當(dāng)歸芍藥散對(duì)血管性癡呆模型大鼠炎癥反應(yīng)、神經(jīng)凋亡、Aβ 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)細(xì)胞因子的影響

曲美潔 唐詠春 臧運(yùn)華 于 淼 王瀟慧 周喜燕

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250199；2.青島大學(xué)附屬海慈醫(yī)院，山東青島 266033）

隨著我國(guó)老齡人口的增加，血管性癡呆（vascular dementia，VaD）的發(fā)病率與日俱增，我國(guó)VaD患者占據(jù)全球VaD患者總數(shù)的四分之一。本病作為血管性認(rèn)知障礙，是由腦血管疾病引起腦區(qū)低灌注引起，以語(yǔ)言、情感功能、認(rèn)知功能的障礙及記憶力下降為主要臨床表現(xiàn)[1]。當(dāng)前VaD發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要集中在炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元細(xì)胞鈣超負(fù)荷等方面[2]。作為僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類型，也是目前唯一可以預(yù)防治療的癡呆類型[3]，本病目前主要的治療方法是采用多種藥物聯(lián)合，控制炎癥反應(yīng)、保護(hù)腦神經(jīng)[4]，但尚未取得理想的治療效果。因此，臨床針對(duì)VaD的研究重點(diǎn)主要以早期防治為主，延緩病情進(jìn)展，減輕VaD患者痛苦。相關(guān)研究表明，炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡等機(jī)制是VaD形成的關(guān)鍵[5]。腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元等被激活，釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核因子κB（NF-κB）等炎性因子，促進(jìn)腦組織β-淀粉樣蛋白（Aβ）產(chǎn)生，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，損傷腦組織，從而引起認(rèn)知障礙[6-7]。因此，減少炎性因子釋放和Aβ產(chǎn)生、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善神經(jīng)損傷是防治血管性癡呆發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子機(jī)制。

當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，具有養(yǎng)血柔肝、健脾祛濕等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，當(dāng)歸芍藥散中含有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)神經(jīng)等多種有效成分[8]，可以起到明顯的擴(kuò)張末梢血管、改善微循環(huán)、促進(jìn)腦代謝活化功效[9]，對(duì)VaD患者的癥狀具有較好的改善作用。因此本實(shí)驗(yàn)研究基于炎癥因子釋放、神經(jīng)元凋亡等因素，通過(guò)永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立VaD動(dòng)物模型，觀察當(dāng)歸芍藥散對(duì)VaD模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力、海馬組織細(xì)胞凋亡的影響，及其對(duì)TNF-α/NF-κB信號(hào)通路，以及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、兔抗人單克隆抗體（Bax）蛋白和低密度脂蛋白受體（LRP1）、糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）基因的調(diào)控作用，探索其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 封閉群純種SPF級(jí)SD雄性健康大鼠，體重180～220 g，由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬海慈醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批編號(hào)：2022HC05LS013）。大鼠在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，室溫（23±1）℃，相對(duì)濕度60%，光線自動(dòng)控制，每12 h明暗交替，統(tǒng)一使用符合規(guī)定的大鼠飼料和水喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 當(dāng)歸芍藥散，藥物組成：當(dāng)歸9 g、白芍48 g、川芎24 g、茯苓12 g、澤瀉24 g、白術(shù)12 g，所有藥品均購(gòu)自青島市中醫(yī)院中藥房，且均為道地藥材。藥液制備方法：藥物使用超純水浸泡1 h后，大火煮沸，轉(zhuǎn)文火再煮沸30 min，收集藥液，剩余藥材重復(fù)上述步驟再次煎煮，收集并混合2次藥液，60 ℃濃縮，分裝，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用前加熱并用超純水稀釋成濃度分別為72 mg/mL（高劑量）、18 mg/mL（低劑量）的藥液。

