桌面干式培養(yǎng)箱在體外受精胚胎培養(yǎng)中的臨床效果觀察

董曉慧，師娟子，劉小華，趙正豪，趙小利，李偉，薛俠

(西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心,西安 730000)

從最初進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)開(kāi)始,人們就對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了各種各樣的改進(jìn)以?xún)?yōu)化胚胎培養(yǎng)體系,從而達(dá)到獲得更多優(yōu)質(zhì)胚胎的目的。近年來(lái),胚胎培養(yǎng)基的商業(yè)化使用使得培養(yǎng)的一致性和效果大大提高,提升了輔助生殖技術(shù)的成功率。胚胎培養(yǎng)箱作為胚胎在體外生長(zhǎng)發(fā)育的場(chǎng)所,在胚胎培養(yǎng)中發(fā)揮著舉足輕重的作用。

胚胎培養(yǎng)箱盡可能維持胚胎生長(zhǎng)所需的最佳pH值、滲透壓、溫度、空氣和濕度[1-4]。為了達(dá)到這一目的,培養(yǎng)箱經(jīng)歷了多次改進(jìn),從傳統(tǒng)的濕式CO2培養(yǎng)箱發(fā)展到現(xiàn)在的時(shí)差成像(Time-lapse,TL)培養(yǎng)箱。傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)箱最明顯的缺點(diǎn)是箱內(nèi)的高濕度會(huì)使得微生物繁殖加劇,從而可能對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響[5]。近年來(lái),隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,桌面干式培養(yǎng)箱由于其靈敏、便捷的特性在IVF實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。然而,目前關(guān)于其胚胎培養(yǎng)的臨床效果的研究并不多見(jiàn)。干式培養(yǎng)箱和傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)箱的主要區(qū)別在于箱內(nèi)環(huán)境的濕度差異,這一差異將會(huì)對(duì)箱內(nèi)培養(yǎng)皿的滲透壓和pH等產(chǎn)生不同的影響。一些研究認(rèn)為,在干式培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)皿表面覆油雖然能有效地控制培養(yǎng)基pH和溫度的改變,但對(duì)于滲透壓的維持效果還有爭(zhēng)議[6-7]。因此,干式培養(yǎng)箱的有效性和安全性值得我們關(guān)注。

目前尚無(wú)關(guān)于干式培養(yǎng)箱和傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)箱的培養(yǎng)效果和安全性的大樣本研究。本研究擬通過(guò)回顧性分析2019年1月至2022年9月于我院生殖中心就診行IVF治療的,在同一培養(yǎng)環(huán)境下、相同培養(yǎng)基中,進(jìn)行胚胎培養(yǎng)患者的臨床資料,比較桌面干式培養(yǎng)箱與傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)箱在胚胎培養(yǎng)中的效果和妊娠結(jié)局,以期對(duì)干式培養(yǎng)箱的培養(yǎng)效果和安全性提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2019年1月至2022年9月于我院生殖中心就診行IVF治療患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者年齡≤40歲;(2)為第1周期治療;(3)新鮮D3卵裂期胚胎或D5囊胚移植;(4)胚胎或囊胚的移植數(shù)為1個(gè)。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)人絨毛膜促性腺激素(HCG)日內(nèi)膜厚度<7 mm;(2)男女任何一方存在染色體異常者。

本研究共納入3 177個(gè)周期。根據(jù)培養(yǎng)環(huán)境不同分為兩組:以傳統(tǒng)濕式箱培養(yǎng)的為C200(濕式)組(n=2 820),以桌面干式培養(yǎng)箱培養(yǎng)的為MIRI(干式)組(n=357)。

本研究方案通過(guò)了西北婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核,所有患者均簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.促排方案及取卵受精:根據(jù)患者自身情況,個(gè)體化制定促排卵方案,包括長(zhǎng)方案、超長(zhǎng)方案、短方案和拮抗劑方案等。根據(jù)男方精液情況確定受精方式,行IVF或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)受精。HCG注射36 h后,經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下,行穿刺取卵術(shù)。

