環(huán)狀RNA與m6A修飾調(diào)控惡性腫瘤作用研究進展

王寅格，李丹秀，張文堯，楊桃，靳海峰

（1.河北工程大學 臨床醫(yī)學院，河北 邯鄲 056009；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院 消化內(nèi)科，河北石家莊 050081；3.中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學 西京消化病醫(yī)院/國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心和消化系腫瘤整合防治全國重點實驗室，陜西 西安 710032；4. 貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 肛腸科，貴州 貴陽 550001）

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）目前被歸類為非編碼RNA，其獨特的共價閉合連續(xù)環(huán)結(jié)構(gòu)，有效地阻止RNA 核酸外切酶降解，該結(jié)構(gòu)使circRNA 集中分布在細胞質(zhì)中。隨著高通量RNA 測序和circRNA 計算工具的開發(fā)，circRNA 的結(jié)構(gòu)、進化、功能、組織特異性特征被逐漸揭示[1]。越來越多研究[2]證實，circRNA 在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是真核生物mRNA 中最豐富的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄修飾，通過m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶“寫入器（writers） ”、m6A 去甲基化酶“擦除器（erasers）”和m6A 閱讀蛋白“閱讀器（readers）”三者之間動態(tài)相互作用，維持細胞內(nèi)m6A 穩(wěn)態(tài)。m6A 修飾失調(diào)可影響circRNA 轉(zhuǎn)錄后過程，包括生物合成、核輸出、降解、翻譯和先天免疫反應(yīng)等。而circRNA 也可反向調(diào)節(jié)m6A 修飾，共同調(diào)控靶分子表達，影響腫瘤進展。本文總結(jié)分析m6A 修飾和circRNA 間的相互作用，及其對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，以期為腫瘤精準診療與藥物研發(fā)提供新思路。

1 CircRNA概述

CircRNA 是一類不含5'端帽結(jié)構(gòu)和3'poly（A）尾，由共價鍵相連的環(huán)狀單鏈RNA[2]。根據(jù)來源不同可分為四類：外顯子circRNA（ecircRNA）、內(nèi)含子circRNA （ciRNA）、 外顯子- 內(nèi)含子circRNA（eiciRNA） 和tRNA 內(nèi)含子circRNA (tricRNA)[3]。不同于線性RNA 的標準剪接模式，circRNA 是通過反向剪接方式形成。circRNA 環(huán)化機制主要有三種：套索驅(qū)動的環(huán)化、RNA 結(jié)合蛋白相關(guān)的環(huán)化和內(nèi)含子配對環(huán)化[4]。目前已知circRNA 的生物學功能主要有以下四種：⑴ 充當microRNA（miRNA）分子海綿[5]；⑵ 與RNA 結(jié)合蛋白互作[6]；⑶ 翻譯表達多肽或蛋白[7]；⑷ 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和剪接[8]。上述特殊結(jié)構(gòu)與多重生物學功能使circRNA 在腫瘤診斷、治療和預(yù)后中的作用備受關(guān)注。

2 m6A甲基化修飾機制

m6A 修飾指RNA 腺苷酸（A） 第6 個氮（N）原子甲基化。m6A 修飾酶主要分為三類：催化m6A甲基化的“寫入器”、優(yōu)先結(jié)合m6A 的“閱讀器”，以及逆轉(zhuǎn)m6A 甲基化的“擦除器”（圖1）。近期，He 等[9]鑒定發(fā)現(xiàn)一類新型甲基化酶—外顯子拼接復(fù)合體（exon junction complexes，EJCs），EJCs 作為m6A“抑制器”調(diào)控mRNA m6A 區(qū)域選擇性，從而決定m6A 整體表觀組分布特異性。

