基于半胱氨酸-Fe(Ⅲ)-鄰菲啰啉體系的共振光散射光譜法測(cè)定半胱氨酸的含量

劉 毅,袁 莉,袁嘉怡,儲(chǔ) 文,馬衛(wèi)興,2*

(1.江蘇海洋大學(xué) 藥學(xué)院,連云港 222005;2.江蘇省海洋藥物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,連云港 222005)

半胱氨酸是一種含有巰基的非必需氨基酸,參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng),在人體生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,它在人體內(nèi)的濃度水平與多種疾病相關(guān)[1-2]。半胱氨酸在食品、制藥、化妝品中的應(yīng)用十分廣泛[3],因此建立省時(shí)、高效的檢測(cè)半胱氨酸的方法對(duì)于相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要意義。

目前,測(cè)定半胱氨酸含量的方法有分光光度法[4-5]、熒光光譜法[6-7]、電化學(xué)法[8-9]、高效液相色譜法[10-11]、滴定法[12-13]等,這些方法大多需要高精密儀器,操作繁瑣。共振光散射光譜法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、省時(shí)、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),相關(guān)應(yīng)用也比較多[14-15],但是在半胱氨酸檢測(cè)中的應(yīng)用較少。在弱酸性伯瑞坦-羅賓森(B-R)緩沖溶液中,Fe(Ⅲ)與1個(gè)鄰菲啰啉分子和4個(gè)水分子形成配合物陽離子,該配合物陽離子之間通過氫鍵形成配合物聚集體,從而產(chǎn)生共振光散射現(xiàn)象,在308 nm處出現(xiàn)強(qiáng)共振光散射峰[16]。當(dāng)上述體系中存在半胱氨酸時(shí),半胱氨酸能將溶液中游離的Fe(Ⅲ)還原成Fe(II)[17],Fe(II)奪取配合物聚集體中的鄰菲啰啉,發(fā)生金屬離子交換配位反應(yīng),使配合物聚集體解體,并形成更穩(wěn)定的三鄰菲啰啉亞鐵配合物陽離子[Fe(C12H18N2)3]2+[16],導(dǎo)致體系共振光散射強(qiáng)度降低?；谏鲜鲎饔脵C(jī)理,本工作提出了基于半胱氨酸-Fe(Ⅲ)-鄰菲啰啉體系的共振光散射光譜法測(cè)定半胱氨酸含量的方法,并將其應(yīng)用于半胱氨酸膠囊的分析。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-7000型熒光分光光度計(jì);BS210S型電子天平。

半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L-1,取適量半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解和稀釋,搖勻備用。

半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間液:10.0 mg·L-1,取適量半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用水稀釋100倍,搖勻備用。

Fe(Ⅲ)溶液:取適量六水合氯化鐵,加入2 mL鹽酸,用水稀釋,配制成2.00 g·L-1Fe(Ⅲ)溶液。使用時(shí),用水稀釋成10.0 mg·L-1Fe(Ⅲ)溶液。

鄰菲啰啉溶液:10.0 mg·L-1,取適量鄰菲啰啉,用水溶解和稀釋而成。

B-R緩沖溶液:pH 6.59,參考文獻(xiàn)[18]配制。

半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,純度不小于98.5%;六水合氯化鐵、鹽酸等試驗(yàn)所用試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。半胱氨酸膠囊中的半胱氨酸標(biāo)示量為72 mg·粒-1,批號(hào)分別為20210301和20211001。

1.2 試驗(yàn)方法

取2批半胱氨酸膠囊各5粒,將內(nèi)容物分別混合均勻后,分取適量樣品(相當(dāng)于半胱氨酸4.00 mg)于燒杯中,用水溶解,轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中,用水定容至100 mL。用濾紙過濾,初濾液棄去,分取1.00 mL續(xù)濾液置于10 mL棕色容量瓶中,用水定容,制得4.00 mg·L-1的半胱氨酸樣品溶液。分取1.00 mL半胱氨酸樣品溶液、1.50 mL 10.0 mg·L-1的Fe(Ⅲ)溶液、1.00 mL B-R緩沖溶液(pH 6.59)、2.00 mL 10.0 mg·L-1鄰菲啰啉溶液于10 mL比色管中,以水定容,搖勻,室溫反應(yīng)10 min,待測(cè)。隨同制備試劑空白。

分別取適量待測(cè)溶液和試劑空白置于1 cm石英比色皿中,調(diào)節(jié)儀器激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)(λ)相等,狹縫寬度為5 nm,掃描200～800 nm內(nèi)共振光散射光譜,記錄上述熒光體系在308 nm處的共振光散射強(qiáng)度I和I0,并計(jì)算共振光散射強(qiáng)度差值ΔI(ΔI=I-I0),利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

含0, 0.40, 0.80, 1.00, 1.20 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的共振光散射光譜圖見圖1。

曲線1～5對(duì)應(yīng)的半胱氨酸質(zhì)量濃度分別為0, 0.40, 0.80, 1.00, 1.20 mg·L-1

由圖1可知,熒光體系中的最大共振光散射峰出現(xiàn)在308 nm處,且308 nm處的共振光散射強(qiáng)度隨著半胱氨酸質(zhì)量濃度的增加而逐漸減小,因此試驗(yàn)選擇308 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 緩沖溶液及其酸度、用量的選擇