患者取卵4～6 h后開(kāi)始進(jìn)行授精。IVF在體外洗精受精液(G-IVF PLUS,Vitrolife,瑞典)中進(jìn)行,ICSI授精在含有30 μl的取卵-胚胎處理液(G-MOPS PLUS,Vitrolife,瑞典)的微滴中進(jìn)行,授精后轉(zhuǎn)移至含有40 μl的卵裂胚培養(yǎng)液(G-1 PLUS,Vitrolife,瑞典)的微滴中進(jìn)行培養(yǎng);16～18 h后,觀察并判斷受精情況,并根據(jù)D3胚胎情況決定是否進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。對(duì)于常規(guī)IVF,D3需獲得≥2枚優(yōu)質(zhì)胚胎;對(duì)于ICSI受精,D3需獲得≥3枚優(yōu)質(zhì)胚胎;若未形成優(yōu)質(zhì)胚胎,則需可用胚胎數(shù)達(dá)到5枚,將可用胚胎轉(zhuǎn)移至含有40 μl的囊胚培養(yǎng)液(G-2 PLUS,Vitrolife,瑞典)的微滴中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。以上所有的培養(yǎng)過(guò)程,C200(濕式)組都是在傳統(tǒng)濕式箱(C200,Labotect,德國(guó))中進(jìn)行,MIRI(干式)組都是在桌面干式培養(yǎng)箱(MIRI,ESCO,新加坡)中進(jìn)行。

2.胚胎評(píng)分:卵裂期胚胎根據(jù)Istanbul共識(shí)[8]進(jìn)行評(píng)分,分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)。其中評(píng)分在Ⅰ～Ⅲ級(jí)的胚胎被認(rèn)定為可用胚胎,Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)為優(yōu)質(zhì)胚胎。囊胚評(píng)分依據(jù)Gardner標(biāo)準(zhǔn)[9]來(lái)進(jìn)行,按照囊胚擴(kuò)展程度分為3、4、5、6級(jí),按照內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)量和緊密程度分為A、B、C級(jí),按照外滋養(yǎng)層的細(xì)胞數(shù)目和排列緊密程度分為A、B、C級(jí),評(píng)分在C級(jí)及以上被認(rèn)定為可用囊胚。D5囊胚評(píng)估后依據(jù)評(píng)分擇優(yōu)移植,余下囊胚進(jìn)行冷凍保存。

3.胚胎移植及黃體支持:提前1 h將待移植胚胎轉(zhuǎn)移至裝載有1 ml 囊胚培養(yǎng)液(G-2 PLUS,Vitrolife,瑞典)的培養(yǎng)皿中。在腹部B超引導(dǎo)下,用移植管裝載胚胎放置到子宮內(nèi)。擬新鮮移植的患者,從取卵日開(kāi)始黃體支持,方案為每日肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)60 mg,同時(shí)每日口服地屈孕酮(雅培,美國(guó))20 mg。

4.妊娠結(jié)局的判定:卵裂期胚胎移植14 d后,囊胚移植12 d后,檢測(cè)血清HCG水平,血清HCG≥10 U/L為HCG陽(yáng)性;移植28 d后,B超檢測(cè)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)有孕囊,判定為臨床妊娠;子宮以外其他位置探查到孕囊,判定為異位妊娠。

5.主要觀察指標(biāo):主要評(píng)價(jià)指標(biāo)為臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率。次要觀察指標(biāo)為D3優(yōu)胚率、囊胚形成率、種植率、早產(chǎn)率、胎兒出生體重。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/新鮮移植周期數(shù)×100%;活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/新鮮移植周期數(shù)×100%;流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%;D3優(yōu)胚率=D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵母細(xì)胞數(shù)×100%;囊胚形成率=總的囊胚數(shù)/正常受精卵母細(xì)胞數(shù)×100%;種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%;早產(chǎn)率=孕12周內(nèi)自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般臨床資料比較

兩組間女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、不孕類(lèi)型、基礎(chǔ)FSH、LH、雌二醇(E2)、竇卵泡數(shù)計(jì)數(shù)(AFC)、總促性腺激素(Gn)比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般臨床資料比較[(-±s),%]