m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶功能主要通過甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（methyltransferase complex，MTC）實現(xiàn)，MTC由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3 （methyltransferase-like3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14（methyltransferaselike14，METTL14）、腫瘤1 相關(guān)蛋白（Wilms' tumor 1-associated protein，WTAP）3 個核心成分，以及病毒樣m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白（virus-like m6A methyltransferase-associated protein，VIRMA）、含鋅指CCCH 型 13 （zinc finger CCCH domain-containing protein， ZC3H13）、 RNA 結(jié)合基序蛋白15/15B（RNA-binding motif protein15，RBM15/15B） 和環(huán)指E3 泛素連接酶（RING-finger type E3 ubiquitin ligase，HAKAI） 4 個調(diào)節(jié)亞基組成。結(jié)構(gòu)分析表明，METTL14 本身不具有甲基轉(zhuǎn)移能力，但能與METTL3 以1∶1 的比例，形成穩(wěn)定異源二聚體與RNA 結(jié)合[10]。WTAP 能誘導(dǎo)METTL3-METTL14 復(fù)合物定位于核斑點上并促進催化活性[11]。RBM15/15B功能是與尿嘧啶富集區(qū)域結(jié)合，促進RNA 甲基化。VIRMA 作為支架蛋白，綁定MTC 并將其招募到特定RNA 區(qū)域[12]。METTL16 （methyltransferase-like16，METTL16）是獨立m6A 甲基化酶，主要調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和剪切過程[13]。

脂肪肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesityassociated protein，F(xiàn)TO） 和alkB 同系物5ALKBH5（alkB homolog 5，ALKBH5） 是目前鑒定出的兩種獨立m6A 去甲基化酶，能夠識別單鏈DNA 和RNA分子中腺嘌呤和胞嘧啶。FTO 是第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A 去甲基化酶，可調(diào)節(jié)細胞能量穩(wěn)定并與肥胖有關(guān)[14]。ALKBH5 是第二個被鑒定為影響RNA 核輸出和代謝的去甲基化酶，與FTO 不同的是其更具m6A 特異性。

m6A 閱讀蛋白，能特異性識別RNA m6A 修飾位點信息以執(zhí)行不同的生物功能。常見的閱讀子包括YT521-B 同源（YT521-B homology，YTH）結(jié)構(gòu)域家族成員（YTHDC1/2、YTHDF1/2/3）、胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白（insulin like growth factor 2 mRNA binding proteins，IGF2BPs）、核不均一 核 糖 核 蛋 白 C （heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNP）家族蛋白（HNRNPA2B1、HNRNPC、 HNRNPG）、 真核生物起始因子3（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3）、富含脯氨酸的卷曲螺旋2A （proline rich coiled-coil 2A，Prrc2a） 和脆性X 智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP）等。閱讀蛋白通過特異性結(jié)合m6A 位點，改變RNA 二級結(jié)構(gòu)影響蛋白與RNA 互作。YTHDF1 可促進RNA 翻譯[15]，YTHDF2則相反，可調(diào)節(jié)RNA 降解[16]，YTHDF3 與YTHDF1和YTHDF2 合作介導(dǎo)m6A-mRNA 降解[17]。YTHDC1有助于RNA 剪接和輸出。YTHDC2 是一種RNA 解旋酶， 提高翻譯效率， 降低mRNA 豐度[18]。IGF2BPs 可調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯[19]。HNRNP家族可調(diào)節(jié)RNA 選擇性剪接和結(jié)構(gòu)變化，其中，HNRNPA2B1 被認為是抗病毒免疫中的核DNA 傳感器[20]。Prrc2a 通過m6A 依賴性方式穩(wěn)定mRNA 表達[21]。此外，F(xiàn)MRP 作為新型m6A 的閱讀子，可促進細胞核輸出[22]。

