基于銀-硫配位的協(xié)同抗菌水凝膠的制備與性能

劇芳

（合肥工業(yè)大學化學與化工學院，先進催化材料與反應工程安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230009）

眾所周知，抗生素是治療細菌感染的最常見藥物[1]，但隨著抗生素的濫用，細菌等微生物獲得抵抗藥物的能力而產生耐藥性[2]。無機納米顆粒具有廣譜抗菌性且不會產生耐藥性，已被廣泛用于抗菌劑[3]，特別強調的是銀等納米顆粒（Ag NPs）[4]。由于Ag NPs 的比表面積大，同時擁有單質銀與納米尺寸的主要特征，其抑菌能力要明顯大于尺寸大的銀單質，具有廣譜抗菌、高效抗菌以及安全無毒等優(yōu)勢[5]。水凝膠是一種能夠在水中溶脹但不溶解于水的三維網狀結構的高分子材料[6]，擁有與天然軟組織結構相似的細胞外基質[7-8]，可以模擬生物系統(tǒng)中的雙相（水和聚合物）自然環(huán)境，擁有良好的生物相容性[9]。一系列的天然水凝膠（纖維素[10]、透明質酸[11]、海藻酸鹽[12]等）和合成水凝膠（聚丙烯酰胺[13]、聚乙烯醇[14]、聚丙烯酸[15]等）已應用于生活的各個領域。其中聚丙烯酰胺毒性較低，原料價格相對低廉[16]。金屬納米顆粒復合水凝膠具有協(xié)同作用的性質[17]，但限制其廣泛應用的因素是NPs的聚集傾向問題。有研究表明交聯(lián)水凝膠基質可以與NPs 結合[18]，用于穩(wěn)定NPs，使其均勻分散[19]。因此，可以通過聚合物官能團與金屬顆粒之間的電子相互作用提高有機與無機組分在界面的相容性[20-21]。

本文通過簡單有效的化學原位還原方法，避免了其他表面活性劑的污染及提純，制備了一種基于銀-硫配位作用的協(xié)同抗菌水凝膠。首先設計一種乙烯基官能化的線型聚硫醚（P1），再通過巰-烯click 反應引入足夠量的羧基得到P2，賦予其水溶性。由P2 作為表面活性劑，硼氫化鈉將硝酸銀原位還原成Ag NPs。利用P2 聚合物鏈上的硫原子與Ag NPs 相互作用得到復合交聯(lián)劑（Ag NPs@P2），在過硫酸鉀（KPS）的引發(fā)下，與丙烯酰胺（Am）單體通過自由基聚合獲得水凝膠。由于Ag NPs 和P2 的存在，Ag NPs@P2/PAm 復合水凝膠具備協(xié)同抗菌的能力，有望應用于抗菌敷料或其他生物醫(yī)學領域。且Ag NPs 能夠均勻分布在水凝膠中，克服了無機/有機組分極性相差較大的缺陷。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

1-烯丙氧基-2,3-環(huán)氧丙烷（質量分數(shù)99%）、硫氰酸鉀（KSCN，分析純）、丙烯酰胺（Am，分析純）、PBS 緩沖液（1mol/L）、氫化鈣（分析純）和過硫酸鉀（KPS，分析純），阿拉丁化學試劑有限公司；N-甲基吡咯烷酮（NMP，分析純），上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA，質量分數(shù)99%）、對甲苯基異氰酸酯（分析純）、苯硫酚（質量分數(shù)99%）、四丁基氯化銨（分析純）、硼氫化鈉（NaBH4，分析純）、3-巰基丙酸（質量分數(shù)98%），上海麥克林生化科技有限公司；1,2-二氯乙烷（DCE，分析純）、三乙胺（TEA，分析純）、三氯甲烷（CHCl3，分析純）、碳酸氫鈉（NaHCO3，分析純）、乙醚（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）、甲醇（分析純）和正己烷（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；LB 肉湯（生物試劑）和LB 瓊脂粉（生物試劑），生工生物工程股份有限公司；大腸桿菌，華越洋生物科技有限公司；去離子水由Millipore純水儀制備（18.5MΩ·cm）。1,2-二氯乙烷、三乙胺和N-甲基吡咯烷酮在氫化鈣上干燥，并在使用前通過蒸餾純化。

