質(zhì)并提取RNA,RT-qPCR法檢測LINC00943表達。

4.RNA pull down實驗:將生物化LINC00943探針和HeLa細胞裂解物混合,以非生物化LINC00943探針為對照,加入磁珠于4℃下孵育48 h。提取總RNA,RT-qPCR檢測miR-331-3p表達。

5.熒光素酶報告實驗:將LINC00943野生型(wt)或突變型(mut)及KMT2A-wt/KMT2A-mut序列克隆到pmirGLO載體中,構(gòu)建LINC00943-wt/LINC00943-mut、KMT2A-wt/KMT2A-mut質(zhì)粒,使用Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建的載體與miR-331-3p模擬物或陰性對照(NC)共轉(zhuǎn)染到HeLa細胞,轉(zhuǎn)染2 d后,采用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

6. RT-qPCR實驗:TRIzol試劑提取各組細胞總RNA,并利用PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明進行PCR擴增,RT-qPCR反應(yīng)條件為:95℃ 5 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個循環(huán),使用2-ΔΔCt法計算LINC00943、miR-331-3p的表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列及產(chǎn)物長度

7.Western blot實驗:收集轉(zhuǎn)染后的細胞,提取總蛋白,BCA法測量蛋白濃度后,10% SDS-PAGE分離蛋白,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入一抗KMT2A(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000),4℃孵育過夜,洗膜3次后加入HRP標記的二抗IgG(1∶10 000),ECL暗光反應(yīng),Image J軟件檢測蛋白表達。

8.細胞增殖實驗:將轉(zhuǎn)染后的細胞接種在96孔板中,每組設(shè)置3個復(fù)孔,加入MTT溶液,酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD值)。

9.細胞遷移和侵襲:Transwell小室法檢測HeLa細胞遷移和侵襲。將細胞加入無血清DMEM上腔進行細胞遷移,細胞侵襲上腔涂有Matrigel,下腔加入10%胎牛血清的DMEM,孵育24 h,結(jié)晶紫染色,顯微鏡下對遷移和侵襲細胞進行計數(shù)。

10.細胞凋亡實驗:將轉(zhuǎn)染后的細胞置于96孔板中,室溫下孵育48 h,結(jié)合緩沖液重懸,加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色,流式細胞儀分析細胞凋亡率。

11.裸鼠體內(nèi)腫瘤形成實驗:4周齡BALB/c裸鼠分別皮下注射200 μl sh-NC或sh-LINC00943慢病毒轉(zhuǎn)染的HeLa細胞,記為sh-NC組或sh-LINC00943組,每組5只裸鼠。4周后,處死小鼠剝離腫瘤,測量腫瘤重量,Western blot檢測移植瘤組織中KMT2A、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平。實驗經(jīng)過本院動物倫理審查委員會審查。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、LINC00943在CC細胞系中的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示,與正常宮頸上皮細胞Ect1/E6E7比較,CC細胞系中LINC00943表達顯著升高(P<0.05),且HeLa細胞中LINC00943表達水平最高,因此選取HeLa進行后續(xù)實驗(圖1)。

注:與Ect1/E6E7比較,*P<0.05。

二、Hela細胞中LINC00943與miR-331-3p的相互作用

亞細胞分離實驗顯示,Hela細胞的細胞質(zhì)中LINC00943的百分比高于細胞核(圖2A)。RNA pull down實驗顯示,Bio-miR-331-3p-wt中,LINC00943高度富集(圖2B)。使用Targetscan獲得LINC00943與miR-331-3p的結(jié)合位點(圖2C)。雙熒光素酶活性檢測顯示,與miR-NC組相比較,miR-331-3p mimics加了LINC00943-wt的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),加了LINC00943-mut的熒光素酶活性則無顯著差異(P>0.05)(圖2D)。RT-qPCR結(jié)果顯示,與sh-NC比較,sh-LINC00943組LINC00943表達顯著降低,miR-331-3p表達顯著增加(P<0.05);與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor組miR-331-3p表達顯著降低(P<0.05)(圖2E、圖2F)。

A:細胞核和細胞質(zhì)中LINC00943的表達占比;B:RNA pull-down實驗各組LINC00943相對表達量;C:Targetscan分析LINC00943與miR-331-3p的結(jié)合位點;D:雙熒光素酶基因報告檢測LINC00943和miR-331-3p之間的相互作用;E:下調(diào)LINC00943后各組細胞LINC00943相對表達量;F:下調(diào)LINC00943后,各組細胞miR-331-3p相對表達量。注:與Bio-NC組、miR-NC組或sh-NC組比較,*P<0.05;與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,#P<0.05。