3 m6A修飾與circRNA的相互調(diào)控作用

3.1 m6A修飾介導(dǎo)circRNA生物發(fā)生

m6A 與circRNA 生成和高級結(jié)構(gòu)的關(guān)系此前一直鮮有報道。近期報道circZNF609 的生成效率由特定m6A 控制，并且需要METTL3 和YTHDC1 來指導(dǎo)反向剪接[23]。Tang 等[24]在雄性生殖細胞中發(fā)現(xiàn)了m6A 修飾參與一些具有編碼功能的circRNA 的生成過程，并且揭示這些circRNA 能穩(wěn)定和持久地產(chǎn)生蛋白。circDDIT4 環(huán)形側(cè)翼序列中存在多個m6A 修飾位點，MTC 介導(dǎo)circDDIT4 生物生成可促進前列腺癌細胞凋亡， 而FTO 通過去甲基化降低circDDIT4 水平[25]。

3.2 m6A修飾促進circRNA核輸出

circRNA 核輸出過程受果蠅Hel25E 的DDX 解旋酶及其哺乳動物同源物DDX39A （URH49） 和DDX39B （UAP56） 調(diào)節(jié)，URH49 和UAP56 分別調(diào)節(jié)短（＜400 nt）和長（＞1 200 nt）circRNA 定位[26]。研究表明，含有內(nèi)含子的circRNA 常被隔離在細胞核中，細胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)可驅(qū)動其核輸出，參與腫瘤轉(zhuǎn)移。Chen 等[27]首次闡明circNSUN2 核輸出由YTHDC1 以m6A 依賴的方式介導(dǎo)，使circNSUN2 在細胞質(zhì)表達增加，并通過形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA 三元復(fù)合物，增強HMGA2 mRNA 穩(wěn)定性，導(dǎo)致結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移。METTL14 參與circFUT8的m6A 修飾，YTHDC1 識別并促進circFUT8 轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)[28]。m6A 修飾促進circRNA 出核，是circRNA修飾研究的重要進展，其具體調(diào)控機制及潛在生物學功能還有待挖掘。

3.3 m6A修飾誘導(dǎo)circRNA降解

circRNA 因其閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被水解，比親本線性RNA 更加穩(wěn)定。目前只鑒定出少數(shù)circRNA 降解途徑， 例如miR-671 以argonaute 2（Ago2）依賴方式誘導(dǎo)ciRS-7 降解[29]。RNA 結(jié)合蛋白UPF1 和G3BP1 也可與circRNA 高度結(jié)構(gòu)化堿基對區(qū)域結(jié)合，直接降解circRNA[30]。

m6A 修飾是介導(dǎo)circRNA 降解的重要途徑之一，circRNA 使用m6A 作為標記物來募集YTHDF2和HRSP12 蛋白，HRSP12 直接與circRNA 上GGUUC模式結(jié)合，并充當橋梁將YTHDF2 和核酸內(nèi)切酶RNase P/MRP 結(jié)合， 從而使RNase P/MRP 啟動circRNA 降解[31]。乙型肝炎蛋白x （HBx） 促進RBM15 表達增加circRNA cFAM210A 的m6A 水平，通過 YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP 途徑誘導(dǎo)cFAM210A 降解[32]。Wang 等[33]發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中YTHDF2 加速circASK1 降解，抑制細胞凋亡，進一步促進吉非替尼耐藥。circ3823 通過circ3823/miR-30c-5p/TCF7 軸促進結(jié)直腸癌進展，其中YTHDF3 和ALKBH5 可共同調(diào)控circ3823 降解速率[34]。