核磁共振波譜儀，600MHz Bruker 型，美國Agilent Technologies 公司；傅里葉紅外光譜儀，Nicolet 型，美國Thermo Nicolet 公司；場發(fā)射透射電子顯微鏡，JEM-2100F 型，日本JEOL 公司；熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡，Gemini 500 型，德國Carl Zeiss AG公司；X射線光電子能譜儀，ESCALAB25 0Xi型，美國Thermo fisher公司；高效液相色譜儀，Waters 2414 型，美國Waters 公司；萬能材料試驗機，Instron 5965A型，美國Instron公司；冷凍干燥機，F(xiàn)D-1A-50型，上海恒逸實業(yè)有限公司；高溫高壓蒸汽滅菌鍋，Hirayama HVE-50型，上海土森視覺科技有限公司；恒溫振蕩器，Crystal IS-RDV1型，河北恒儀電子科技有限公司；400W 紫外燈，保定佳興機電設備廠；真空干燥箱，DZF-6034型，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 線型聚硫醚P2的制備

合成1∶1-烯丙氧基-2,3-環(huán)硫丙烷單體按照文獻方法合成[22]。將0.1mol 的1-烯丙氧基-2,3-環(huán)氧丙烷和0.4mol 的硫氰酸鉀加入到50mL 水中，隨后混合物于40℃反應24h。反應結束后，混合物冷卻至室溫分層，水相用20mL 乙醚萃取3 次，有機相合并后加入無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮，減壓蒸餾后得到1-烯丙氧基-2,3-環(huán)硫丙烷（10.53g，收率81%）。其結構和純度通過核磁共振氫譜確定（圖1），1H NMR (600MHz, CDCl3):δ5.91 (ddt,J1=17.0Hz,J2=10.4Hz,J3=5.7Hz, 1H), 5.29 (ddd,J1=17.3Hz,J2=3.2Hz,J3=1.5Hz, 1H), 5.20 (dd,J1=10.4Hz,J2=1.4Hz, 1H), 4.05 (dd,J1=5.7Hz,J2=1.3Hz, 2H),3.65 (dd,J1=10.7Hz,J2=5.7Hz, 1H), 3.45 (dd,J1=10.6Hz,J2=6.8Hz, 1H), 3.14～3.03 (m, 1H), 2.52 (d,J=6.2Hz, 1H), 2.22 (dd,J1=5.4Hz,J2=1.1Hz, 1H)。

圖1 1-烯丙氧基-2,3-環(huán)氧丙烷（1）的核磁氫譜

合成引發(fā)劑：S-苯基對甲苯基硫代氨基甲酸酯（2）按照文獻方法合成[23]。向25mL兩口瓶中加入10mmol 的對甲苯基異氰酸酯、10mmol 的苯硫酚、10mmol的無水三乙胺和10mL的無水1,2-二氯乙烷。于25℃下攪拌30min后，將反應后的溶液倒入100mL 正己烷中，析出白色固體。抽濾后所得固體置于正己烷與三氯甲烷的混合溶劑中重結晶，純化得到白色固體（1.82, 收率75%）。其核磁氫譜如圖2 所示，1H NMR (600MHz, CDCl3):δ7.64～7.62(m, 1H), 7.49～7.46 (m, 3H), 7.39～7.36 (m, 1H), 7.28～7.27 (m, 1H), 7.13～7.08 (m, 2H), 7.04 (s, 1H), 2.47 (s,1H), 2.31 (d,J=9.9Hz, 3H)。

