基于UPLC法測定建昌幫姜制厚樸主成分含量變化差異*

涂愛國 孜拉來·吐爾洪 李 梅 葉喜德△

厚樸為木蘭科植物厚樸(MagnoLiaofficinaLisRehd.et WiLs)或凹葉厚樸(MagnoLiaoffcinaLisRehd.et WiLs Rehd.et.WiLs)的干燥干皮、枝皮或根皮,主要分布于陜西、浙江、江西、甘肅、湖北、四川、貴州等地,其中四川、湖北、浙江為其主產(chǎn)地[1]。厚樸味苦、辛,歸胃、脾、大腸、肺經(jīng),性溫,具有行氣、燥濕、消痰、消積、平喘之功效。厚樸經(jīng)姜制后能夠增強(qiáng)寬中和胃的能力,并可消除咽喉刺激感,常用治嘔吐瀉痢、脘腹脹滿、痰飲喘咳、積滯便秘等證[2,3]。歷代文獻(xiàn)對厚樸的炮制方法均有記載,如漢代用去皮制法,唐代用姜汁制法。到了宋代,對厚樸姜制法有了更加詳細(xì)的記載,提出“不以姜制,則棘人喉舌”之炮制理論,并創(chuàng)新性提出了新的炮制方法,如糯米粥制、生姜棗制等;明朝的姜汁炒制和煮制外,還采用酒制、煅制、姜蜜制和姜汁巴豆制等;清朝有醋炒記載[4]?，F(xiàn)代常以姜湯煮、姜制、姜汁浸等法炮制,故現(xiàn)版《中華人民共和國藥典》[1]中除了“厚樸”之外,也收載了“姜厚樸”。資料表明,厚樸主含木蘭花堿、和厚樸酚、厚樸酚等有效成分[5]。因此,本研究以這3種成分為厚樸不同炮制品質(zhì)量評價的指標(biāo),運(yùn)用UPLC測定厚樸不同炮制品主要成分含量,目的是探討不同炮制方法對其含量變化的影響,為深入研究厚樸炮制品變化及其作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐,也為優(yōu)選其優(yōu)質(zhì)飲片提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器AcouityUPLCCLAss超高效液相、KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、二兩裝高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)、XW-80A旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)、TDL-80-2C低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、藥典篩(紹興市上虞瑞志儀器廠)、十萬分之一電子天平(現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗室)、5 ml的一次性使用無菌注射器帶針(圣光醫(yī)用制品股份有限公司)、GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、SHZ-DIII循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑乙腈(純度:色譜純,安徽天地超純?nèi)軇┯邢薰?、超純水(南昌哇哈哈食品有限公司)、甲醇(純度:色譜純,安徽天地超純?nèi)軇┯邢薰?、甲酸(批號:1101181,西隴科學(xué)股份有限公司)、甲醇(批號:B2210111,西隴科學(xué)股份有限公司)。

1.3 試藥厚樸酚對照品(批號:MUST-21030614,純度:99.90%,成都曼思特生物科技有限公司)、和厚樸酚對照品(批號MUST-21030111,純度:99.37%,供含量測定用,成都曼思特生物科技有限公司)、木蘭花堿對照品(批號:wkq-21022608,純度:≥98%,四川省維克奇生物科技有限公司)。中藥厚樸、生姜,均購于安徽惠仁堂中藥飲片有限公司,兩者經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室劉應(yīng)姣副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸炮制品的制備

2.1.1 厚樸生品取原藥材,刮去粗皮,洗凈,潤透,切絲,曬干,備用。

2.1.2 姜制厚樸依照建昌幫制法:取原藥材,用清水洗凈灰屑,除去雜質(zhì),豎放入竹編內(nèi);再用濕抹布悶潤,至內(nèi)外濕潤均勻時,刮去外表粗皮;將其切片晾干,置缸內(nèi);缸中加入定量姜汁(每100 kg厚樸,配12 kg生姜榨汁,摻水12 kg),拌勻后悶潤1～2 d,取出晾至六成干,之后置于熱鍋內(nèi),文火炒至棕褐色約九成干時,取出厚樸,篩去灰屑,晾干即得,備用。

2.1.3 姜煮厚樸將生姜洗凈切成片置于的鍋中加適量清水,煮成姜汁,之后將厚樸置于姜汁中文火加熱共煮,至鍋中姜汁被厚樸將吸盡,取出厚樸晾涼,切細(xì)絲,晾干即得,備用。

2.2 供試品溶液的制備精密稱取樣品1粉末2.000 g,裝入15 ml的EP管中,首次提取加入 50%甲醇水溶液5.5 ml,旋渦混合5 min,待溶劑被吸盡后,再加入適量50%甲醇溶液,常溫下超聲提取30 min,取出,置離心機(jī)中(3000 r/min),離心10 min,傾取上清液,置10 ml容量瓶中。連續(xù)反復(fù)提取3次(第2、3次添加溶劑量約3.5 ml),將3次提取液合并后,置10 ml容量瓶中定容。3種樣品均以此法制備并冷藏保存。

2.3 對照品的制備精密稱定木蘭花堿、和厚樸酚、厚樸酚對照品適量,分別置于EP管內(nèi),各加入甲醇1 ml,超聲5 min,搖勻,即可。

2.4 混合對照溶液的制備精密稱取1.14 mg木蘭花堿、1.15 mg厚樸酚、1.16 mg和厚樸酚對照品,共同置于10 ml容量瓶內(nèi),以甲醇溶液將3者溶解并定容。分別精密吸取120、120、500 μl的3種對照品混合儲備液,將其置于離心管中,滴加甲醇溶液100 μl,制備成1.14、1.15、1.16 mg/ml的3種不同濃度的混合對照品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 色譜條件SyncronisC18UPLC-H色譜柱(Dim 150 mm×4.6 nm,5um),流動相乙腈(A)-0.1 %甲酸水(B)梯度洗脫(0～35 min,5%～45 %A;35～50 min,45 %～70 %A),流速0.3 ml/min,進(jìn)樣量2 μl,柱溫40 ℃,在290 nm波長檢測。見圖1。