3.4 m6A修飾驅(qū)動circRNA翻譯

circRNA 由于缺乏5'帽子結(jié)構(gòu)一直被認為無翻譯功能，隨著研究深入發(fā)現(xiàn)circRNA 不僅能夠與核糖體結(jié)合，并且含有AUG 起始密碼子序列和開放閱讀框序列的基本編碼翻譯元件[35]，揭示其具有編碼多肽或蛋白質(zhì)潛力。circRNA 翻譯模式主要包括核糖體介入位點IRES 介導(dǎo)的翻譯、m6A 修飾后翻譯、滾環(huán)擴增翻譯和由UTR 激活元件誘導(dǎo)的翻譯[36]。Yang 等[37]在m6A 基序處構(gòu)建突變體，m6A驅(qū)動的翻譯在熱休克或METTL3/14 過表達應(yīng)激條件下被激活，該過程需要eIF4G2 和YTHDF3 輔助，可被FTO 抑制，證實了m6A 修飾可以驅(qū)動circRNA 翻譯。Li 等[38]報道，circARHGAP35 由HNRNPL 介導(dǎo)生成，翻譯1289aa 蛋白，功能與ARHGAP35 相反，具有促癌作用。Zhao 等[39]發(fā)現(xiàn)，circE7 是人乳頭狀瘤病毒產(chǎn)生的一種編碼癌蛋白的circRNA，與宮頸癌細胞增殖密切相關(guān)，而m6A 修飾是circE7 蛋白質(zhì)編碼能力必要基序。

3.5 m6A修飾的circRNA影響先天免疫

circRNA 是誘導(dǎo)抗原特異性T 細胞激活、抗體產(chǎn)生和體內(nèi)抗腫瘤免疫強效佐劑，直接觸發(fā)維甲酸誘導(dǎo)基因I （retinoic acid induced gene I，RIG-I）信號， 促進免疫激活。 m6A-circRNA 可招募YTHDF2 與RIG-I 形成復(fù)合物，導(dǎo)致circRNA 降解和先天免疫反應(yīng)抑制[40-41]。Li 等[42]證實circNDUFB2 通過形成TRIM25/circNDUFB2/IGF2BPs 三元復(fù)合物促進IGF2BPs 泛素化降解，激活RIG-I-線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）信號級聯(lián)，將免疫細胞募集到腫瘤微環(huán)境中，最終破壞IGF2BPs 穩(wěn)定性和激活免疫反應(yīng)抑制非小細胞肺癌進展，該研究初步明確了circRNA 激活抗腫瘤免疫的機制。免疫檢查點阻斷療法（ICBs）阻斷PD-1 及其配體PD-L1 顯示出對晚期非小細胞肺癌治療的巨大益處。然而，大量患者對ICBs 反應(yīng)不佳，對PD-1 治療產(chǎn)生耐藥性。Liu 等[43]報道METTL3 介導(dǎo)circIGF2BP3 的m6A 修飾，以依賴于YTHDC1 方式促進其環(huán)化，circIGF2BP3 減少PD-L1 泛素化和蛋白酶體降解，加速腫瘤免疫逃逸，揭示了circIGF2BP3 在晚期肺癌抗PD-L1 治療調(diào)控新機制。

3.6 circRNA異常表達影響m6A修飾

m6A 修飾可調(diào)控circRNA 狀態(tài)和生物學功能，而circRNA 異常表達也參與調(diào)控m6A 修飾，繼而影響多種腫瘤進展，該過程主要通過circRNA-miRNA軸實現(xiàn)。 例如， METTL3 被miR-34c-3p 抑制，circMETTL3 作為miR-34c-3p 的吸附海綿，上調(diào)miR-34c-3p 靶基因METTL3 表達抑制乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[44]。另一項研究[45]發(fā)現(xiàn)，circBACH2 通過海綿吸附hsa-miR-944， 影響MAPK 信號通路刺激HNRNPC 表達，促進乳腺癌細胞增殖。Chi 等[46]證實，circMAP2K4 與hsa-miR-139-5p 結(jié)合促進YTHDF1表達，加速肝細胞癌進展。Mo 等[47]報道，hsa_circ_0072309 與miR-607 相互作用上調(diào)FTO 表達，促進非小細胞肺癌發(fā)生。上述研究揭示了circRNAmiRNA-m6A 互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，拓寬了腫瘤中其他非編碼RNA 研究思路。另外，circRNA 也可通過結(jié)合m6A 修飾酶，調(diào)控m6A 修飾過程。Huang 等[48]發(fā)現(xiàn)circSTAG1 可結(jié)合ALKBH5 阻止其入核，影響RNA的m6A 修飾。circGPR137B 在肝細胞癌中顯著下調(diào)，通過miR-4739 調(diào)控FTO 表達，而FTO 又反向影響circGPR137B 的m6A 修飾，形成正反饋通路，抑制癌細胞生長，并且circGPR137B 的下調(diào)或miR-4739的上調(diào)與患者的預(yù)后不良有關(guān)[49]。這種通過circRNA 海綿和m6A 修飾之間功能耦合執(zhí)行的正反饋機制為表觀遺傳學研究提供了一種新模型。

