基于HPLC-ELSD法測(cè)定石斛原漿飲品中水解甘露糖

孫琦琦 朱帥 阮小嬌 張水鋒 盛華棟

石斛作為蘭科植物的一大屬，具有不俗的養(yǎng)生保健及藥用價(jià)值，近年來市面上也出現(xiàn)許多以石斛為原料的石斛原漿飲品。石斛多糖作為其重要的生物活性物質(zhì)，主要由甘露糖及葡萄糖通過糖苷鍵結(jié)合形成。甘露糖是石斛多糖的重要組成成分及質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，具有調(diào)解免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移等生理效應(yīng)。因此，通過測(cè)定石斛原漿飲品中甘露糖含量可以進(jìn)一步提升對(duì)石斛原漿飲品的質(zhì)量指標(biāo)把控。石斛原漿飲品中的甘露糖通常以葡甘露聚糖的形式存在，因此要將樣品中的葡甘露聚糖先提取純化后，再將其中的甘露糖解離為游離態(tài)后進(jìn)行測(cè)定。

目前，對(duì)石斛或石斛原漿飲品中甘露糖的測(cè)定方法多參考《中國(guó)藥典（2020版）》，采用水提醇沉提取，鹽酸水解多糖，柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定。雖然這種方法能夠檢測(cè)出樣品中甘露糖的含量，但卻存在操作繁瑣、時(shí)效性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。本文基于高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC-ELSD）， 建立了一種非衍生直接測(cè)定石斛原漿飲品中水解甘露糖含量的方法，具有線性關(guān)系好、穩(wěn)定性好、回收率高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

一、儀器與試劑

1.實(shí)驗(yàn)儀器。LC-20A液相色譜儀（日本島津公司）；Alltech 3300 ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)奧泰公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；MS 105 DU電子天平（梅特勒-托利多集團(tuán)）；電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；烘箱（德國(guó)BINDER公司）；QT-1渦旋混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；ST 16R高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）。

2.實(shí)驗(yàn)試劑。無水乙醇（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）； 鹽酸（分析純，杭州雙林化工試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；氨水（分析純，無錫展望化工試劑有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）。

實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水；實(shí)驗(yàn)用石斛原漿飲品購(gòu)置于杭州某超市。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液配置。（1）甘露糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度為10mg/mL）：準(zhǔn)確稱取100.00mg（精確至0.01mg）甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用水定容，混勻，甘露糖濃度為10mg/mL，于4℃保存。

（2）甘露糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取甘露糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mL于10mL容量瓶中，用水定容，混勻，甘露糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為20、50、100、200、500、1000mg/L。

2.樣品制備。（1）純化：準(zhǔn)確移取5mL均勻樣品于50mL離心管中，加入40mL無水乙醇，渦旋混勻并于-18℃下放置20min。取出后于高速離心機(jī)中以6000r/min離心5min，棄去上清液，向沉淀中加入80%乙醇水溶液45mL，重復(fù)上述純化步驟2次。

（2）提?。簩⒓兓幚砗蟮臍?jiān)?01℃烘箱中徹底干燥（2h以上），精密加入10mL水，渦旋混勻，置于100℃水浴提取30min，取出后放冷，并以6000r/min離心5min，收集上清液。

（3）水解：準(zhǔn)確吸取5mL上述離心后的上清液于10mL比色管中，加入3mol/L鹽酸溶液2mL，蓋上塞子后渦旋混勻，并于100℃水浴中水解1h。取出后放冷， 用5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶并用水定容至刻度，混勻，過0.22μm濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

3.色譜條件。XBridge Amide色譜柱（250mm×4.6mm，3.5μm）；流動(dòng)相為0.1%氨水乙腈溶液-0.1%氨水水溶液（80：20）；流速：1.0mg/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL；漂移管溫度：50℃；載氣流速：1.5L/min。

4.結(jié)果計(jì)算。按照下方公式計(jì)算樣品中甘露糖含量：

上式中，X為試樣中甘露糖的含量，mg/mL；C為試樣溶液中甘露糖的質(zhì)量濃度，mg/L；V為定容體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為試樣稱樣量，g；1000是指換算系數(shù)。

三、結(jié)果與分析

1.色譜條件優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)探究不同流動(dòng)相組成對(duì)目標(biāo)化合物分離程度及色譜峰型的影響，分別采用乙腈-水體系及0.1%氨水乙腈溶液-0.1%氨水水溶液體系對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種流動(dòng)相體系都可以達(dá)到將目標(biāo)化合物完全分離的效果，但采用乙腈-水體系進(jìn)行分析時(shí)，色譜峰型表現(xiàn)不理想，而后者能夠得到較好的色譜峰型，故最終采用0.1%氨水乙腈溶液-0.1%氨水水溶液的流動(dòng)相體系。

2.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、檢出限、定量限。將配置好的甘露糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作液注入蒸發(fā)光高效液相色譜（HPLC-ELSD）儀進(jìn)行檢測(cè)，以甘露糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作液響應(yīng)峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)Y，其濃度的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X，得到此標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=1.3446X+7.6299（圖1），線性范圍為20mg/L-1000mg/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。當(dāng)甘露糖的添加濃度為0.02mg/mL時(shí)，測(cè)得的色譜峰信噪比約為3，當(dāng)甘露糖的添加濃度為0.04mg/mL時(shí)， 測(cè)得的色譜峰信噪比約為10。由此得出，本方法中甘露糖的檢出限為0.02mg/mL，定量限為0.04mg/mL。

3.回收率、精密度。對(duì)經(jīng)過純化處理的樣品進(jìn)行3個(gè)水平（分別為0.160、0.800、3.200mg/mL）的加標(biāo)回收測(cè)試，每個(gè)水平分別測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。由表1可知，3個(gè)水平的回收率在87.5%-101.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.33%-2.31%。

4.石斛原漿樣品中甘露糖的含量。對(duì)3種市售石斛原漿樣品中甘露糖的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

四、結(jié)論

與現(xiàn)有方法相比，通過無水乙醇純化，純水提取后鹽酸水解并采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC-ELSD）技術(shù)測(cè)定石斛原漿飲品中甘露糖的含量，有效解決了甘露糖無特征發(fā)光發(fā)色基團(tuán)的問題，省去回流、衍生等繁瑣步驟，具有良好的線性范圍、較低的檢出限、較高的精密度，適用于石斛原漿飲品中甘露糖含量的測(cè)定。