三、下調(diào)LINC00943對CC細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和EMT的影響

與sh-NC比較,sh-LINC00943組細胞增殖、遷移和侵襲顯著降低,細胞凋亡率顯著增加,E-cadherin表達顯著上調(diào),N-cadherin表達顯著下調(diào)(P<0.05);與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor組細胞增殖、遷移和侵襲顯著增加,細胞凋亡率顯著降低(圖3、圖4),E-cadherin蛋白表達顯著下調(diào),N-cadherin蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)(圖5)。

圖3 下調(diào)LINC00943對各組細胞遷移(光鏡400×)、侵襲(光鏡400×)、凋亡的影響

A:各組細胞增殖曲線圖;B:各組遷移細胞數(shù)比較;C:各組侵襲細胞數(shù)比較;D:各組細胞凋亡灰度圖。注:與sh-NC組比較,*P<0.05;與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,#P<0.05。

A:Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達;B:各組E-cadherin蛋白表達水平比較;C:各組N-cadherin蛋白表達水平比較。注:與sh-NC組比較,*P<0.05;與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,#P<0.05。

四、Hela細胞中miR-331-3p與KMT2A的靶向關(guān)系

使用Targetscan預(yù)測miR-331-3p與KMT2A存在結(jié)合位點(圖6A),表明KMT2A是miR-331-3p下游基因。雙熒光素酶活性檢測顯示,與miR-NC組相比較,miR-331-3p mimics組加入KMT2A-wt后,熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而KMT2A-mut則無顯著改變(P>0.05)(圖6B)。RT-qPCR顯示,與miR-NC組比較,miR-331-3p mimics組miR-331-3p表達顯著增加,miR-331-3p mimics組、miR-331-3p mimics+pcDNA組和miR-331-3p mimics+KMT2A組比較無顯著差異(P>0.05)(圖6C)。miR-331-3p mimics組KMT2A蛋白表達顯著低于miR-NC組,與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,miR-331-3p mimics+KMT2A組KMT2A蛋白表達顯著增加(P<0.05)(圖7)。

A:Targetscan分析miR-331-3p與KMT2A的結(jié)合位點;B:雙熒光素酶基因報告檢測miR-331-3p與KMT2A的相互作用;C:轉(zhuǎn)染miR-331-3p mimics后,各組細胞中miR-331-3p相對表達。注:與miR-NC組比較,*P<0.05。

A:Western blot檢測KMT2A蛋白表達;B:各組KMT2A蛋白表達水平比較。注:與miR-NC組比較,*P<0.05;與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,#P<0.05。

五、miR-331-3p通過調(diào)控KMT2A對HeLa細胞增殖、凋亡和EMT的影響

與miR-NC組比較,miR-331-3p mimics組細胞活力、遷移和侵襲顯著降低,細胞凋亡率顯著增加,E-cadherin表達顯著上調(diào),N-cadherin表達顯著下調(diào)(P<0.05);與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,miR-331-3p mimics+KMT2A組細胞活力、遷移和侵襲顯著增加,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖8、圖9),E-cadherin蛋白表達顯著下調(diào),N-cadherin蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)(圖10)。

圖8 miR-331-3p通過調(diào)控KMT2A對HeLa細胞遷移(光鏡400×)、侵襲(光鏡400×)和凋亡的影響

A:各組細胞增殖曲線圖;B:各組細胞遷移比較;C:各組細胞侵襲比較;D:流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。注:與miR-NC組比較,*P<0.05;與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,#P<0.05。

A:Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達;B:各組E-cadherin蛋白表達水平比較;C:各組N-cadherin蛋白表達水平比較。注:與miR-NC組比較,*P<0.05;與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,#P<0.05。

六、體內(nèi)腫瘤實驗

與sh-NC比較,sh-LINC00943組腫瘤重量顯著降低,LINC00943表達顯著降低,miR-331-3p表達顯著增加(P<0.05)(圖11);Western blot顯示,KMT2A、N-cadherin顯著降低,E-cadherin蛋白水平顯著增加(P<0.05)(圖12)。

A:兩組裸鼠體內(nèi)腫瘤重量比較;B:兩組細胞LINC00943表達水平比較;C:兩組細胞miR-331-3p表達水平比較。注:與sh-NC組比較,*P<0.05。

A:Western blot檢測KMT2A、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達;B:兩組細胞KMT2A蛋白表達水平比較;C:兩組細胞E-cadherin蛋白表達水平比較;D:兩組N-cadherin蛋白表達水平比較。注:與sh-NC組比較,*P<0.05。