尼莫地平片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20003010，規(guī)格20 mg，研磨成粉，用超純水配置成濃度16.8 mg/mL的溶液，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3 主要試劑 二甲苯、無(wú)水乙醇、碳酸鋰、冰醋酸、30%H2O2（批 號(hào)：10023418、10009218、20022818、10000218、10011218），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木素伊紅（批號(hào)：G1004），購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；Bax兔抗人單克隆抗體（1∶1000，批號(hào)：PAB46088）、兔Bcl-2 單克隆抗體（1∶1000，批號(hào)：A00040-1），購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠TNF-α抗體、兔抗大鼠NF-κB抗體，購(gòu)自英國(guó)abcam公司；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、NF-κB ELISA試劑盒、蛋白Marker、DAB顯色液、2×Tap聚合酶鏈?zhǔn)?反 應(yīng)（PCR）master Mix（批 號(hào)：QYH-12018、P12103、G1022、G3302-01），購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑（批號(hào)：IPVH00010、WBKLS0500），購(gòu)自上海未熹生物科技有限公司；DAB濃縮試劑盒、封閉山羊血清、終止液（批號(hào)：DA1010、SL038、C1058），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；20×Tris-EDTA修復(fù)液、TBE電泳緩沖液（批號(hào)：G1203、G3002），購(gòu)自武漢塞維爾生物科技公司；PBS緩沖液，購(gòu)自山東西亞化學(xué)有限公司；枸櫞酸緩沖液（批號(hào)：BL604A），購(gòu)自福州奧研實(shí)驗(yàn)器材責(zé)任公司；溴酚藍(lán)指示劑（批號(hào)：115-39-9），購(gòu)自湖北興琰新材料科技有限公司。

1.4 主要儀器 正置顯微鏡、石蠟切片機(jī)（型號(hào)：DM1000、RM2235），購(gòu)自徠卡纖維系統(tǒng)有限公司；移液器（型號(hào)：P100、P200），購(gòu)自吉爾森P型移液器公司；恒溫烘箱（型號(hào)：DHG-9023A），購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；攤片烤片機(jī)、自動(dòng)組織脫水機(jī)（型號(hào)：TKD-TK、TKD-TSF），購(gòu)自湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司；穩(wěn)壓DNA電泳儀（型號(hào)：mini protean 3 cell），購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；恒溫烘箱（型號(hào)：TY-HX），購(gòu)自臺(tái)裕科技公司；水迷宮（型號(hào)：BW-MWM101），購(gòu)自上海軟隆科技發(fā)展有限公司；實(shí)時(shí)免疫熒光PCR儀（型號(hào)：MiniAmp），購(gòu)自美國(guó)ABI公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（型號(hào)：HISCL-5000），購(gòu)自上海繼圣醫(yī)療器械有限公司；離心機(jī)（批號(hào)：SMP-2），購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，行Morris水迷宮測(cè)試，剔除120 s內(nèi)找不到平臺(tái)者。測(cè)試結(jié)束3 d后采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法建立VaD動(dòng)物模型[10]：造模前禁食12 h，注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉，確保手術(shù)期間大鼠有自主呼吸；保持仰臥姿勢(shì)，固定頭部，去毛備皮，消毒后沿頸正中切開(kāi)，分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈后選用0號(hào)慕絲線結(jié)扎，縫合傷口。另取12只SD大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎頸總動(dòng)脈，只做皮膚切口和組織分離處理后縫合皮膚。手術(shù)后各組大鼠均予青霉素10萬(wàn)單位肌注3 d防感染，觀察大鼠待活動(dòng)正常后放回實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)喂養(yǎng)。術(shù)后3 d，所有造模大鼠再次行水迷宮測(cè)試，逃避潛伏期＞55 s，跨越平臺(tái)頻率＜1 次/60 s，且出現(xiàn)精神較差、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少、舌質(zhì)暗紅等表現(xiàn)者，表明造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和當(dāng)歸芍藥散低、高劑量組，每組12只。

