秀麗隱桿線蟲在帕金森病研究中的應(yīng)用*

楊玉潔 綜述,李 頔 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部,重慶 400010)

帕金森病(PD)是一種以平衡能力受損、運動遲緩、僵硬和存在靜息性震顫為特征的神經(jīng)運動障礙疾病,是繼阿爾茨海默病之后第二常見的神經(jīng)退行性疾病。PD主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失,殘存的神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)路易小體形成,主要成分為α-突觸核蛋白(α-syn)、泛素等[1],但PD是一種由多因素導(dǎo)致的疾病,其確切的病理機(jī)制還未闡明。

動物模型是研究疾病機(jī)制和藥物篩選的重要載體,穩(wěn)定的動物模型有利于闡明疾病的病因、分子機(jī)制及治療藥物評價。秀麗隱桿線蟲(以下簡稱線蟲)因其神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、蟲體透明易觀察、生命周期短等優(yōu)勢在PD研究中得到廣泛應(yīng)用。現(xiàn)將線蟲用于PD 研究中優(yōu)勢,以及基于線蟲模型的基礎(chǔ)研究歸納如下,旨在為防治PD提供文獻(xiàn)參考。

1 線蟲模型用于PD研究的生理優(yōu)勢

SYDNEY BRENNER 最早發(fā)現(xiàn)線蟲,并首次將其作為動物模型用于遺傳基礎(chǔ)研究,證明了線蟲是一種非常有價值的模式動物[2]。線蟲與人類的同源物和旁系同源基因包括7 943個基因,相同的蛋白質(zhì)編碼基因組超過41%。此外線蟲3 357個基因與《在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫》注釋的人類基因具有同源性,占線蟲基因組的17%[3],且線蟲的基因組是第一個被完全測序的多細(xì)胞生物的基因組。

與其他PD動物模型比較,線蟲具有許多更適于遺傳和發(fā)育研究的生物學(xué)待性:(1)哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)由數(shù)十億個神經(jīng)元組成,而成年線蟲全身只有302個神經(jīng)元,約1 000個體細(xì)胞,大大降低了復(fù)雜性,提高了神經(jīng)元分析的準(zhǔn)確性。線蟲的生理功能齊全,包括神經(jīng)感觸、肌肉運動、消化排泄和生殖等組織系統(tǒng)。(2)線蟲通體透明,通過在活體中表達(dá)熒光蛋白,很容易看到神經(jīng)元,可研究整個發(fā)育過程中的神經(jīng)元變化,這是線蟲優(yōu)于其他動物模型的關(guān)鍵點[3]。(3)易于人工培養(yǎng)。線蟲雌雄同體,自體繁殖,生命周期短,大大縮短了研究周期,研究成本較低。其可在-80 ℃液氮中保存數(shù)十年,可像培養(yǎng)細(xì)胞那樣無限制地獲得線蟲[4]。(4)最大優(yōu)勢之一是易于基因操作,通過微注射或微粒子轟擊可在不到1個月的時間內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因線蟲。(5)線蟲包含多種神經(jīng)遞質(zhì),17個信號傳導(dǎo)通路中有12個通路(包括胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、p38促分裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)化生長因子-β信號傳導(dǎo)通路等)在線蟲中是保守的[5]?；谝陨系奶攸c,線蟲成為神經(jīng)退行性疾病研究中一種很好的模式生物,對PD藥物靶點的發(fā)現(xiàn)與確證,以及新的治療藥物研究均具有重要貢獻(xiàn)。

2 線蟲模型在PD研究中的應(yīng)用

在PD研究方面,相比含有上萬個多巴胺能神經(jīng)元的脊椎動物,線蟲僅有8個映射良好的多巴胺能神經(jīng)元,包括兩對頭側(cè)神經(jīng)元、頭部一對前頸咽神經(jīng)元和尾部一對后頸咽神經(jīng)元,這便于觀察神經(jīng)元的變化[6]。此外其與許多PD相關(guān)的基因均具有同源性,如LRRK2/lrk-1、PINK1/pink-1、PRKN/pdr-1、DJ-1/djr-1.1/djr-1.2和ATP13A2/catp-6[7]。因此,線蟲成為研究PD的良好模型。