綜上所述，m6A 和circRNA 作為調(diào)控致癌或抑癌基因的關(guān)鍵因子，兩者相互關(guān)聯(lián)，互相調(diào)節(jié)。circRNA 既能被m6A 修飾，也可以通過miRNA 分子海綿或結(jié)合m6A 修飾酶等機制調(diào)控m6A 修飾。但目前研究表明circRNA 不能直接影響m6A 的修改，circRNA-miRNA-m6A 相互作用形成的信號反饋環(huán)值得進一步研究（圖2）。

圖2 腫瘤中circRNA與m6A修飾的相互作用示意圖Figure 2 Illustration of the interaction between circRNAs and m6A modification in tumors

4 circRNA 與m6A 修飾相互作用調(diào)控惡性腫瘤生物學行為

circRNA-m6A 交互網(wǎng)絡(luò)，幾乎參與調(diào)控腫瘤相關(guān)惡性生物學行為所有過程，包括腫瘤增殖、遷移侵襲、轉(zhuǎn)移、干性、耐藥性和免疫微環(huán)境等，在癌癥臨床診斷和治療中起重要作用（表1-2）。

表1 m6A修飾的circRNA在癌癥中的作用Table1 The role of m6A-modified circRNAs in cancer

4.1 增殖、遷移和侵襲

腫瘤的增殖、遷移和侵襲是腫瘤發(fā)生重要驅(qū)動力。 Chen 等[50]報道METTL3 過表達誘導(dǎo)的circ1662 通過加速YAP1 核輸出促進結(jié)直腸癌細胞遷移和侵襲。另一項研究[51]發(fā)現(xiàn)，METTL3 介導(dǎo)的circRNF220 充當miR-330-5p 海綿來上調(diào)生存表達，以促進骨肉瘤進展。Yang 等[52]報道，circMET 通過m6A 依賴式方式出核，促進易位型腎癌增殖，circMET 不僅通過充當miRNA“吸附劑”調(diào)控SMAD3 表達，還可直接與mRNA 結(jié)合調(diào)控CDKN2A mRNA 穩(wěn)定性。YTHDF1 通過增加ALG1 pre-mRNA的m6A 修飾水平，促進circALG1 競爭性內(nèi)源性RNA 作用，增強結(jié)直腸癌細胞侵襲性，circALG1 成為結(jié)直腸癌潛在治療靶點和預(yù)后標志[53]。Du 等[54]報道，circMDK 能招募IGF2BP1，提高轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定性，circMDK 通過海綿吸附miR-346 和miR-874-3p共同靶向ATG16L1，促進肝癌進展。該研究團隊還設(shè)計了有效下調(diào)circMDK 的siRNA，并運用聚（β-氨基酯）（PAEs）陽離子納米粒子，制備有效遞送該siRNA 的PAE-siRNA 復(fù)合物，有望成為一種有前景的肝癌納米治療藥物。

4.2 轉(zhuǎn)移

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中m6A RNA 甲基化修飾發(fā)揮雙刃劍作用，其功能不同可能與不同的靶基因或信號通路有關(guān)。例如，ALKBH5 介導(dǎo)的m6A 修飾circCCDC134 通過增強HIF1A 轉(zhuǎn)錄促進宮頸癌轉(zhuǎn)移[55]。然而，外顯子circPTPRA 作為腫瘤抑制因子，阻斷內(nèi)源性IGF2BP1 對m6A 修飾的RNA 識別，抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移[56]。 同樣， Ding 等[57]發(fā)現(xiàn)，circPDE5A 以WTAP 依賴方式降低EIF3C mRNA m6A水平和mRNA 翻譯效率，WTAP/EIF3C/MAPK 途徑削弱了前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力。

