QuEChERS 結合優(yōu)化的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定韭菜中9 種易殘留農藥

王 晗，丁 爽，李海平

（鋼研納克檢測技術股份有限公司，北京 100081）

韭菜屬多年生宿根性蔬菜，富含蛋白質、纖維素、多種維生素、微量元素等營養(yǎng)物質，深受消費者喜愛，市場需求量巨大[1]。然而韭菜極易遭受病害侵襲，尤其在大棚溫室等冬春季韭菜生產地中，韭菜灰霉病、韭蛆等危害尤為突出[2]。為保證韭菜的產量和質量，藥劑防治仍是目前田間防控該病害較常采用的措施[3]。這些農藥主要以灌根的方式投入韭菜生產，導致土壤中殘留的農藥量非常大，從土壤環(huán)境中吸收農藥后的韭菜被消費者食用后，產生急性中毒事件時有曝光，造成了非常不好的社會影響[4]。相關研究顯示[5-7]，相比于其他農藥，多菌靈、腐霉利、吡蟲啉、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊靈、氧樂果這9 種農藥在韭菜中更易殘留，當前亟需建立一種簡單、快速、高效的方法，針對性地用于檢測韭菜中的易殘留農藥。

目前，常見的農殘檢測技術主要有氣相色譜法[8-9]、液相色譜法[10-11]、氣相色譜-質譜法[12-13]、氣相色譜-質譜/質譜法[14-15]和液相色譜-質譜/ 質譜法[16-17]。其中，氣相色譜法、液相色譜法對前處理要求高、定性能力弱、適用范圍窄，而且抗干擾能力差，容易引起假陽性；氣相色譜-質譜法為低分辨質譜，當樣品基質復雜時，特別是質荷比接近的目標物和干擾物不能有效地區(qū)分，同樣會出現(xiàn)假陽性而造成誤判；而氣相色譜-質譜/質譜法和液相色譜-質譜/質譜法，通過選擇反應監(jiān)測掃描或多反應監(jiān)測掃描，選擇特征母離子與子離子，可有效減少基質對檢測結果的影響，現(xiàn)逐漸發(fā)展為農藥多殘留分析的主要檢測技術[18]。但相比于氣相色譜-質譜/質譜法，液相色譜-質譜/質譜法對于前處理的要求更低且耗時更短。

常用的農殘前處理方法主要有固相分散萃取法、固相萃取法、凝膠滲透色譜法以及QuEChERS 法，韭菜的基質十分復雜，在其農藥殘留檢測過程中，傳統(tǒng)的樣品前處理技術不易實現(xiàn)基質成分的有效凈化，對農藥檢測容易產生基質效應，影響測定結果的準確性[19]。QuEChERS 法通過吸附劑填料與基質中雜質的相互作用來達到吸附除雜的目的，其前處理簡便、快速，現(xiàn)已成為動植物性食品中農藥殘留的主要前處理技術之一。

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，結合QuEChERS 前處理技術，針對韭菜中容易檢出的多菌靈、腐霉利、吡蟲啉、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊靈、氧樂果等農藥，建立了一種適用于檢測韭菜中上述9 種農殘的分析方法，儀器檢測時間僅需4 min，定性定量準確，方法簡便快捷，大大提高了檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰性韭菜粉，鋼研基地自產；多菌靈、腐霉利、吡蟲啉、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊靈、氧樂果的標準溶液，含量均為1 000 mg/kg，壇墨質檢；乙腈、甲醇、甲酸，均為色譜純，阿拉丁試劑公司；乙酸銨、無水硫酸鎂、氯化鈉，麥克林；乙二胺-N-丙基硅烷/PSA、石墨化炭黑/GCB，山東美正生物科技有限公司；50mL 離心管，廣州潔特生物過濾股份有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜，Waters UPLC-AB SCIEX QTRAP 5500，配電噴霧離子源，美國AB SCIEX；多孔渦旋振蕩器，北京華安麥科生物技術有限公司；IKA 漩渦混合器，艾卡儀器設備有限公司；濾膜，0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司；1/100 電子天平，瑞士梅特勒-托利多集團；TD5 臺式低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

