circ_0000515靶向miR-924調(diào)控卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的機(jī)制研究

張瑛琦

（佳木斯市婦幼保健院，黑龍江 佳木斯 154003）

卵巢癌是威脅女性生命安全的惡性腫瘤之一，由于早期臨床癥狀較為隱匿，70%患者確診時(shí)已處于晚期，中晚期卵巢癌5年生存率大于為40%，但大多數(shù)患者預(yù)后差且總體生存率低，為尋找早期診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，探究卵巢癌發(fā)展的機(jī)制是必須的[1-2]。作為一個(gè)由3’端與5’端連接形成的閉合環(huán)狀RNA，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）可以參與卵巢癌進(jìn)展通過(guò)靶向微小RNA（miRNA）[3-4]。circ_0000515參與調(diào)控腫瘤發(fā)生過(guò)程。如，其在肝癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，它的高表達(dá)可預(yù)示淋巴轉(zhuǎn)移的高發(fā)，并且體外研究指出其低表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移，體內(nèi)研究表明其能加重肝癌惡性進(jìn)展[5]。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-924是circ_0000515的候選靶基因之一。證據(jù)已指出增加這個(gè)miRNA含量能夠減弱肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力[6]，提示miR-924介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特性。本研究運(yùn)用SKOV3細(xì)胞分析circ_0000515是否通過(guò)靶向miR-924介導(dǎo)卵巢癌惡性表型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取2020年3月—7月于佳木斯市婦幼保健院經(jīng)病理學(xué)確診的43例卵巢癌患者腫瘤和癌旁組織標(biāo)本，并及時(shí)儲(chǔ)存在-80℃，病人或其近親屬知情同意。

SKOV3細(xì)胞、青霉素（100 μg·mL-1），鏈霉素（100 μg·mL-1）購(gòu)自上海奧陸生物；E-cadherin、N-cadherin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自上海碧云天生物；熒光定量PCR試劑盒、胎牛血清、熒光素酶檢測(cè)盒、胰蛋白酶、Transwell小室購(gòu)自北京索萊寶；Trizol與Lipofectamine? 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自北京索萊寶科技；GAPDH抗體與 IgG二抗購(gòu)自美國(guó)CST；反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自北京天根生化；CCK-8試劑購(gòu)自上海酶研生物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 SKOV3細(xì)胞按照說(shuō)明書(shū)培養(yǎng)在5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度，待其匯合度達(dá)到95%左右時(shí)，用胰酶消化（用顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)）并鋪在6孔板（1×104個(gè)/孔），鋪板后大約16 h（此時(shí)細(xì)胞密度應(yīng)當(dāng)在75%～90%左右）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（轉(zhuǎn)染siRNAs或miRNA模擬物及抑制劑時(shí)不加P3000TM試劑）將si-NC、si-circ_0000515、miR-NC、miR-924 mimics制備成RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，并加入到6孔板中，在培養(yǎng)板上標(biāo)記si-NC組、si-circ_0000515組、miR-NC組、miR-924組。用減血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine?3 000，隨后將si-circ_0000515分別與anti-miR-NC或anti-miR-924進(jìn)行共轉(zhuǎn)染（密度應(yīng)當(dāng)在75%～90%左右），在培養(yǎng)板上標(biāo)記si-circ_0000515+antimiR-NC組、si-circ_0000515+anti-miR-924組。

1.2.2 qRT-PCR 取80 mg卵巢癌組織和80 mg癌旁組織和1 mL Trizol試劑混合均勻、取1×106細(xì)胞樣品和0.4 mL Trizol試劑混合均勻。將各樣品在常溫下裂解15 min完全解離核蛋白復(fù)合體。用紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度。取適量RNA樣品根據(jù)FastKing RT Kit說(shuō)明準(zhǔn)備反轉(zhuǎn)錄體系以合成cDNA（加樣過(guò)程應(yīng)在冰上操作，防止RNA降解）。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增以定量circ_0000515、miR-924表達(dá)。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將si-circ_0000515組、miR-924組、si-circ_0000515+anti-miR-924組以及對(duì)照組細(xì)胞收集并接種于96孔板，隨后添加CCK-8溶液，根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。最后，各孔樣品經(jīng)酶標(biāo)儀評(píng)估。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 在6孔板中，收集的sicirc_0000515組、miR-924、si-circ_0000515+antimiR-924組以及對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)2周后，進(jìn)行固定和結(jié)晶紫染色。最后，克隆形成數(shù)經(jīng)顯微鏡分析。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔板中，收集的sicirc_0000515組、miR-924、si-circ_0000515+antimiR-924組以及對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到95%。隨后，細(xì)胞單層經(jīng)移液槍槍頭劃線，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。最后，遷移距離被分析使用顯微鏡。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 將si-circ_0000515組、miR-924、si-circ_0000515+anti-miR-924組以及對(duì)照組細(xì)胞收集并接種于小室的上室，培養(yǎng)48 h，下室加含20%胎牛血清的DMEM，多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下分析細(xì)胞侵襲能力。小室的上室加有Matrigel基質(zhì)膠。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) SKOV3細(xì)胞鋪板后大約16 h（此時(shí)細(xì)胞密度應(yīng)當(dāng)在75%～90%左右），將WT-circ_0000515和MUT-circ_0000515采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（轉(zhuǎn)染miRNA模擬物不加P3000TM試劑）與miR-NC或miR-924 mimics共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，48 h后收集并裂解以上轉(zhuǎn)染細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶檢測(cè)盒說(shuō)明將LAR I加到光度計(jì)管中，對(duì)光度計(jì)進(jìn)行編程以分析酶活性。