4.3 腫瘤細胞干性

m6A 修飾和circRNA 在腫瘤干細胞自我更新中的作用已有部分研究，例如ALKBH5 介導(dǎo)某些轉(zhuǎn)錄本的3'UTR m6A 甲基化，促進缺氧誘導(dǎo)的HIF 依賴的乳腺癌干細胞表型。近期發(fā)現(xiàn)了一種circRNA，稱為rtcisE2F，在肝臟腫瘤起始細胞（TIC）自我更新中發(fā)揮重要作用[58]， rtcisE2F 能夠和E2F6/E2F3mRNA 及IGF2BP2 相互作用，促進E2F6/E2F3 mRNA 與IGF2BP2 結(jié)合，抑制其與YTHDF2 結(jié)合，通過切換不同m6A 閱讀器與mRNA 結(jié)合，促進mRNA 穩(wěn)定性，該研究首次發(fā)現(xiàn)rtcisE2F-IGF2BP2/YTHDF2-E2F6/E2F3-Wnt/β-catenin 通路驅(qū)動肝臟TIC自我更新以及肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并揭示了circRNA在“m6A mRNA-m6A 閱讀器”結(jié)合過程中關(guān)鍵作用，提供了消除肝癌干細胞潛在策略。

4.4 耐藥

耐藥是癌癥治療主要障礙之一。METTL3 在穩(wěn)定circCUX1 表達方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，circCUX1 通過與caspase1 相互作用進一步抑制caspase 1 表達，抑制炎癥因子（IL-1 和IL-18）釋放，增強下咽鱗狀細胞癌放療耐受性[59]。在肝癌細胞系中，m6A 可穩(wěn)定circRNA-SORE 表達，通過充當miR-103a-2-5p 和miR-660-3p 海綿，競爭性激活Wnt/β-catenin 途徑來誘導(dǎo)索拉非尼耐藥[60]。 在m6A 修飾驅(qū)動下，circMAP3K4 編碼circMAP3K4-455aa，保護肝癌細胞免受順鉑影響，靶向circMAP3K4-455aa 可能對肝癌化療耐藥患者提供一種新的治療策略，預(yù)測不良預(yù)后[61]。

與此同時，circRNA 可反向調(diào)控m6A 修飾參與腫瘤耐藥。circ0008399 與WTAP 以m6A 依賴方式增加靶基因TNFAIP3 mRNA 穩(wěn)定性促進其表達，抑制凋亡，降低膀胱癌對順鉑敏感性[62]。腫瘤能量代謝及氧化還原重編程作為耐藥形成重要內(nèi)環(huán)境機理，在circRNA-m6A 的發(fā)生發(fā)展及其耐藥形成中扮演著重要角色。Ding 等[63]研究闡述，外泌體circ_0072083 可通過Warburg 效應(yīng)下調(diào)ALKBH5 介導(dǎo)的去甲基化，調(diào)控miR-1252-5p/NANOG 軸，增加膠質(zhì)瘤中替莫唑胺抗性。circRHBDD1 通過招募YTHDF1 加速PIK3R1 翻譯，增強與糖酵解高度相關(guān)的PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終影響肝癌抗PD-1 治療療效[64]。在前列腺癌中，EIF4A3 驅(qū)動的circARHGAP29 能夠提高多西他索耐藥前列腺癌的LDHA mRNA 水平。機制上，circARHGAP29 通過與IGF2BP2 相互作用，促進LDHA 介導(dǎo)的糖酵解，穩(wěn)定LDHA 的表達，揭示了circARHGAP29 在多西他賽相關(guān)化療耐藥中的關(guān)鍵作用[65]。如上所述，針對腫瘤化療和放療耐藥性，m6A RNA 甲基化修飾與糖代謝有一定聯(lián)系，但在其他代謝途徑（如脂肪酸、氨基酸代謝）中研究較少，這可能是未來新的研究方向。