圖2 引發(fā)劑S-苯基對甲苯基硫代氨基甲酸酯（2）的核磁氫譜

合成P1：線型聚硫醚P1采用陰離子開環(huán)聚合方法制備[23]。將1mmol的S-苯基對甲苯基硫代氨基甲酸酯、40mmol 的1-烯丙氧基-2,3-環(huán)硫丙烷、1.0mmol 的四丁基氯化銨和5.2mL 的NMP 加入到10mL的聚合瓶中。聚合瓶用液氮冷凍-解凍置換氮氣-密封循環(huán)3次，然后在60℃下反應24h。冷卻至室溫，粗產物用大量甲醇沉淀3次，室溫下真空干燥72h，得到線性聚硫醚P1 為無色黏稠液體（5.18g, 收率95%），其核磁氫譜及凝膠滲透色譜如圖3、圖4 所示。1H NMR (600MHz, CDCl3):δ7.37(d,J=8.0Hz, 3H), 7.28 (d,J=7.8Hz, 4H), 7.18 (d,J=7.3Hz, 1H), 7.10 (d,J=8.1Hz, 2H), 5.89 (ddd,J1=22.2Hz,J2=10.6Hz,J3=5.4Hz, 38H), 5.27 (d,J=17.2Hz, 38H), 5.17 (d,J=10.2Hz, 38H), 3.99 (d,J=5.2Hz, 76H), 3.70～3.64 (m, 38H), 3.60 (dd,J1=9.3Hz,J2=6.3Hz, 38H), 2.96 (dd,J1=24.4Hz,J2=7.7Hz, 76H),2.92～2.83 (m, 38H), 2.30 (s, 3H).Mn=4.1kDa, 聚合物分散系數(shù)（PDI）= 1.09。

圖3 線型聚硫醚P1的核磁氫譜

圖4 線型聚硫醚P1的凝膠滲透色譜

合成P2：由于制備的線型聚硫醚P1 不溶于水，為了賦予其水溶性，將P1 上的部分雙鍵通過巰-烯click 反應得到羧基官能化的線型聚硫醚P2。其合成路線如圖5 所示。具體合成步驟如下：將40mmol（雙鍵含量）的P1、8mmol 的2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、32mmol 的3-巰基丙酸和20mL的無水NMP加入到50mL的單口瓶中，然后把溶液鼓30min氮氣除去瓶內氧氣，在365nm紫外燈下室溫光照3h，得到部分側鏈帶有羧基的線性聚硫醚P2 混合物。再向混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，直至不冒泡為止，使得側基羧酸完全轉化為羧酸鈉。同時混合物中有大量白色固體析出，抽濾后收集濾液，將濾液裝入到截留分子量為3500 的透析袋中，在去離子水中透析2天，期間每隔6h換一次水，最后經過冷凍干燥得到P2 為淡黃色的固體（7.91g, 收率83%）。

圖5 線型聚硫醚P2的合成路線

1.3 銀納米顆粒的制備

Ag NPs@P2 采用簡單有效的化學原位還原法制備（圖6）。主要機理是以硝酸銀為銀源，P2 作為表面活性劑。在制備Ag NPs 的過程中，P2 聚合物鏈上含有大量的羧酸鈉，具有一定的化學活性。當硝酸銀加入到P2溶液時，P2能夠與銀離子形成羧酸銀，把銀離子束縛在P2 分子上，減弱了Ag+的游離能力。再加入還原劑時，Ag+被原位還原成銀單質，使銀原子具有很高的表面活性，在溶液中不斷聚集成Ag NPs。由于P2 聚合物鏈上含有大量的硫原子，能夠通過銀-硫配位作用將Ag NPs包裹在其中，從而起到了很好的穩(wěn)定和保護的作用。

圖6 Ag NPs@P2的制備過程

具體操作如下：向100mL兩口瓶中加入500mg的P2、0.25mmol 硝酸銀與20mL 去離子水，攪拌0.5h 后用注射器向溶液中緩慢加入5mL 的1mol/L NaBH4水溶液，于室溫下繼續(xù)攪拌12h。反應結束后溶液由淡黃色變成黑色，標志著Ag NPs的形成。將混合溶液裝入到截留分子量為3500 的透析中，用去離子水透析2天，期間每隔6h換一次水。最后變?yōu)榧t棕色的Ag NPs@P2 溶液，冷凍干燥后得到黑色固體。

1.4 AgNPs@P2/PAm復合水凝膠的制備

將0.6mmol 的KPS 與21mmol 的Am 溶于3.5mL去離子水中，稱量5組相同的藥品后再向其中分別加入30mg 的P2 和30mg、60mg、120mg、180mg 的Ag NPs@P2。將混合溶液分別轉移至聚四氟乙烯材質的圓柱狀模具中，在氮氣氣氛中65℃反應2h，即可得到5組Ag NPs@P2/PAm復合水凝膠樣品。