2.2 給藥 造模完成1 周后開(kāi)始灌胃給藥。陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予尼莫地平片1.68 g/（kg·d），當(dāng)歸芍藥散低、高劑量組分別灌胃給予中藥溶液1.8、7.2 g/（kg·d），假手術(shù)組、模型組每日灌胃給予等體積蒸餾水。各組均每日灌胃1次，灌胃體積為1 mL/10 g，連續(xù)4周。

2.3 取材 末次灌胃后次日，每組隨機(jī)取8只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試；測(cè)試結(jié)束后次日，每組大鼠再隨機(jī)取8只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，于腹主動(dòng)脈處取血，離心分離血清，于-20 ℃冰箱中保存擬用于ELISA法檢測(cè)；隨后迅速斷頭處死大鼠，取部分海馬組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化、蘇木素-伊紅（HE）染色；另取部分海馬組織放入凍存管，立即轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中凍存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 Morris水迷宮測(cè)試行為能力 末次灌胃結(jié)束后，各組大鼠禁食禁水24 h，每組隨機(jī)選取8只，采用Morris水迷宮測(cè)試檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。測(cè)試包括兩項(xiàng)：（1）定位巡航試驗(yàn)檢測(cè)逃避潛伏期：每只大鼠連續(xù)訓(xùn)練4 d，按照設(shè)計(jì)好的順序?qū)⑵涿嫦虺乇?，從各入水口放入水中，記?0 s內(nèi)找到平臺(tái)的實(shí)際時(shí)間（即逃避潛伏期），如果大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)找到平臺(tái)，記錄逃避潛伏期為60 s。每次找到平臺(tái)后，均使其于平臺(tái)停留20 s。（2）空間探索試驗(yàn)檢測(cè)穿越平臺(tái)數(shù)：定位巡航試驗(yàn)結(jié)束后次日，使大鼠面向池壁，輕輕放入水中，入水口選在平臺(tái)對(duì)角處，測(cè)試時(shí)間60 s，記錄其穿越平臺(tái)位置的次數(shù)，判斷大鼠記憶存儲(chǔ)和再現(xiàn)能力。

2.4.2 HE染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元組織病理形態(tài)變化 取浸泡于4%多聚甲醛中固定的各組大鼠海馬組織，按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋，沿矢狀面切片，厚度約4 μm，嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行HE染色，中性樹(shù)脂膠封片，光鏡下觀察海馬組織病理形態(tài)，評(píng)價(jià)神經(jīng)元損傷程度。

2.4.3 免疫組化法檢測(cè)海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 取每組8只大鼠海馬組織按常規(guī)步驟脫水、浸蠟、包埋后切片，厚度4 μm，65 ℃烤片1 h后脫蠟水化；用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)；3%H2O2濕盒孵育10 min，PBS緩沖液沖洗，阻斷后置于封閉山羊血清中室溫封閉，分別滴加Bax（稀釋比為1∶200）、Bcl-2抗體（稀釋比為1∶100），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，復(fù)溫45 min后滴加二抗，DAB顯色后，經(jīng)蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。于光學(xué)顯微鏡下拍照觀察，并采用Image J軟件分析OD值。

2.4.4 ELISA法 檢 測(cè) 大 鼠 血 清TNF-α、NF-κB含量 取每組8只大鼠血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，于多功能酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取OD值并進(jìn)行分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠血清TNF-α、NF-κB含量。

2.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)海馬組織LRP1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá) 取凍存的各組大鼠海馬組織約100 mg，使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，電泳確定RNA完整性，并檢測(cè)RNA純度及濃度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以適量cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性持續(xù)1 min，95 ℃變性持續(xù)5 s，60 ℃退火持續(xù)10 s，72 ℃延伸30 s，連續(xù)循環(huán)40次。系列反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值，采用2-△△Ct計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 大鼠海馬組織LRP1、RAGE mRNA引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究所有計(jì)量資料均滿足正態(tài)分布，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05），資料均滿足方差齊性，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠行為能力比較 定位巡航試驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠每日逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組（P＜0.01）；各給藥組大鼠每日逃避潛伏期均明顯短于模型組（P＜0.01），其中當(dāng)歸芍藥散高劑量組每日逃避潛伏期均明顯短于低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），當(dāng)歸芍藥散低劑量組第4天逃避潛伏期與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？臻g探索試驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于假手術(shù)組（P＜0.01）；各給藥組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯多于模型組（P＜0.05，P＜0.01），其中當(dāng)歸芍藥散高劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯多于低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01），當(dāng)歸芍藥散低劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試行為能力比較（±s）