稱取1 g 陰性韭菜粉，加入9 mL 超純水，復溶成10 g 韭菜樣本。向其中加入10 mL 乙腈，加入4 g 無水硫酸鎂、1 g 氯化鈉，劇烈振蕩15 min，4 000 r/min離心5 min，取4 mL 上清液倒入裝有0.6 g 無水硫酸鎂、0.1 g PSA、0.01 g GCB 的離心管中，劇烈振蕩3 min，4 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 有機濾膜備用。

1.3.2 儀器條件

色譜條件：ACQUITY UPLCD HSS C18 SB 色譜柱，粒徑1.8 μm，100 mm×2.1 mm，美國Waters 公司；流動相組成及洗脫梯度如表1 所示；柱溫40 ℃；流速為0.40 mL/min；進樣量1 μL。

表1 流動相組成及洗脫梯度

質譜條件，電離方式：ESI+；MRM 多反應監(jiān)測模式；離子化電壓：5 500 V；氣簾氣壓力35 psi；干燥氣溫度：550 ℃；噴霧器壓力：55 psi；輔助加熱器壓力：55 psi；定性離子對、定量離子對及碰撞能量見表2。

表2 9 種農藥在UPLC-MS/MS 多反應監(jiān)測模式下的檢測條件

1.3.3 標準曲線繪制及基質效應

溶劑標準曲線的配制：準確移取質量濃度均為1 000 mg/L 的9 種農藥標準溶液各10 μL，用乙腈配制成質量濃度為10 mg/L 的混合標準中間液，于-20 ℃保存，備用。再以質量濃度為10 mg/L 的混合標準中間液為母液，用乙腈逐級稀釋成質量濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L 的系列混合標準工作液。按照1.3.2 的條件上機測定，以標準溶液中待測農藥的質量濃度為橫坐標，以待測農藥的峰面積為縱坐標，通過Analyst software 繪制溶劑標準曲線。

基質匹配標準曲線的配制：以質量濃度為10 mg/L的混合標準中間液為母液，用1.3.1 中處理得到的韭菜陰性基質液逐級稀釋成質量濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L 的系列基質匹配混合標準工作液。按照1.3.2 的條件上機測定，以基質匹配標準溶液中待測農藥的質量濃度為橫坐標，以待測農藥的峰面積為縱坐標，通過Analyst software繪制基質匹配標準曲線。

基質效應評價：本文通過計算基質標準曲線和溶劑標準曲線的線性方程[式（1）]斜率比進行基質效應（ME）評價。

根據(jù)ME 為正值還是負值評價基質效應為增強或減弱效應。其中，當-20%＜ME＜20%時，通常認為是弱基質效應；當-50%＜ME＜-20%或20%＜ME＜50%時，為中等程度基質效應；當ME＜-50%或50%＜ME時，為強基質效應；中等程度基質效應和強基質效應都需要進行基質補償[21]。

1.3.4 添加回收率實驗

稱取陰性韭菜樣品，設定10、50、100、200 μg/kg 4 個添加水平，每個添加水平設置6 個重復，另設空白對照，按照1.3.1 所述的方法進行前處理，按照1.3.2的條件上機測定，計算添加回收率和相對標準偏差。

2 結果與討論

2.1 質譜參數(shù)及流動相的優(yōu)化

本實驗在ESI+模式下，用針泵以7.5 μL/min 的流速將質量濃度為500 μg/L 的9 種農殘單標注入質譜儀，進行全掃描，獲得加合離子峰，以其作為母離子進行轟擊，獲得碎片離子。選擇響應較強的2 個碎片離子和母離子組成2 對監(jiān)測離子對。在MRM 多反應監(jiān)測模式下，對碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）等參數(shù)逐一進行優(yōu)化。優(yōu)化獲得的MRM 離子對及質譜條件見表2。