2.1常見的線蟲PD模型

2.1.16-羥多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的線蟲模型 2020年TSAI等[8]將線蟲暴露于6-OHDA中,6-OHDA誘致線蟲對食物的感知行為變慢,體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增強,超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶水平降低,丙二醛升高,誘導(dǎo)線蟲線粒體DNA損傷,導(dǎo)致線蟲多巴胺能神經(jīng)元退化,致其壽命變短。CHALORAK等[9]研究表明,6-OHDA會逐漸損傷線蟲的頭側(cè)神經(jīng)元和前頸咽神經(jīng)元的細(xì)胞體,使多巴胺神經(jīng)退行性變,導(dǎo)致食物感知和乙醇回避行為缺陷,縮短壽命。此外分子信號分析表明,6-OHDA暴露可增加凋亡通路中egl-1、ced-3基因的表達(dá),也可顯著降低磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白生存通路,抑制壽命相關(guān)基因——age-1、let-363、pdk-1、akt-1、akt-2的表達(dá)。BRAUNGART等[10]將1-甲基-4-苯基-四氫吡啶(MPTP)用于線蟲模型并模擬出與人相似的PD癥狀,340～1 000 μmol/L的MPTP就可導(dǎo)致線蟲移動缺陷,如緩慢、不均勻的運動伴有抽搐和卷曲。線蟲攝取MPTP的機(jī)制與脊椎動物相似,均是通過單胺轉(zhuǎn)運體主動轉(zhuǎn)運到多巴胺能神經(jīng)元中,破壞線粒體呼吸鏈。之后的研究表明,MPTP可進(jìn)入大腦,并在單胺氧化酶介導(dǎo)下在膠質(zhì)細(xì)胞中迅速轉(zhuǎn)化為有毒代謝物——1-甲基-4-苯基吡啶,使腺苷三磷酸水平降低、自由基增加,選擇性地破壞多巴胺能神經(jīng)元[11]。 CHEN 等[12]用6-OHDA處理的HT22細(xì)胞和BZ555線蟲為模型,高良姜素處理后可通過激活Nrf2/Keap1信號通路,抑制6-OHDA誘導(dǎo)的線蟲多巴胺神經(jīng)退行性變,顯著降低線蟲活性氧水平。此外,黃芩苷可有效地增加6-OHDA處理的線蟲Bcl-2的表達(dá),降低caspase-3水平,有效逆轉(zhuǎn)ced-9(哺乳動物Bcl-2的同源物)表達(dá)的下降和ced-3(哺乳動物caspase-3的同源物)表達(dá)的增加[13]。有研究表明,額葉苷A和人參皂苷Rg3這2種天然皂苷均可顯著改善6-OHDA誘導(dǎo)線蟲的多巴胺神經(jīng)退行性變,延長線蟲壽命,下調(diào)凋亡介質(zhì)——egl-1和ced-3,上調(diào)sod-3和cat-2的表達(dá),表明二者通過抑制凋亡介質(zhì)和刺激抗氧化酶恢復(fù)PD線蟲模型的多巴胺神經(jīng)元活力發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,且只有額葉苷A可通過上調(diào)ubh-4、hsf-1、hsp-16.1、hsp-16.2的表達(dá)降解轉(zhuǎn)基因線蟲的α-syn表達(dá),所以,額葉苷A可能是一種很有前途的PD的治療藥物[14]。

2.1.2魚藤酮誘導(dǎo)的線蟲模型 魚藤酮是一種天然的化合物,是一種常見的殺蟲劑,來源于百合、金銀花和杜鵑植物的根和莖,可抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ的電子傳遞鏈,易透過血腦屏障,不需要任何轉(zhuǎn)運體進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元,還能誘導(dǎo)體內(nèi)α-Syn聚集。魚藤酮會導(dǎo)致線蟲的線粒體未折疊蛋白反應(yīng)激活,誘導(dǎo)線蟲線粒體損傷,破壞線粒體穩(wěn)態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元退化及線蟲死亡,并且呈一定的濃度依賴性[15]。魚藤酮是常用的PD線蟲模型誘導(dǎo)物,會導(dǎo)致線蟲的頭部擺動頻率、身體彎曲頻率和覓食行為發(fā)生異常[16],常見于PD研究中。最新研究表明,魚藤酮暴露能誘導(dǎo)線蟲線粒體外膜通道蛋白外膜轉(zhuǎn)運酶7,以及內(nèi)膜呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的表達(dá)水平顯著降低,還可導(dǎo)致自噬相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性蛋白PINK1的表達(dá)明顯增加。表明線粒體相關(guān)膜蛋白與PD的神經(jīng)毒性具有密切聯(lián)系,為進(jìn)一步探索PD的環(huán)境病因提供了支持,也為防治PD提供了重要依據(jù)[17]。