表2 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試行為能力比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與當(dāng)歸芍藥散低劑量組比較，☆☆P＜0.01。

逃避潛伏期/s穿越平臺(tái)數(shù)/次第1天 第2天 第3天 第4天假手術(shù)組 8 22.36±1.00 13.39±0.84 10.93±0.37 9.63±0.75 2.72±0.46模型組 8 56.43±3.09** 48.20±3.59** 42.18±3.58** 39.17±2.68** 1.35±0.09**陽(yáng)性對(duì)照組 8 29.44±2.15△△ 27.43±1.62△△ 20.52±1.24△△ 12.08±1.08△△ 1.51±0.11△△當(dāng)歸芍藥散低劑量組 8 42.44±2.10△△## 37.03±1.88△△## 28.08±1.30△△## 12.03±0.68△△ 1.40±0.05△當(dāng)歸芍藥散高劑量組 8 25.71±2.07△△##☆☆ 19.08±2.60△△##☆☆ 13.61±1.58△△##☆☆ 9.94±0.94△△#☆☆ 2.89±0.32△△##☆☆組別 動(dòng)物數(shù)/只

3.2 各組大鼠海馬組織病理形態(tài)比較 假手術(shù)組大鼠海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量多，體積大，排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，邊界清晰，胞膜、核膜清晰，胞核明顯。模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列稀疏，部分細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)不齊，胞核變小、固縮、凋亡，細(xì)胞膜、核膜界限不清。與模型組比較，各給藥組大鼠神經(jīng)元病理改變均較輕，其中當(dāng)歸芍藥散高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量顯著多于模型組，排列分布相對(duì)齊整，結(jié)構(gòu)形態(tài)基本正常。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織病理形態(tài)（HE染色，×100）

3.3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠海馬組織Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量、Bcl-2/Bax值均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）。各給藥組大鼠海馬組織Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量、Bcl-2/Bax值均明顯低于模型組（P＜0.01），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組（P＜0.01）。當(dāng)歸芍藥散高劑量對(duì)上述指標(biāo)的改善作用顯著優(yōu)于低劑量和陽(yáng)性藥物（P＜0.01），當(dāng)歸芍藥散低劑量組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá) 量、Bcl-2/Bax值 與 陽(yáng) 性 對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖2、表3。

表3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bcl-2/Bax值比較（±s）

表3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bcl-2/Bax值比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與當(dāng)歸芍藥散低劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax假手術(shù)組 8 0.19±0.04 0.13±0.03 1.46±0.25模型組 8 0.28±0.03** 0.08±0.02** 3.54±0.66**陽(yáng)性對(duì)照組 8 0.18±0.02△△ 0.19±0.01△△ 0.96±0.09△△當(dāng)歸芍藥散低劑量組 8 0.18±0.02△△ 0.15±0.01△△# 1.18±0.11△△當(dāng)歸芍藥散高劑量組 8 0.11±0.03△△##☆☆ 0.33±0.05△△##☆☆ 0.35±0.05△△##☆☆

3.4 各組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量比較 模型組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；各給藥組大鼠血清上述指標(biāo)含量均顯著低于模型組（P＜0.01），其中當(dāng)歸芍藥散高劑量組大鼠上述指標(biāo)水平均顯著低于低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量比較（±s）