本實驗考察了：①水+甲醇、②水+乙腈、③0.1%甲酸水+甲醇、④0.1%甲酸水+乙腈、⑤2 mol/L 乙酸銨-0.1%甲酸水+甲醇，5 組不同流動相對化合物峰形和響應的影響。結果顯示，使用流動相②、④時，腐霉利響應很低。使用流動相①、③、⑤時，9 種物質均能正常出峰，且響應信號逐漸升高，峰形也逐步得到改善。因此，本實驗最終采用2 mol/L 乙酸銨-0.1%甲酸水+甲醇溶液作為流動相。甲酸的加入能提供H+質子，有助于化合物電離的同時也提高了背景化合物的響應。乙酸銨的加入使得流動相離子強度增加，電子轉移速率增加，目標化合物和背景化合物同時抑制電離，乙酸銨在一定濃度下，可提高目標化合物的信噪比[22]。9 種農藥混合標準溶液（10.0 μg/L）在韭菜樣品基質中的提取離子流圖見圖1。

圖1 9 種農藥混合標準溶液在韭菜樣品基質中的提取離子流圖

2.2 基質效應

如表3 所示，腐霉利和甲胺磷表現(xiàn)為基質增強效應，二甲戊靈幾乎沒有基質效應，其余6 種農藥在韭菜中均為基質減弱效應。根據(jù)基質效應對應范圍，除氧樂果在韭菜中表現(xiàn)為中等程度基質效應外，其余農藥基均為弱基質效應。

表3 9 種農藥在韭菜中的基質效應

2.3 標準曲線線性的考察

綜合考慮9 種化合物的基質效應，本實驗采用基質匹配標準曲線進行定量，如表4 所示，多菌靈在1～200 μg/kg 范圍內線性關系良好，線性系數(shù)為0.991 1，腐霉利在5～500 μg/kg 范圍內線性關系良好，線性系數(shù)為0.999 1，其余7 種化合物在1～500 μg/kg范圍內均呈現(xiàn)良好線性關系，線性系數(shù)在0.997 0～1.000 0 之間。

表4 9 種農藥的線性方程、線性系數(shù)和線性范圍

2.4 方法的回收率與精密度

如表5 所示，在10、50、100、200 μg/kg 4 個添加水平下，9 種農藥在韭菜中的平均回收率在70%～115%之間，相對標準偏差在0.6%～6.7%之間，結果表明本試驗所建立的方法具有良好的準確度和精密度，滿足韭菜中易檢出農殘的分析檢測要求。根據(jù)NY/T 788—2018[23]規(guī)定，以最低添加水平作為方法的定量限（LOQ），則9 種農藥的定量限均為0.01 mg/kg，且均低于本實驗研究的9 種農藥在韭菜中的最高殘留限量[24]。

表5 9 種農藥的加標回收率及相對標準偏差（n=6）

3 結論

本研究采用QuEChERS 前處理方法結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時檢測韭菜中多菌靈、腐霉利、吡蟲啉、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊靈、氧樂果9 種農藥，建立了一種針對性檢測韭菜中9 種易殘留農藥的方法。9 種農藥中，多菌靈在1～200 μg/kg 范圍內線性關系良好，腐霉利在5～500 μg/kg 范圍內線性關系良好，其余7 種化合物在1～500 μg/kg 范圍內線性關系良好，線性系數(shù)均大于0.99，方法的定量限為10 μg/kg。在10、50、100、200 μg/kg 添加水平的回收率在70%～115%之間，相對標準偏差在0.6%～6.7%之間（n=6）。本研究所建立的檢測方法，前處理時間短，色譜及質譜條件經過優(yōu)化，峰形好、化合物在儀器中的響應高，方法簡單、快速、靈敏度、準確度、精密度均符合農藥殘留分析的要求，適用于韭菜樣品中9 種易殘留農殘的檢測。