4.5 免疫微環(huán)境

circRNA 與m6A 互作參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應(yīng)，部分是通過調(diào)節(jié)PD-1/PD-L1 通路完成。例如，circMYO1C 在胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達，circMYO1C環(huán)化由METTL3 介導(dǎo)，circMYO1C 瞄準PD-L1 mRNA的m6A 位點，與IGF2BP2 合作增強其穩(wěn)定性，從而加速腫瘤免疫逃逸[66]。Wang 等[67]報道卵巢癌中circNFIX 的m6A 修飾升高，其表達與m6A 修飾呈正相關(guān)，并取決于IGF2BPs 識別。此外，circNFIX 作為miR-647 競爭性內(nèi)源性RNA 來上調(diào)IL-6R 表達，激活JAK/STAT3 信號和PD-L1 介導(dǎo)的免疫逃逸。香煙提取物（CSE） 誘導(dǎo)的M2 巨噬細胞外囊泡（EVs） 中的circEML4，被運輸?shù)椒切〖毎伟┘毎?，減少ALKBH5 在細胞核中的分布，導(dǎo)致m6A 修飾增加，從而導(dǎo)致SOCS2 的激活。簡而言之，吸煙者的circEML4 上升，將會加速非小細胞肺癌的惡化，另外，研究[68]還證明了circEML4 下調(diào)，逆轉(zhuǎn)了非小細胞肺癌細胞因EVs 增強的致瘤性和轉(zhuǎn)移性，也就是說戒煙后，非小細胞肺癌細胞有望減緩惡化與轉(zhuǎn)移，該研究揭示了腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）衍生的EVs 中circEML4 在促進非小細胞肺癌進展的生物學意義，為非小細胞肺癌（尤其有吸煙史的患者）提供了一種診斷性生物標志物。膠質(zhì)瘤是最常見的惡性原發(fā)腦腫瘤，具有高免疫抑制的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME），預(yù)后較差。Pan等[69]發(fā)現(xiàn)circNEIL3 通過阻止HECTD4 介導(dǎo)的泛素化穩(wěn)定IGF2BP3 蛋白，circNEIL3 過表達的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞驅(qū)動巨噬細胞浸潤到TME 中，circNEIL3 被hnRNPA2B1 包裝成外泌體并傳遞給TAM，使它們能夠通過穩(wěn)定IGF2BP3 獲得免疫抑制性，進而促進膠質(zhì)瘤進展。