1.2.8 Western blot 將各組SKOV3細(xì)胞用溫的PBS沖洗3遍，加入RIPA裂解液，將細(xì)胞收集到EP管中，離心取上清，于沸水中孵育10 min，蛋白變性。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后，取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE（上樣前將膠板下的氣泡趕走），蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1 cm左右結(jié)束。將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出并稍加漂洗，牛血清白蛋白封閉PVDF膜（浸沒(méi)于封閉液中搖蕩1 h），加入E-cadherin、N-cadherin和GAPDH一抗，TBST洗滌，暗室內(nèi)曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

這項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間和多組間分別做獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0000515、miR-924在癌旁組織和卵巢癌組織中的表達(dá)

見(jiàn)表1。

表1 circ_0000515和miR-924的表達(dá)（±s ，n= 43）

表1 circ_0000515和miR-924的表達(dá)（±s ，n= 43）

注：與癌旁組織比較，# P＜0.05

組織circ_0000515miR-924癌旁組織1.00±0.141.00±0.09卵巢癌組織4.77±0.32#0.33±0.04#

2.2 circ_0000515對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響

見(jiàn)表2。

表2 circ_0000515對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響（±s ，n= 9）

表2 circ_0000515對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響（±s ，n= 9）

注：與si-NC組比較，# P＜0.05

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2.3 下調(diào)circ_0000515表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲的影響

見(jiàn)圖1、表3。

圖1 下調(diào)circ_0000515表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 下調(diào)circ_0000515表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s ，n= 9）

表3 下調(diào)circ_0000515表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s ，n= 9）

注：與si-NC組比較，# P＜0.05

組別劃痕愈合率/%侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)E-cadherin蛋白N-cadherin蛋白si-NC組64.11±5.66116.93±11.050.17±0.020.68±0.05 si-circ_0000515組24.23±2.21# 50.91±4.96#0.57±0.04#0.24±0.03#

2.4 circ_0000515靶向miR-924

circ_0000515含有miR-924互補(bǔ)序列，見(jiàn)圖2。熒光素酶活性值，見(jiàn)表4。circ_0000515調(diào)控miR-924的表達(dá)，見(jiàn)表5。

表4 熒光素酶活性值（±s，n= 9）

表4 熒光素酶活性值（±s，n= 9）

注：與miR-NC組比較，# P＜0.05

組別WT-circ_0000515MUT-circ_0000515 miR-NC組0.96±0.060.99±0.07 miR-924組0.34±0.03#0.97±0.04

表5 circ_0000515調(diào)控miR-924的表達(dá)（±s ，n= 9）

表5 circ_0000515調(diào)控miR-924的表達(dá)（±s ，n= 9）

注：與pcDNA組比較，# P＜0.05；與si-NC組比較，△P＜0.05

組別miR-924 pcDNA組1.00±0.00 pcDNA-circ_0000515組0.45±0.05#si-NC組1.02±0.07 si-circ_0000515組3.09±0.30△

2.5 miR-924對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

見(jiàn)圖3、表6。

圖3 miR-924對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表6 miR-924對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s ，n= 9）

表6 miR-924對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s ，n= 9）

注：與miR-NC組比較，# P＜0.05；與si-circ_0000515+anti-miR-NC組比較，△P＜0.05

N-cadherin蛋白miR-NC組1.00±0.000.86±0.0689.21±7.9367.08±5.08118.73±12.420.15±0.020.69±0.05 miR-924組3.28±0.31#0.44±0.05#52.37±5.10#32.58±3.17# 57.38±5.18#0.49±0.04#0.31±0.03#si-circ_0000515+anti-miR-NC組1.00±0.000.36±0.0339.29±3.6622.86±2.53 48.72±4.060.58±0.040.23±0.02 si-circ_0000515+anti-miR-924組0.41±0.04△0.73±0.06△79.22±6.43△55.34±4.67△ 99.45±7.35△0.28±0.03△0.59±0.04△組別miR-924OD值（450 nm）細(xì)胞克隆形成數(shù)/個(gè)劃痕愈合率/%侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)E-cadherin蛋白

3 討論

circRNA不易被核酸外切酶降解，且具有序列保守性、表達(dá)穩(wěn)定性等特點(diǎn)，表明circRNA可能作為疾病診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，circRNA主要是由外顯子組成，其可在卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[7-8]。先前的研究已近證實(shí)了大多數(shù)的circRNAs可以調(diào)控卵巢癌細(xì)胞進(jìn)展通過(guò)靶向miRNA/mRNA軸[9-10]。

circ_0000515在宮頸癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，circ_0000515沉默限制宮頸癌細(xì)胞侵襲，增加細(xì)胞凋亡率[11]。circ_0000515是一種新型環(huán)狀RNA，其在乳腺癌組織中上調(diào)表達(dá)，沉默circ_0000515可減弱乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[12]。然而circ_0000515對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未可知。此工作證實(shí)circ_0000515在卵巢癌組織中低表達(dá)，circ_0000515沉默抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。N-cadherin在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，而E-cadherin表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）最終促使細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13-14]。本研究證實(shí)circ_0000515沉默減少N-cadherin蛋白水平，增加E-cadherin表達(dá)。此外卵巢癌細(xì)胞劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)在circ_0000515敲低后被抑制。本研究進(jìn)一步證實(shí)circ_0000515與miR-924存在靶向調(diào)控關(guān)系。研究表明，miR-924抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲[15]、抑制胃癌和肝癌細(xì)胞的增殖[16-17]。此工作證實(shí)了miR-924可以削弱卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。而且circ_0000515對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)及運(yùn)動(dòng)的促進(jìn)作用涉及其對(duì)miR-924靶向調(diào)節(jié)。

綜上所述，circ_0000515/miR-924分子軸在卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用。但仍需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circ_0000515/miR-924分子軸對(duì)卵巢癌移植瘤生長(zhǎng)的影響。