1.5 AgNPs@P2/PAm復合水凝膠的抗菌實驗

LB 液體培養(yǎng)基的配制：量取100mL 去離子水倒入250mL 錐形瓶中，加入2.5g 的LB 肉湯培養(yǎng)基混合均勻后，置于121℃高溫高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌15min后備用。

LB 固體培養(yǎng)基的制備：量取100mL 去離子水倒入250mL 錐形瓶中，加入2.5g 的LB 肉湯培養(yǎng)基和1.5g 瓊脂粉，混合均勻后置于121℃高溫高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌處理15min。待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，用移液管吸取15mL 培養(yǎng)基倒入一次性無菌表面皿中。

細菌懸液的制備：向兩支12mL 細菌培養(yǎng)管中各加入3mL 的LB 液體培養(yǎng)基，再從大腸桿菌固體培養(yǎng)基上挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，另一支作為空白對照。放于200r/min恒溫振蕩器37℃下過夜培養(yǎng)15h。

抗菌性能測試：采用抑菌圈測試法，用無菌PBS 溶液將大腸桿菌菌液稀釋至1×106CFU/mL，吸取100μL 均勻涂布于LB 固體瓊脂培養(yǎng)基表面。將5組樣品（8mm×5mm圓柱體）分別放至培養(yǎng)基上，并用無菌鑷子輕輕按壓，使樣品與培養(yǎng)基充分接觸。最后將培養(yǎng)皿轉移至37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)完成后測量記錄各個抑菌圈大小，每組樣品做3次平行實驗。

1.6 Ag NPs@P2/PAm 復合水凝膠的力學性能實驗

拉伸樣品參照GB/T 1040—92 Ⅱ型標準制樣，以GB/T 1040.3—2006 方法使用萬能材料試驗機對5 組樣條的力學性能進行3 次平行測試，拉伸速度為100mm/min。

2 結果與討論

2.1 Ag NPs@P2/PAm水凝膠的設計

Ag NPs@P2/PAm 復合水凝膠采用常規(guī)的自由基聚合制備（圖7）。主要思路是：作為表面活性劑的P2 側鏈還殘留未反應完全的雙鍵，與Ag NPs通過銀-硫配位作用后得到的Ag NPs@P2可作為復合交聯(lián)劑，將其與Am 及KPS 在水中混合溶解后，注入到聚四氟乙烯模具中，在氮氣氣氛中原位聚合得到Ag NPs@P2/PAm 水凝膠。該水凝膠中聚合物鏈與Ag NPs 通過銀-硫相互作用“黏結”在一起，阻止Ag NPs沉降聚集，使其均勻分散在水凝膠中。除此之外，聚合物鏈中還含有氨基和羧基，這些基團之間和水會形成豐富的氫鍵，防止分子鏈滑移，保證水凝膠具有一定的力學性能，在使用過程中不易被損壞。

圖7 Ag NPs@P2/PAm復合水凝膠的合成工藝及內部結構

2.2 線性聚硫醚P1和P2的結構表征

線性聚硫醚P2 是通過P1 巰-烯click 化學反應得到。由圖8中可以看出，在3000cm-1附近出現(xiàn)了不飽和雙鍵—C—H伸縮振動峰，1713～1615cm-1為不飽和雙鍵C= = C上的伸縮振動峰。然后將P1上的部分雙鍵與3-巰基丙酸在無水無氧的條件下進行巰-烯click 化學反應，為P1 引入足夠的羧基，此時P1 的水溶性還相對較弱。再將羧基與過量的碳酸氫鈉反應，溶液透析后呈堿性，得到水溶性的線性聚硫醚P2。從圖8 可以看到在1572cm-1和1415cm-1出現(xiàn)了羧酸鹽的吸收特征峰。證明在P2聚合物鏈上成功引入羧酸基團。