試驗(yàn)考察了分別以三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸、乙酸-乙酸鈉、B-R等3種緩沖溶液作介質(zhì)時(shí)對(duì)含1.00 mg·L-1半胱氨酸熒光體系ΔI的影響。結(jié)果顯示,熒光體系的ΔI在B-R緩沖溶液中最大,因此試驗(yàn)選擇B-R緩沖溶液進(jìn)行共振散光射光譜測(cè)試。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了B-R緩沖溶液酸度(pH 6.09,6.37, 6.59, 6.80, 7.00, 7.24)和其用量(0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50 mL)對(duì)含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的ΔI的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 B-R緩沖溶液酸度和用量對(duì)熒光體系ΔI的影響Fig.2 Effects of acidity and amount of B-R buffer solution on the ΔI of the fluorescence system

由圖2可知,熒光體系的ΔI在B-R緩沖溶液的酸度為pH 6.59以及用量為0.75～1.00 mL時(shí)最大。因此,試驗(yàn)選擇B-R緩沖溶液酸度為pH 6.59,用量為1.00 mL。

2.3 Fe(Ⅲ)溶液用量的選擇

試驗(yàn)考察了Fe(Ⅲ)溶液用量分別為0.50, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00 mL時(shí)對(duì)含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的ΔI的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 Fe(Ⅲ)溶液用量對(duì)熒光體系ΔI的影響Fig.3 Effect of amount of Fe(III) solution on the ΔI of the fluorescence system

由圖3可知,熒光體系的ΔI在Fe(Ⅲ)溶液用量為1.50 mL時(shí)最大,因此試驗(yàn)選擇Fe(Ⅲ)溶液用量為1.50 mL。

2.4 鄰菲啰啉溶液用量的選擇

試驗(yàn)考察了鄰菲啰啉溶液用量分別為0.50, 1.00, 1.50, 1.75, 2.00, 2.25, 2.50, 3.00 mL時(shí)對(duì)含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的ΔI的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 鄰菲啰啉溶液用量對(duì)熒光體系ΔI的影響Fig.4 Effect of amount of o-phenanthroline solution on the ΔI of the fluorescence system

由圖4可知,熒光體系的ΔI在鄰菲啰啉溶液用量為2.00 mL時(shí)最大,因此試驗(yàn)選擇鄰菲啰啉溶液用量為2.00 mL。

2.5 反應(yīng)時(shí)間的選擇

試驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間為0～60 min時(shí)對(duì)含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系的共振光散射強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示,反應(yīng)時(shí)間不小于10 min時(shí),熒光體系的ΔI達(dá)到最大且在60 min內(nèi)基本不變,說明本方法的穩(wěn)定性較好。因此,試驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間為10 min。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

分別取0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20 mL 10.0 mg·L-1半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間液于比色管中,按照試驗(yàn)方法測(cè)定, 以處理后熒光體系中半胱氨酸的質(zhì)量濃度(0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20 mg·L-1)為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的ΔI為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示, 半胱氨酸的質(zhì)量濃度在0.20～1.20 mg·L-1內(nèi)和ΔI呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=3 051x+64.13,相關(guān)系數(shù)為0.999 0。

按照試驗(yàn)方法平行測(cè)定試劑空白11次,以3倍I的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k)的比值計(jì)算檢出限(3s/k),結(jié)果為0.09 mg·L-1。

2.7 干擾試驗(yàn)

在分析含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系時(shí),考察了含半胱氨酸質(zhì)量濃度500倍的胱氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、硬脂酸鎂、淀粉、甘氨酸、桂皮酸、L-丙氨酸以及含其質(zhì)量濃度1 000倍的山梨酸、葡萄糖等共存組分對(duì)半胱氨酸測(cè)定的影響。結(jié)果顯示,在相對(duì)誤差絕對(duì)值不超過5.0%條件下,共存組分對(duì)半胱氨酸的測(cè)定不造成干擾,可見本方法對(duì)半胱氨酸的選擇性較好。

2.8 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法重復(fù)分析含1.00 mg·L-1半胱氨酸的熒光體系10次,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示:測(cè)定值的RSD為1.9%,說明儀器精密度較高。

按照試驗(yàn)方法分析2批實(shí)際樣品,并進(jìn)行兩個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算回收率和測(cè)定值的RSD,結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知,不同批號(hào)半胱氨酸膠囊樣品中半胱氨酸的測(cè)定值與標(biāo)示值基本一致,回收率為97.8%～102%,測(cè)定值的RSD均小于3.0%,符合定量分析的要求。

本工作采用基于半胱氨酸-Fe(Ⅲ)-鄰菲啰啉體系的共振光散射光譜法測(cè)定半胱氨酸的含量,方法操作簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、精密度好、準(zhǔn)確度高,可推廣應(yīng)用于食品及其他藥物中半胱氨酸含量的測(cè)定。

致謝：感謝江蘇省品牌專業(yè)二期工程(省特色專業(yè)-藥物制劑,編號(hào)65);2021年江蘇省首批一流本科課程(線下一流課程-藥物分析,序號(hào)104);江蘇海洋大學(xué)研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃(KYCX2021-083)等項(xiàng)目對(duì)本工作的大力支持。