表4 各組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，##P＜0.01；與當(dāng)歸芍藥散低劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 TNF-α/（pg/mL） NF-κB/（pg/mL）假手術(shù)組 8 50.16±10.10 26.81±4.11模型組 8 339.05±36.32** 180.13±11.64**陽(yáng)性對(duì)照組 8 176.08±11.14△△ 90.97±5.32△△當(dāng)歸芍藥散低劑量組 8 236.96±14.9△△## 118.58±7.70△△##當(dāng)歸芍藥散高劑量組 8 117.90±19.34△△##☆☆ 59.94±6.76△△##☆☆

3.5 各組大鼠海馬組織LRP1、RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 模型組大鼠海馬組織LRP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于假手術(shù)組（P＜0.01），RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）。各給藥組大鼠海馬組織LRP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于模型組（P＜0.01），RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.01）。當(dāng)歸芍藥散高劑量對(duì)大鼠海馬組織上述基因表達(dá)的改善作用顯著優(yōu)于低劑量和陽(yáng)性藥物（P＜0.05，P＜0.01），當(dāng)歸芍藥散低劑量對(duì)大鼠海馬組織LRP1 mRNA表達(dá)的提升作用顯著優(yōu)于陽(yáng)性藥物（P＜0.01）。詳見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠海馬組織LRP1 mRNA、RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表5 各組大鼠海馬組織LRP1 mRNA、RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與當(dāng)歸芍藥散低劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 LRP1 mRNA RAGE mRNA假手術(shù)組 8 8.55±0.24 0.20±0.02模型組 8 0.85±0.07** 13.18±1.50**陽(yáng)性對(duì)照組 8 1.66±0.31△△ 1.00±0.07△△當(dāng)歸芍藥散低劑量組 8 2.10±0.12△△## 7.92±0.52△△##當(dāng)歸芍藥散高劑量組 8 9.79±0.53△△##☆☆ 0.30±0.03△△#☆☆

4 討論

研究表明，VaD疾病進(jìn)程與NF-κB、TNF-α等炎性因子激活炎癥反應(yīng)，Bax、Bcl-2等凋亡因子加速神經(jīng)凋亡，LRP1、RAGE等轉(zhuǎn)運(yùn)因子調(diào)控Aβ沉積等密切相關(guān)，治療本病則應(yīng)基于改善Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元凋亡，調(diào)節(jié)Aβ沉積，抑制炎癥信號(hào)傳遞，增強(qiáng)血流灌注，在一定程度上減少腦組織損傷。

血管性癡呆屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇，《雜病源流犀燭·中風(fēng)源流》中提及“中風(fēng)后善忘”。本病病機(jī)復(fù)雜，可因五臟失和、腦竅失養(yǎng)、神失所養(yǎng)、神機(jī)失用而發(fā)病?，F(xiàn)代醫(yī)家基于前人經(jīng)驗(yàn)提出本病病因病機(jī)為髓海不足、脾腎不足、肝氣郁結(jié)、痰濁蒙竅等，以補(bǔ)髓益智、補(bǔ)益脾腎、行氣化郁等為治則，祛邪扶正，改善患者癥狀。當(dāng)歸芍藥散由當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、澤瀉、川芎六味藥物組成。方中川芎、當(dāng)歸、白芍補(bǔ)益氣血，茯苓、澤瀉、白術(shù)祛水化濕，其中白芍兼疏肝化瘀[11]。諸藥合用，開(kāi)斂結(jié)合，走守并進(jìn)，以肝脾兩臟入手，健脾益氣、養(yǎng)血柔肝，增強(qiáng)患者正氣，祛除積留體內(nèi)濕瘀之邪[12]。VaD患者多因肝脾不足、痰瘀阻滯而腦竅不通、神機(jī)失養(yǎng)，故以當(dāng)歸芍藥散補(bǔ)益肝脾、化痰祛瘀?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸芍藥散可通過(guò)調(diào)控凋亡因子、抑制炎癥反應(yīng)和減少Aβ沉積等途徑，調(diào)控炎癥介質(zhì)分泌，發(fā)揮抗炎作用，延緩細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫[13-15]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物治療VaD方向一致。