討 論

CC是女性常見的惡性腫瘤之一,尤其在不發(fā)達國家發(fā)病率較高,CC患者在初次治療后的最初幾年內(nèi)易發(fā)生盆腔復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的風險[13],因此,尋找潛在生物標志物對CC治療和預(yù)后至關(guān)重要。最近幾年內(nèi),LncRNA被確定為包括CC在內(nèi)的多種癌癥的重要標志物[14]。研究表明,LncRNA DLEU2通過miR-455-3P/OTUD7B軸激活PI3K/AKT信號通路促進CC的惡性進展[15]。據(jù)報道,構(gòu)建與免疫相關(guān)的LINC00943 ceRNA網(wǎng)絡(luò),有助于癌癥患者存活率的預(yù)后評估[16],而有關(guān)LINC00943對CC調(diào)控機制的研究還未見報道。本研究結(jié)果顯示,在CC細胞系中LINC00943表達顯著上調(diào),其中HeLa細胞中LINC00943表達最高,這是因為HeLa細胞比其它細胞擴增得快。由于HeLa細胞中LINC00943表達最高,敲低LINC00943表達的效果最顯著,故選擇HeLa細胞進行后續(xù)實驗。沉默LINC00943可抑制細胞增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡。EMT是上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的細胞過程。早期腫瘤的轉(zhuǎn)移與EMT密切相關(guān),EMT可加速腫瘤的遷移和侵襲[17]。有研究表明,EMT過程在CC轉(zhuǎn)移和侵襲過程中起主要作用,例如:沉默LncRNALINC01305可以抑制TNXB介導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路,從而抑制CC細胞EMT[18]。高表達LncRNA UNC5B-AS1可以增強TLR信號通路,促進CC細胞增殖和EMT能力[19]。本研究結(jié)果顯示,沉默LINC00943可促進E-cadherin表達,同時抑制N-cadherin表達,提示沉默LINC00943可抑制EMT,發(fā)揮抑癌作用。

LncRNA可作為ceRNA抑制miRNA表達,進而調(diào)控癌癥的生物學(xué)行為[20]。Buranjiang等[21]研究顯示,LncRNAHOTAIR通過海綿化miR-331-3p增強染色體凝縮調(diào)控因子2(RCC2)表達,加速CC進展。本研究發(fā)現(xiàn),LINC00943主要分布在細胞質(zhì)中,且與miR-331-3p存在靶向關(guān)系。已證實,miR-331-3p可以調(diào)節(jié)腫瘤的進展,并可作為獨立的預(yù)后因素。相關(guān)研究表明,miR-331-3p在CC中高表達,LncRNAXLOC-006390可作為ceRNA反向調(diào)節(jié)miR-331-3p和miR-338-3p的表達,促進CC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[22]。本研究結(jié)果顯示,過表達miR-331-3p可抑制CC增殖、遷移、侵襲和EMT,促進細胞凋亡,而LINC00943可負調(diào)控miR-331-3p的表達,促進CC惡性生物學(xué)行為發(fā)生,抑制miR-331-3p表達可逆轉(zhuǎn)沉默LINC00943表達對CC增殖、遷移、侵襲和EMT的抑制作用。

KMT2A是具有H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)錄共激活劑,可以調(diào)節(jié)癌癥細胞活力、遷移和凋亡。據(jù)報道,KMT2A的高表達與腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)[23]。敲低KMT2A表達可抑制黑色素瘤細胞的活力和腫瘤球的形成[24]。在骨髓增殖性腫瘤中,檢測到KMT2A陽性率顯著增加,其突變體KMT2A G3131S可促進細胞增殖和菌落形成能力[25],但是,KMT2A在CC上的作用機制鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn),過表達KMT2A可逆轉(zhuǎn)miR-331-3p上調(diào)對CC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT的抑制作用。體內(nèi)研究表明,沉默LINC00943可抑制腫瘤生長和EMT,并下調(diào)KMT2A表達,與體外實驗結(jié)果一致。提示沉默LINC00943可通過負調(diào)控miR-331-3p降低KMT2A表達,抑制CC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT,促進細胞凋亡。

綜上所述,LINC00943在CC細胞中高表達,當其表達下調(diào)時,可以通過調(diào)控miR-331-3p/KMT2A軸抑制CC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT,誘導(dǎo)細胞凋亡。但LINC00943與CC臨床患者中的病理特征和預(yù)后的關(guān)系仍有待深入研究。