2.1.3錳誘導(dǎo)的線蟲模型 錳的過量沉積會降低星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸轉(zhuǎn)運體蛋白的表達(dá)和谷氨酸攝取,導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸水平增加,增強谷氨酸受體的敏感性,從而導(dǎo)致線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和最終的多巴胺能神經(jīng)元丟失,出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和錐體外系運動障礙[18-19]。已有研究證明,在線蟲的生長培養(yǎng)基中補充適量錳可增加其平均壽命和生育能力,并增強其抗熱應(yīng)激性[20],但大量錳會誘導(dǎo)線蟲體內(nèi)活性氧形成、谷胱甘肽水平增加、線粒體膜電位改變等,導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元死亡[21]。因此,維持良好的錳水平非常重要。SOARES等[21]以線蟲為模型發(fā)現(xiàn)了參與金屬誘導(dǎo)的神經(jīng)元變性的分子靶點及金屬與分子靶點之間的新關(guān)系,表明有組基因與金屬誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性變有關(guān),如SKN-1、MTL(亞型1和2)和不同的熱休克蛋白。靶向作用于這些基因可能是一種有效地改變神經(jīng)元脆弱性的方法,從而減緩神經(jīng)元的損失和臨床癥狀的惡化。

2.1.4百草枯誘導(dǎo)的線蟲模型 由于百草枯的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于1-甲基-4-苯基吡啶[22],也具有氧化還原性質(zhì),與分子氧在細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)形成大量超氧自由基,會導(dǎo)致線蟲行動遲緩、多巴胺神經(jīng)元丟失、線粒體結(jié)構(gòu)損傷、腺苷三磷酸消耗并增加自噬[23]。該模型除用于PD研究外,也常用于抗衰老及抗氧化研究,用百草枯作為自由基引發(fā)劑探討線蟲在氧化脅迫后藥物對生物體的抗氧化作用。在線蟲體內(nèi)胰島素/胰島素樣生長因子-1(IGF-1)信號通路是一條進(jìn)化上保守的內(nèi)分泌通路,能調(diào)節(jié)各種生物的壽命并讓生物在受迫的條件下存活,基因daf-2、daf-16在線蟲胰島素信號途徑具有至關(guān)重要地位,對線蟲的抗衰老和延長壽命發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究表明,芫荽水提物可顯著影響胰島素/IGF-1信號通路氧化衰老有關(guān)基因的表達(dá)量,提高線蟲的壽命[24]。劉靜等[25]研究表明,百草枯會導(dǎo)致線蟲衰老相關(guān)基因daf-16、sod-3、ctl-1、hsp16.2以及哺乳動物Nrf2同源物(skn-1) m RNA表達(dá)水平顯著下調(diào),而金釵石斛總生物堿可改善衰老線蟲模型的移動能力,減少脂褐素沉積,提高蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶活力,上調(diào)daf-16、skn-1基因發(fā)揮延緩衰老的作用。這些研究結(jié)果也許能為深入探究衰老機(jī)制找到突破口。