二、兩組患者胚胎培養(yǎng)情況比較。

兩組間雙原核(2PN)率、D3優(yōu)胚率、D3可用胚胎率、囊胚形成率比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者間胚胎培養(yǎng)情況比較[(-±s),%]

三、兩組患者臨床結(jié)局比較

1.移植卵裂期胚胎患者的臨床結(jié)局比較:選擇卵裂期胚胎移植的MIRI(干式)組和C200(濕式)組患者分別有115周期和990周期,MIRI(干式)組的活產(chǎn)率顯著高于C200(濕式)組(46.09% vs. 36.06%,P<0.05);兩組間胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、雙胎率、胎兒出生體重比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者移植卵裂期胚胎的臨床結(jié)局比較[(-±s),%]

2.移植囊胚患者的妊娠結(jié)局比較:MIRI(干式)組和C200(濕式)組患者選擇囊胚移植的分別有242周期和1 830周期,MIRI(干式)組流產(chǎn)率顯著高于C200(濕式)組(20.63% vs. 13.20%,P<0.05);兩組間囊胚種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率、雙胎率、胎兒出生體重比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組患者移植囊胚的臨床結(jié)局比較[(-±s),%]

討 論

人體內(nèi)的環(huán)境是潮濕的,因此我們?cè)谶M(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)時(shí)一直在盡可能的模仿這種潮濕的環(huán)境。但是近年來(lái)關(guān)于濕式培養(yǎng)和干式培養(yǎng)的各自?xún)?yōu)勢(shì)的研究結(jié)果并不一致[10-12]。本研究通過(guò)比較在同一實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下、采用相同序貫培養(yǎng)基培養(yǎng)的胚胎在傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)箱和桌面干式培養(yǎng)箱的培養(yǎng)效果和臨床結(jié)局,發(fā)現(xiàn)兩組間D3優(yōu)胚率、D3可用胚胎率和囊胚形成率比較均無(wú)顯著差異(P>0.05),此結(jié)果與Kirkegaard等[10]和Bartolacci等[11]的一致。然而,Valera等[12]研究發(fā)現(xiàn),胚胎培養(yǎng)采用TL系統(tǒng)和全程培養(yǎng)基并分別采取濕式培養(yǎng)箱和干式培養(yǎng)箱兩種培養(yǎng)條件時(shí),濕式培養(yǎng)箱能夠獲得更高的妊娠率,且這種現(xiàn)象在胚胎植入前非整倍體檢測(cè)(PGT-A)患者中表現(xiàn)的尤為突出。我們認(rèn)為,出現(xiàn)這種情況的原因可能是:(1)干式培養(yǎng)對(duì)全程培養(yǎng)基的影響更大,滲透壓和pH的變化也較濕式培養(yǎng)顯著;(2) 活檢對(duì)囊胚造成了一定的損傷,導(dǎo)致囊胚對(duì)干性培養(yǎng)環(huán)境所產(chǎn)生的不良影響的抵抗力降低,從而影響其發(fā)育潛能。與濕式培養(yǎng)相比較,干式培養(yǎng)最大的變化在于培養(yǎng)基微滴的滲透壓的變化。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示,盡管表面覆油,干式培養(yǎng)的培養(yǎng)基微滴隨著時(shí)間推移(1～7 d)滲透壓逐漸升高,而濕式培養(yǎng)的微滴滲透壓變化不大,兩者的妊娠結(jié)局差異較大[13-16]。此外,通過(guò)TL系統(tǒng)并采用干式培養(yǎng)箱培養(yǎng)的胚胎,盡管在胚胎選擇上有實(shí)時(shí)圖像的加持,其妊娠結(jié)局卻并不優(yōu)于傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)[17-18]。