圖8 P1與P2的紅外光譜

2.3 Ag NPs@P2形貌與結構表征

通過TEM 對Ag NPs@P2 的形貌和尺寸進行了表征。從圖9可以觀察到產物近似球形顆粒，且粒徑范圍為5～20nm。粒徑尺寸分布不均勻可能是因為NaBH4的還原性較強，硝酸銀被還原成銀原子的速率較快，銀原子之間的碰撞頻率增加，顆粒尺寸迅速增大，發(fā)生聚集后就會形成尺寸較大的顆粒。由于線性聚硫醚P2 的存在，較大尺寸的顆粒可能基于銀-硫配位作用而被刻蝕成小尺寸Ag NPs。

圖9 Ag NPs的TEM圖像

還通過X 射線光電子能譜（XPS）對合成的Ag NPs@P2做進一步的測試和表征。如圖10所示，結合能為367.7eV 和373.6eV 分別對應著Ag0的Ag 3d5/2與Ag 3d3/2，證明了Ag NPs 的形成。此外，其Ag 3d5/2的結合能要小于不含表面活性劑的Ag NPs（368.5eV)，而結合能為163.1eV 對應著S 2p，略高于典型的硫醇鹽S 2p的結合能（162.0eV），這些結果表明銀與硫之間形成了配位鍵，最終被還原的產物為Ag NPs@P2。與傳統(tǒng)的Ag NPs相比，基于銀-硫配位作用P2 聚合物上的硫原子能夠保證其穩(wěn)定性。

圖10 Ag NPs@P2中Ag 3d與S 2p的XPS圖

2.4 Ag NPs@P2/PAm水凝膠的結構與形貌表征

通過熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡對液氮焠斷后冷凍干燥的凝膠樣品橫斷面進行形貌表征，觀察到規(guī)整的網絡多孔結構，這是典型的干凝膠形貌［圖11(a)］，多孔結構為Ag NPs 或Ag+的移動和擴散提供了空間。通過對同一處橫斷面進行元素分布分析來研究Ag NPs 的分布情況，可以看出來自Ag NPs@P2 的Ag 和S 元素均勻分布在水凝膠中［圖11(b)～(d)］，則證明了Ag NPs@P2 與單體Am 聚合過程中沒有發(fā)生聚集。

圖11 Ag NPs@P2/PAm水凝膠的SEM圖及Ag和S復合、Ag和S的元素分布圖

使用Ag NPs@P2 作為交聯(lián)劑有兩個優(yōu)點：一方面，親水性的P2 用于表面改性Ag NPs；另一方面，Ag NPs@P2本身作為交聯(lián)劑，可以在聚合后均勻分散到整個水凝膠網絡中。

2.5 Ag NPs@P2/PAm復合水凝膠的抗菌性能

受傷的皮膚容易受到細菌的侵害而造成細菌感染，不利于傷口愈合，使用抗菌水凝膠可以有效防止傷口感染，促進傷口愈合[24]。選取常用的大腸桿菌作為菌種來源，對Ag NPs@P2/PAm 復合水凝膠進行抗菌性能測試。由圖12可知，5組測試樣品對大腸桿菌均有顯著的抗菌效果，其中質量分數(shù)為2%的Ag NPs@P2/PAm水凝膠抑菌圈直徑最大，直達19mm（表1）。隨著Ag NPs@P2含量的增加，抑菌圈直徑先增大后減小。這是因為水凝膠的交聯(lián)密度隨著Ag NPs@P2 含量的增加而增加，導致相同直徑但孔徑尺寸較小的水凝膠內部Ag NPs或Ag+很難擴散到培養(yǎng)基表面。除此之外，交聯(lián)密度增加，水凝膠的溶脹響應速率減慢，24h后體積變化逐漸不明顯。而交聯(lián)密度低的水凝膠體積增大速率較快，其孔隙尺寸的增長速率也相對較快，使得Ag NPs或Ag+能夠以更快的速度擴散到細菌培養(yǎng)基上，所以抑菌圈較大。

表1 5組樣品的抑菌圈直徑

然而到目前為止，Ag NPs 的抗菌機制仍然飽受爭議。針對于Ag NPs@P2/PAm 水凝膠，Ag NPs的抗菌機制可能是其在水凝膠和溶液中難免會部分氧化成Ag+，Ag NPs 和Ag+再與帶負電的細菌細胞壁反應，導致細菌細胞壁和細胞膜結構發(fā)生變化，細胞膜的滲透性改變引起了細胞質的成分流失。不僅如此，更方便了Ag NPs和Ag+進入細胞質中，可以抑制DNA 結構復制以及各種酶的活性，最終多種作用機制共同產生抑菌效果。