2.1.5轉(zhuǎn)基因線蟲模型 線蟲的基因組是第一個被完全測序的多細(xì)胞生物體,利用相關(guān)遺傳學(xué)操作[正向遺傳學(xué)篩選、反向遺傳學(xué)核糖核酸干擾(RNAi)篩選]很容易獲得攜帶PD基因的線蟲模型。α-syn是家族性和特發(fā)性PD一個重要的發(fā)病因素,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了多個與PD相關(guān)的基因,如PARK1、PARK2、PARK5、PARK6、PARK7、PARK8、PARK9、PARK11和PARK13。在線蟲中發(fā)現(xiàn)了6個同源基因,但不包括編碼α-syn的PARK1,這個特性允許建立過表達(dá)人源α-syn的野生型或突變型線蟲模型,而不用考慮內(nèi)源性α-syn的影響,簡化了實驗條件[26]。α-syn過表達(dá)可導(dǎo)致線蟲運動減少、多巴胺能神經(jīng)元減少、樹突減少及神經(jīng)元傳遞中斷增多,在多巴胺能神經(jīng)元中過表達(dá)會誘導(dǎo)線蟲產(chǎn)生漸進(jìn)性、時間依賴性神經(jīng)退行性疾病和運動缺陷[27]。TYSON等[28]用BiFC-syn線蟲模型研究α-syn在神經(jīng)元間的轉(zhuǎn)移機(jī)制發(fā)現(xiàn),自噬/溶酶體途徑是α-syn轉(zhuǎn)移的主要因素,自噬的破壞會導(dǎo)致α-syn積累的凈增加。相關(guān)基因的突變,如catp-6/ATP13A2和lrk-1(lrrk2)會損害自噬,而vps-35的突變則會損害逆轉(zhuǎn)錄物傳遞必要的溶酶體酶的能力,影響溶酶體功能。而djr-1.2(dj-1)、pink-1、pdr-1(parkin)、ATP13A2是調(diào)節(jié)活性氧和線粒體健康的重要基因,也是調(diào)控PD的重要基因。最近幾年為更加準(zhǔn)確地研究單個基因的作用,促使靶向基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展大大推進(jìn)了線蟲反向遺傳學(xué)研究,包括Cre/Lox P和FRT/FLP重組酶技術(shù)、Mos1轉(zhuǎn)座子技術(shù)、ZFNs技術(shù)、TALENs技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)。這些技術(shù)使用靶向特定DNA序列的重組酶、轉(zhuǎn)座酶和核酸酶,方便了研究特定基因在線蟲細(xì)胞功能的行使,以及線蟲個體生長、發(fā)育過程中的作用,更好地找到疾病的治療靶點[29]。

2.2線蟲模型在PD運動功能評價方面的應(yīng)用 PD表現(xiàn)出的運動障礙主要與多巴胺能回路有關(guān),多巴胺能回路損傷直接影響線蟲的以下幾種行為,常用的評價線蟲多巴胺依賴行為的測試如下[30-31]。

2.2.1基礎(chǔ)減慢或食物感知行為 通常情況下線蟲在有細(xì)菌食物的情況下爬行比沒有食物時更慢,但當(dāng)多巴胺信號中斷時阻止了線蟲在有食物時減慢的能力,從而使爬行速度加快。為測量線蟲的基礎(chǔ)減慢行為,先在緩沖液中清洗然后轉(zhuǎn)移到有或沒有細(xì)菌的瓊脂平板上,記錄20～60 s線蟲身體彎曲的頻率?；A(chǔ)減慢率=(無食物的運動速率-有食物的運動速率)/ 有食物的運動速率[32]或=(有細(xì)菌存在時線蟲的運動速率/沒有細(xì)菌存在時線蟲的運動速率)×100[33]。

2.2.2趨化性測試 線蟲可感知環(huán)境中引起吸引或排斥趨化性的化學(xué)線索。在實驗室條件下線蟲會遠(yuǎn)離接觸乙醇,然而當(dāng)持續(xù)暴露于乙醇中時線蟲會對乙醇產(chǎn)生耐受性和偏好,這種反應(yīng)是由多巴胺系統(tǒng)控制的。乙醇趨化性試驗是將瓊脂平板分為2個象限,在其中一個象限中加入乙醇,將線蟲轉(zhuǎn)移到測試板上,使其自由探索30 min。為評估目標(biāo)化學(xué)物的效果對目標(biāo)象限和對照象限中的線蟲進(jìn)行量化,計算偏好指數(shù)=(乙醇象限的線蟲數(shù)量-對照象限的線蟲數(shù)量)/測試線蟲總數(shù)。復(fù)方壬醇也有類似的效果,其引起強烈的負(fù)趨化反應(yīng),這種對壬醇厭惡氣味的反應(yīng)受多巴胺信號調(diào)節(jié)[34]。當(dāng)體內(nèi)多巴胺含量減少時線蟲需更長的時間對化學(xué)刺激做出反應(yīng),這個測試可間接測量線蟲體內(nèi)的多巴胺含量。