5 臨床應(yīng)用與展望

近年來，關(guān)于m6A 修飾與circRNA 在惡性腫瘤中相互作用相關(guān)報道不斷出現(xiàn)，m6A-circRNA 互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入研究，有望制定個性化治療手段。circRNA 作為下一代RNA 療法的核心，不僅用作生物傳感器，也用作治療例如替代治療性蛋白質(zhì)和多肽。circRNA 可以解決線性RNA 的局限性，比如增加表達持續(xù)時間、穩(wěn)定性以及減少免疫原性，展現(xiàn)了circRNA 作為一種新“程序化藥物”高度穩(wěn)定性和特異差異表達模式下的巨大潛力。在人工智能（AI）賦能加速mRNA 疫苗和藥物研發(fā)的潮流下，Zhang 等[70]通過AI 工具來優(yōu)化mRNA 疫苗序列，幫助創(chuàng)造更有效、更穩(wěn)定mRNA，該研究開發(fā)的線性設(shè)計工具—LinearDesign，可優(yōu)化編碼所有治療性蛋白的mRNA，包括單克隆抗體和抗癌藥物。此外，circRNA 疫苗為未來抗腫瘤免疫治療和逆轉(zhuǎn)治療耐藥性提供了新方向。例如，circRNA 疫苗（VFLIP-X）使用脂肪質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送系統(tǒng)，通過肌肉注射circRNA 進行免疫，在小鼠體內(nèi)能夠針對Sars-CoV2 各種突變體產(chǎn)生強大中和抗體反應(yīng)[71]。由此可見，circRNA 的應(yīng)用潛力之大，為醫(yī)藥領(lǐng)域開拓全新的思路。隨著m6A 檢測技術(shù)如甲基化RNA 免疫沉淀測序（MeRIP-seq）、甲基化iCLIP （miCLIP）、基于m6A 標記的測序（m6Alabel-seq）和多樣性陣列技術(shù)測序（DART-seq）等研發(fā)，陸續(xù)有m6A RNA 甲基化修飾小分子抑制劑被報道。研究[72]發(fā)現(xiàn)了一種新型FTO 抑制劑并對其進行合理設(shè)計和優(yōu)化，其中FTO-43 顯示出與臨床化療藥物5-氟尿嘧啶相當?shù)男Я?。另外，STM2457 被鑒定為具有活性的METTL3 小分子抑制劑，能夠有效抑制急性髓系白血病發(fā)展，對正常造血干細胞是無毒無害，首次證明RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑對體內(nèi)癌癥的活性和治療效果的影響[73]。研究[74]發(fā)現(xiàn)，m6A-circRNA 互作與患者總體生存率密切相關(guān)。METTL14 在胃癌組織樣本中下調(diào)，其低表達提示胃癌患者預(yù)后不良，m6AcircRNA 表觀轉(zhuǎn)錄組微陣列和Me-RIP 將circORC5 識別為METTL14 的下游靶標。METTL14 通過調(diào)節(jié)circORC5/miR-30c-2-3p 軸來抑制胃癌的生長和侵襲，并可能為胃癌提供潛在的治療靶點。Liang 等[75]通過微陣列和生物信息學分析揭示了m6A 修飾的circRNA 的親本基因與結(jié)直腸癌進展相關(guān)，并確定了TPM1 等九個潛在的預(yù)后基因，這些基因表達水平同樣與結(jié)直腸癌預(yù)后呈正相關(guān)。

迄今為止，開發(fā)基于m6A-circRNA 腫瘤治療策略仍具有挑戰(zhàn)性，主要表現(xiàn)在：⑴ circRNA 的純度、遞送載體、免疫原性、藥代動力學和在體內(nèi)的生物分布有待進一步驗證；⑵ 許多m6A 測序新技術(shù)仍停留在實驗階段，檢測穩(wěn)定性及實驗便易程度較差，公認的RNA m6A 修飾水平檢測和應(yīng)用亟需確定；⑶ circRNA-m6A 對腫瘤細胞的影響錯綜復(fù)雜，大多研究聚焦于病理生理基礎(chǔ)研究，兩者在癌癥治療的交叉調(diào)控結(jié)果尚未進行臨床轉(zhuǎn)化。綜上所述，目前迫切需要研發(fā)高效Vehicle 遞送m6A RNA 甲基化抑制劑，如外泌體、LNP、金屬納米材料、高分子材料等。此外，尋求利用藥物化學方法識別具有高活性和高選擇性的特定蛋白小分子調(diào)節(jié)劑將幫助科研人員進一步探索m6A RNA甲基化相關(guān)生物學過程機制的有用工具。最后，加強基礎(chǔ)研究與臨床研究間整合，信息互通，成果共享，為臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用助力。未來，伴隨研究技術(shù)的不斷補充和優(yōu)化，必將加速腫瘤中circRNA 與m6A 修飾之間相互作用網(wǎng)絡(luò)詳細作用機制的探明，有助于更好地提出抗癌新策略，服務(wù)臨床實際治療。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王寅格負責選題，寫作和收集文獻；李丹秀、張文堯負責文章修改；楊桃、靳海峰負責審閱和指導(dǎo)。