同時(shí),本研究結(jié)果顯示,與傳統(tǒng)C200(濕式)培養(yǎng)箱相比較,MIRI(干式)培養(yǎng)箱培養(yǎng)的胚胎在卵裂期具有更高的活產(chǎn)率(P<0.05),兩組間囊胚期臨床妊娠率、活產(chǎn)率和早產(chǎn)率比較均無(wú)顯著差異(P>0.05),但流產(chǎn)率顯著升高(P<0.05)。此結(jié)果與Fawzy等[19]研究結(jié)果不同,他們的研究認(rèn)為干式培養(yǎng)的優(yōu)胚率、種植率、臨床妊娠率以及持續(xù)妊娠率均顯著低于濕式培養(yǎng)。分析其原因發(fā)現(xiàn)其研究方法和本研究有很大區(qū)別:(1)采用全程培養(yǎng)基,中途不更換培養(yǎng)基;(2)只進(jìn)行D5囊胚的新鮮移植。我們推測(cè)隨著時(shí)間的推移,干式培養(yǎng)所產(chǎn)生的滲透壓逐漸升高和pH改變等不利影響累加在一起,進(jìn)而影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),D3卵裂期胚胎新鮮移植的活產(chǎn)率更高,原因可能是到D3卵裂期培養(yǎng)基的改變尚不足以對(duì)胚胎產(chǎn)生足夠的不利影響。培養(yǎng)箱的性能指標(biāo)包括了氣體濃度、恢復(fù)時(shí)間、溫度、pH和濕度等,每一項(xiàng)在胚胎培養(yǎng)中都發(fā)揮了一定的作用,培養(yǎng)效果也是它們的綜合表現(xiàn)[3,20-21]?；诖?有部分研究認(rèn)為桌面干式培養(yǎng)箱的培養(yǎng)效果更優(yōu)[22]。桌面干式培養(yǎng)箱由于其單個(gè)箱體小,在開(kāi)箱后溫度和CO2濃度的恢復(fù)上有很大優(yōu)勢(shì)。有研究表明,經(jīng)過(guò)5 s的開(kāi)箱門(mén),桌面干式培養(yǎng)箱可以在5 min恢復(fù)至37℃,而傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)箱需要20～30 min;同樣,開(kāi)箱門(mén)后,桌面干式培養(yǎng)箱需要約3 min恢復(fù)氣體濃度,而后者需要8 min[23]。所以,我們推測(cè):胚胎培養(yǎng)的前期階段(D3及之前)更加依賴(lài)溫度,氣體濃度,而對(duì)滲透壓變化的反應(yīng)不明顯,因此對(duì)于D3卵裂期胚胎來(lái)說(shuō)采用桌面干式培養(yǎng)的效果更佳;而對(duì)于后期囊胚階段的胚胎,囊胚對(duì)滲透壓的影響更敏感,產(chǎn)生了一定的不利影響,因而流產(chǎn)率顯著升高。結(jié)合以上分析,我們不難發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)箱相比,桌面干式培養(yǎng)箱具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)箱體小巧便捷,開(kāi)箱后氣體濃度、溫度等指標(biāo)恢復(fù)更快;(2)箱體內(nèi)干燥缺水,不利于微生物繁殖,降低了胚胎培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染的風(fēng)險(xiǎn);(3)與濕式培養(yǎng)箱相比較,桌面干式培養(yǎng)箱D3卵裂期可用胚胎率、優(yōu)胚率及囊胚形成率無(wú)顯著差異(P>0.05),而活產(chǎn)率顯著升高(P<0.05)。基于此,我們可以認(rèn)為桌面干式培養(yǎng)箱在胚胎培養(yǎng)的安全性上是值得肯定的。

綜上所述,D3卵裂期胚胎及以前階段的胚胎培養(yǎng)更適合在桌面干式培養(yǎng)箱中進(jìn)行,能獲得更好的培養(yǎng)效果和臨床結(jié)局;而D4及以后階段胚胎更適合傳統(tǒng)濕式培養(yǎng),來(lái)糾正干式環(huán)境對(duì)囊胚的影響。但由于本次研究的樣本量有限,仍存在出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差的可能,今后還需要更大的樣本量來(lái)驗(yàn)證這一結(jié)論。