2.2.3區(qū)域限制搜索行為 其行為是一種覓食行為,線蟲在一定區(qū)域內(nèi)尋找食物時會頻繁地轉(zhuǎn)換角度,當(dāng)無法找到食物時其會擴(kuò)大搜索區(qū)域。線蟲的覓食軌跡由寬闊的弧線組成,這種方式提高了覓食效率,這也是一種涉及多巴胺信號傳導(dǎo)的目標(biāo)定向行為,去除或破壞多巴胺能神經(jīng)元可導(dǎo)致該行為異?；蛳?。將喂養(yǎng)良好的線蟲轉(zhuǎn)移到?jīng)]有食物的瓊脂平板上并在轉(zhuǎn)移后5、30 min后錄像60 s,分析每條線蟲的軌跡,計算每個時間點軌跡角度大于90°的轉(zhuǎn)彎次數(shù)。

2.2.4游泳性癱瘓測試 將健康線蟲置于在液體中,最初蟲體會劇烈拍打,但在拍打約6 min后會表現(xiàn)出“癱瘓”,即一種游泳性癱瘓的現(xiàn)象。多巴胺能功能受損的線蟲,如酪氨酸羥化酶突變體線蟲是不會顯示出這種行為的,表明內(nèi)源性多巴胺是調(diào)控拍打行為所必需的神經(jīng)信號。該試驗在L4幼蟲期階段的線蟲中很容易觀察到,但隨著年齡的增長這種現(xiàn)象會變得不那么明顯。

2.2.5其他 還有研究對線蟲的頭部擺動頻率、身體彎曲頻率、排便頻率、繁殖力及在固體板上的爬行速度進(jìn)行了分析,以評價其他多巴胺依賴行為能力。

3 線蟲模型的局限性

線蟲是一種很有價值的模式生物,但也具有一定局限性。線蟲的生理結(jié)構(gòu)與人具有一定差距,無法模擬或不能完全模擬人類疾病的病理過程[35]。如線蟲沒有心臟、血管、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等,成蟲的體細(xì)胞是有絲分裂后產(chǎn)生的。此外線蟲缺乏同源性α-syn,神經(jīng)元的連接與人類不同,一些分子途徑不存在。利用線蟲對多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行分子生物學(xué)實驗具有一定挑戰(zhàn),這也使線蟲在模擬人類疾病方面具有一定局限性。

4 展 望

線蟲是研究PD發(fā)病機(jī)制及新藥篩選的一種極好的模式生物,神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單,神經(jīng)行為多樣,基因組完全被測序,可很好地研究單個基因在PD中的作用,結(jié)果與哺乳動物具有可比性。除PD外,線蟲也適合研究阿爾茨海默病、亨廷頓病、衰老、癡呆、運動障礙等疾病。

線蟲體積小且研究成本較低,適合進(jìn)行高通量藥物篩選,這是目前嚙齒類動物所無法實現(xiàn)的。2021年SOHRABI等[36]發(fā)現(xiàn),RNAi-介導(dǎo)的線蟲神經(jīng)元支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶1的敲低會隨著年齡的增長而導(dǎo)致異常的痙攣樣“卷曲”行為,而對導(dǎo)致線蟲PD樣卷曲功能障礙的修飾物進(jìn)行大規(guī)模篩選可能揭示新的疾病機(jī)制,并確定潛在的治療方法。所以,該學(xué)者創(chuàng)建了一個基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法的線蟲快照分析平臺量化線蟲的行為表型,通過該平臺已確定了幾種現(xiàn)有藥物作為潛在治療PD的候選藥物。平臺不僅用于支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶1敲低線蟲,還可用于研究其他RNAi處理或其他遺傳株線蟲卷曲、近卷曲和非卷曲的游泳姿勢(如膽堿能突變體cha-1和unc-17)。近年來,還發(fā)展了一項新技術(shù)——微流控芯片技術(shù)[37-38],其具有控制精確、靈活集成和自動化等優(yōu)勢,適用于采用線蟲模型對高通量、高內(nèi)涵藥物進(jìn)行毒性篩選研究,以探究神經(jīng)元活動與行為學(xué)間的聯(lián)系,對PD的診治具有重大意義。在我國有大量研究利用線蟲進(jìn)行抗PD中藥活性成分的評價與篩選,而這些新技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用對研究PD具有重大意義,也將促進(jìn)傳統(tǒng)中藥及天然化合物的發(fā)展。