注:A:姜煮厚樸,B:姜制厚樸,C:生品厚樸,D:混合對照品;1:木蘭花堿,2:和厚樸酚,3:厚樸酚。

2.5.2 線性關(guān)系的考察精密吸取混合對照品溶液1 ml,按“2.5.1”項下色譜條件對其進(jìn)樣分析,連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣量為0.5～3 μl,設(shè)橫坐標(biāo)為進(jìn)樣濃度(μg/ml),縱坐標(biāo)為峰面積,得線性回歸方程和標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.3 精密度考察精密吸取對照品混合溶液1 ml,相同測定條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果得精密度RSD分別為0.818%(木蘭花堿)、0.496%(厚樸酚)、0.493%(和厚樸酚),三者均小于3%,表明該儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性考察取厚樸生品供試品溶液,分別于配制后0、2、4、8、12、24 h按“2.5.1”項下色譜方法,并測定其峰面積,計算RSD值。結(jié)果顯示,三者峰面積變化不大,RSD值分別為1.455%(木蘭花)、1.230%(厚樸酚)、2.027%(和厚樸酚),均小于3%,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性考察精密稱取同一供試品6份,按“2.5.1”項下色譜方法測定峰面積,計算RSD值。三者標(biāo)準(zhǔn)差分別為627.34(木蘭花堿)、7147.57(和厚樸酚)、48662.03(厚樸酚)。RSD分別為2.938%(木蘭花堿)、2.377%(和厚樸酚)、2.302%(厚樸酚),三者均小于3%,表明本法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率考察稱取生品厚樸供試品適量,精密稱定,加入1.14 mg木蘭花堿、1.15 mg厚樸酚、1.16 mg和厚樸酚的混合對照品適量,按2.3項下的條件制備供試品溶液,按2.5.1項下的色譜條件進(jìn)樣測定,計算加樣回收率。見表2。

表2 加樣回收率考察結(jié)果

2.5.7 樣品的含量測定精密取各種厚樸制劑(不同批次),各取3份,并精密稱定每份約1.000 g,依據(jù)“2.3”項的方法制備供試品溶液,照“2.5.1”項色譜方法進(jìn)行測定,并計算3種主要化學(xué)物質(zhì)的百分含量。見表3。

表3 厚樸樣品中3種成分的含量測定 (%)

3 討論

厚樸的炮制有炒制、鹽炒、煮制、酥制、醋制、酒浸炒、姜汁浸后炒干等,現(xiàn)代炮制方法多為姜湯煮、姜制、姜汁浸等。目前《中華人民共和國藥典》[1]收載了“姜厚樸”,而厚樸姜制法也是江西建昌幫特色炮制法,其使用輔料和炮制方法與《中華人民共和國藥典》[1]所載的姜厚樸制法有明顯差異。為此,以建昌幫特色炮制法做的姜厚樸為研究對象,并與其他厚樸炮制品進(jìn)行有效成分比較,以厚樸主要成分木蘭花堿、厚樸酚、和厚樸酚為質(zhì)量評價指標(biāo),探討不同炮制方法對厚樸主要有效成分含量變化的影響,為建昌幫姜厚樸中藥飲片炮制的合理性提供科學(xué)依據(jù)。

本研究選擇木蘭花堿、厚樸酚、和厚樸酚為厚樸不同炮制品的成分變化指標(biāo)。其主要依據(jù)是這些具有明顯的生物活性。藥效研究證實(shí),厚樸酚、和厚樸酚均具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用,并具抗抑郁、抗癲癇、抗腦缺血、抗癡呆等多種作用[6,7]。此外,厚樸酚還可改善胃腸運(yùn)動障礙,和厚樸酚具有保肝功能;而木蘭花堿作為一種存在于厚樸中的重要生物堿,同厚樸酚以及和厚樸酚一樣,具有抗炎、抗氧化作用,并具有抗心律失常和降壓等活性作用[8-10]。

本研究結(jié)果表明,姜制厚樸,與其他厚樸炮制品所含木蘭花堿、厚樸酚、和厚樸酚的含量分別為:生品厚樸(10.87%、11.06%、8.83%)、姜制厚樸(10.78%、8.14%、5.95%)、姜煮厚樸(11.03%、7.87%、3.13%)。說明炮制對其成分含量產(chǎn)生影響。與生品相比,建昌幫姜厚樸中厚樸酚、和厚樸酚等成分含量明顯降低,姜煮厚樸的厚樸酚、和厚樸酚含量最低,說明輔料姜和加熱等因素會影響厚樸酚、和厚樸酚的溶出,其中姜煮對厚樸的影響明顯更高。

綜上,不同炮制方法對厚樸主要有效成分含量產(chǎn)生的影響不同,其中影響最大者為木蘭花堿,其次是厚樸酚、和厚樸酚。在含量變化方面,厚樸經(jīng)過姜制,厚樸酚以及和厚樸酚都有一定程度的降低,姜煮厚樸下降更明顯,而木蘭花堿炮制前后含量變化不顯著。望此結(jié)果為今后厚樸的藥物研究提供參考。