值得注意的是，未加入Ag NPs 的水凝膠在大腸桿菌培養(yǎng)基上也會產生抑菌圈，直徑為9mm（表1），甚至比添加質量分數(shù)為8%的Ag NPs@P2水凝膠的抑菌圈還要大。這可能是由于P2 聚合物鏈上有帶正電的陽離子，使帶負電的細菌吸附在其表面，依靠靜電作用和氫鍵配位作用與絕大部分的細菌結合，兩者結合后很難產生變異，最終破壞細菌的細胞膜，導致細菌死亡，從而具有一定的抑菌能力。

其中Ag NPs@P2 的含量是相對于單體的質量比，而質量分數(shù)為0的AgNPs@P2是用質量分數(shù)為2%的P2代替，不含Ag NPs。

2.6 Ag NPs@P2/PAm復合水凝膠的力學性能

抗菌水凝膠不僅要具備良好的抗菌能力，還要具有一定的力學性能，防止其在使用過程中受到外力作用時遭到損壞。于是對5 組不同含量的AgNPs@P2水凝膠進行了力學性能測試，圖13表明加入Ag NPs@P2 可顯著改善水凝膠的拉伸性能。且抗菌效果最好的水凝膠（質量分數(shù)2%）的拉伸強度為0.12MPa，比皮膚的楊氏模量（0.01～0.1MPa）稍大一些。在一定范圍內提高Ag NPs@P2負載量，水凝膠的斷裂強度和斷裂伸長率會同時增加，這是因為交聯(lián)密度增加且Ag NPs 在水凝膠中可以通過耗散能量來減弱應力集中效應產生的影響。

圖13 Ag NPs@P2/PAm水凝膠在不同質量分數(shù)的AgNPs@P2含量（0～12%）條件下的應力-應變曲線

未摻雜Ag NPs只有P2作為交聯(lián)劑的PAm水凝膠具備一定的強度是因為其中包含物理交聯(lián)作用和氫鍵作用，而摻雜Ag NPs@P2的水凝膠會基于銀-硫配位作用顯著提高其斷裂伸長率。當交聯(lián)劑增加至質量分數(shù)為12%時，水凝膠斷裂強度增強，但斷裂伸長率減小。這是因為交聯(lián)密度過高會抑制分子鏈間的滑移，使水凝膠無法充分耗散內部應力，反而造成應力集中，更容易斷裂?？偠灾?，摻入Ag NPs@P2可以有效改善PAm水凝膠的力學性能。

3 結論

由于P2的存在，硼氫化鈉將硝酸銀原位還原成Ag NPs，避免了其他表面活性劑的污染。XPS和TEM 證實了成功制備出Ag NPs，粒徑尺寸基本上小于20nm，且XPS分析證明Ag NPs與表面的P2聚合物鏈中的硫元素形成銀-硫配位鍵。SEM 說明Ag NPs@P2與單體丙烯酰胺在聚合過程中未發(fā)生團聚現(xiàn)象，改善了無機納米顆粒與有機聚合物間的相容性?？咕鷮嶒灲Y果表明即使只添加P2的PAm 水凝膠也具備一定的抗菌能力，而負載質量分數(shù)為2%的Ag NPs@P2抑菌效果最好，因此Ag NPs@P2/PAm 水凝膠具有協(xié)同抗菌的能力。且添加Ag NPs@P2的水凝膠會形成致密的網絡，可以提高水凝膠的力學性能，使其擁有與人體皮膚相當?shù)臈钍夏Ａ浚?.01～0.1MPa），有望應用于皮膚抗菌敷料等領域。通過該方法制備的抗菌水凝膠克服了傳統(tǒng)抗生素水凝膠的耐藥性問題,為制備新型協(xié)同抗菌水凝膠提供了一種新思路。

符號說明

J—— 耦合常數(shù)，Hz

Mn—— 數(shù)均分子量，kDa

δ—— 峰的化學位移