細(xì)胞凋亡受Bcl-2、Bax等凋亡因子影響[16]，控制線粒體膜的通透性，調(diào)節(jié)凋亡激活物的釋放，激活通道，Bax與Bcl-2形成易聚體，兩者協(xié)作調(diào)控細(xì)胞凋亡，因此逆轉(zhuǎn)兩種蛋白表達(dá)，可減輕腦損傷，一定程度上起到修復(fù)腦神經(jīng)的作用[17-18]。Aβ對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用導(dǎo)致血管壁淀粉樣變，進(jìn)而導(dǎo)致血管硬化、彈性變差，增加血管壁破裂以及血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，甚至誘使神經(jīng)元過(guò)早凋亡。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ沉積抑制突觸生長(zhǎng)，導(dǎo)致神經(jīng)變性，降低神經(jīng)元存活率，進(jìn)而推動(dòng)VaD病情進(jìn)展[19]。LRP1作為大腦中參與代謝的主要受體，廣泛存在于神經(jīng)元細(xì)胞中，不僅參與脂質(zhì)代謝，而且是清除Aβ的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，其功能水平降低與認(rèn)知性障礙加重密切相關(guān)[20]；RAGE作為膜蛋白，則是通過(guò)介導(dǎo)多種激酶，激活炎癥信號(hào)通路，引起細(xì)胞凋亡壞死[21]。LRP1與RAGE均為Aβ重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與調(diào)節(jié)Aβ沉積[22]，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活、神經(jīng)炎癥發(fā)生、神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程[23]。NF-κB作為缺血損傷反應(yīng)最早的關(guān)鍵因子，同時(shí)又是起關(guān)鍵作用的核轉(zhuǎn)錄因子[24]，在機(jī)體炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的分裂分化和成熟等方面發(fā)揮重要作用[25]，腦缺血組織損傷激活NF-κB[26]，促進(jìn)TNF-α表達(dá)[27]，若抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用，減少神經(jīng)炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，保護(hù)神經(jīng)元功能，則能延緩VaD疾病進(jìn)程[28]。

本研究結(jié)果表明，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯異常，海馬組織神經(jīng)元損傷，血清TNF-α、NF-κB表達(dá)增加，海馬組織Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2/Bax值增加，LRP1 mRNA表達(dá)降低，RAGE mRNA表達(dá)增加，炎癥、凋亡及Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)細(xì)胞因子均出現(xiàn)異常表現(xiàn)。經(jīng)當(dāng)歸芍藥散、尼莫地平治療后，VaD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高，海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)明顯恢復(fù)，上述細(xì)胞因子得到顯著改善，其中當(dāng)歸芍藥散高劑量效果更為明顯，顯著優(yōu)于低劑量和陽(yáng)性藥物尼莫地平。

綜上，當(dāng)歸芍藥散對(duì)VaD模型大鼠有一定的治療作用，且可顯著改善VaD模型大鼠海馬組織細(xì)胞形態(tài)，其可能的作用機(jī)制：通過(guò)抑制TNF-α、NF-κB表達(dá)緩解大鼠海馬組織炎癥反應(yīng)，一定程度上減少腦組織損傷，提高認(rèn)知水平；通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax凋亡因子延緩細(xì)胞凋亡，改善VaD神經(jīng)損傷，起到腦保護(hù)作用；通過(guò)激活LRP1、抑制RAGE兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，促進(jìn)Aβ清除，減少Aβ沉積，促進(jìn)海馬突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)重塑。且當(dāng)歸芍藥散上述作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。由于本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本數(shù)較少，藥物濃度梯度不足，下一步將增加樣本量，豐富中藥濃度梯度，并進(jìn)一步分析當(dāng)歸芍藥散有效成分，探索其他作用靶點(diǎn)，深入研究其作用機(jī)制，從而更好地指導(dǎo)臨床運(yùn)用。