銀杏內(nèi)酯B 對(duì)肥胖小鼠的改善作用研究

尹忞強(qiáng)，羅來(lái)慶，湯海蓮，陳金女，李 琴，黃露怡，焦宇知,

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223001；2.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院蘇州旅游與財(cái)經(jīng)分院，江蘇蘇州 215000）

肥胖是一種由于能量代謝失衡導(dǎo)致體內(nèi)脂肪過(guò)度積累的慢性代謝性疾病[1]。據(jù)報(bào)道，全球約有6.5 億成年人和3.4 億兒童和青少年（5～19 歲）患有肥胖癥[2]。而截至2019 年，我國(guó)約有46%的成年人和15%的兒童肥胖或超重[3]，同時(shí)，肥胖的患病率還在快速升高。大量研究證實(shí)，肥胖與常見的慢性疾病如心血管疾病、2 型糖尿病、高血壓以及某些類型的癌癥密切相關(guān)[4-6]。甚至，肥胖還被認(rèn)為是導(dǎo)致COVID-19 惡化的危險(xiǎn)因素之一[7]。因此，肥胖的預(yù)防和改善對(duì)我國(guó)公民的公共健康具有重要意義。

銀杏是我國(guó)獨(dú)有的一種中生代孑遺植物，銀杏果和銀杏葉為傳統(tǒng)中藥品種[8]。其中銀杏葉性平、味苦澀，歸心、肺經(jīng)，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、化濁降脂的功效[9]。有研究顯示，銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）能夠通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制血小板活化，是銀杏葉提取物發(fā)揮血小板拮抗作用的主要成分[10]。同時(shí)也有文獻(xiàn)表明，GB 可有效改善阿爾茨海默癥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[11]，高劑量GB 也可改善帕金森病模型大鼠行為學(xué)，增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力，減輕炎癥損傷，具有一定的保護(hù)作用[12]。與此同時(shí)，GB 也被證實(shí)具有一定的抗肺癌作用[13]。但目前GB 對(duì)肥胖干預(yù)作用的相關(guān)研究仍較少。

因此，本研究擬通過(guò)高脂膳食誘導(dǎo)建立C57BL/6J 小鼠肥胖模型，進(jìn)一步采用不同劑量的GB 進(jìn)行干預(yù)處理，分析各組小鼠的肥胖指標(biāo)以此探究GB 對(duì)肥胖可能的改善作用。本研究將為銀杏葉活性成分對(duì)肥胖的預(yù)防和改善提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為銀杏葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GB 純度＞95%，上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；ELISA 試劑盒 eBioscience 公司；蘇木精、伊紅、油紅O 染色液 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多聚甲醛、二甲苯 蘇州曉東宜健公司；雄性C57BL/6J 小鼠 50 只，鼠齡4 周，體重18～20 g蘇州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0002）；基礎(chǔ)飼料、高脂飼料 江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

TGL-16M 型高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀有限公司；BS-600M 型全自動(dòng)生化分析儀 深圳邁瑞有限公司；TB718 型石蠟包埋機(jī) 湖北泰維醫(yī)療科技有限公司；RM2245 型石蠟切片機(jī) 德國(guó)Leica 公司；BX51 型光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肥胖小鼠模型構(gòu)建及分組處理 C57BL/6J 小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后被隨機(jī)分為高脂模型組（n=50）與空白對(duì)照組（n=8），分別喂以高脂飼料和基礎(chǔ)飼料，喂養(yǎng)16 周，以模型組小鼠體質(zhì)量超過(guò)普通組平均體質(zhì)量的20%為依據(jù)[10]，篩選出肥胖小鼠32 只，隨后按體重隨機(jī)分為4 組，模型組（PG，n=8）、GB 低劑量組（GBL，n=8）、GB 中劑量組（GBM，n=8）和GB 高劑量組（GBH，n=8）。干預(yù)處理：PG 組每日1 次腹腔注射生理鹽水5 mL/kg，GBL、GBM和GBH 組每日 1 次腹腔注射20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg 的GB 溶液，干預(yù)處理時(shí)間均為8 周。

1.2.2 體重及脂肪系數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開始前小鼠空腹12 h 稱重，最后一次干預(yù)后，小鼠禁食12 h，稱量小鼠體重。處死小鼠后，解剖，將腎周和附睪脂肪分離取出，稱重，計(jì)算脂肪系數(shù)。

1.2.3 血脂相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 干預(yù)8 周后，各組小鼠空腹24 h 后進(jìn)行眼眥取血，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TC、TG、LDL-C 和HLD-C。

1.2.4 病理觀察 小鼠處死后，無(wú)菌條件下取部分肝臟和附睪脂肪。經(jīng)4%多聚甲醛固定，然后脫水包埋在石蠟中，然后將肝組織和附睪脂肪組織切成5 μm 厚的切片，固定在載玻片上并烘干。隨后將組織切片分別浸泡在二甲苯、梯度濃度的乙醇和蘇木精中，并用樹脂密封。肝組織固定后，加入最佳切割溫度包埋劑包埋。然后，將組織冷凍成塊并切成5 μm 厚的切片，冷凍切片在室溫下干燥，并用10%的多聚甲醛固定。洗滌、浸泡和脫水后，加入油紅O 染色液進(jìn)行染色，并將切片浸入體積比為85%的異丙醇中。蘇木精用于復(fù)染以顯示細(xì)胞核。最后，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色切片，分析組織病理學(xué)的差異。

1.2.5 qRT-PCR 小鼠處死后，無(wú)菌條件下取部分肝臟，用Trizol 提取肝臟樣本中總RNA，先將小鼠肝臟組織研磨破碎，隨后加入Trizol 進(jìn)行勻漿處理，室溫放置5 min 后，加入氯仿振蕩。4 ℃，10000×g 離心后取上層水相，使用異丙醇沉淀水相中的RNA。再次離心后使用75%乙醇洗滌RNA 沉淀。4 ℃，8000×g離心，棄沉淀，室溫放置干燥RNA 沉淀后，加入無(wú)RNase 水吸打使得RNA 溶解。并用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)RNA 的濃度和質(zhì)量。根據(jù)所測(cè)RNA 濃度，嚴(yán)格按照說(shuō)明書使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將引物、cDNA 與SYBR Green Mix混勻，使用熒光定量PCR 儀擴(kuò)增并檢測(cè)熒光強(qiáng)度（表1）。參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，53～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。基因引物的設(shè)計(jì)參考引物數(shù)據(jù)庫(kù)，以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法對(duì)PPARγ、UCP-2的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行分析。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用GraphPad Prism 5.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GB 對(duì)肥胖小鼠體重增長(zhǎng)的影響

本研究首先采用高脂飲食誘導(dǎo)建立C57BL/6J小鼠肥胖模型，造模期間同時(shí)觀察小鼠的生理狀態(tài)，模型組和對(duì)照組兩組小鼠進(jìn)食量無(wú)明顯差異，但肥胖模型組小鼠毛色明顯油亮，飲水量較空白對(duì)照組有所增加；高脂膳食飼喂4 周后，肥胖模型組小鼠體重顯著上升（P＜0.05），16 周后，篩選出32 只肥胖小鼠，進(jìn)行GB 干預(yù)處理。由圖1 可知，GB 干預(yù)后，和PG組（7.35±0.61 g）相比，GBL 組（6.86±0.50 g）小鼠體重增長(zhǎng)量略有下降，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而GBM 組（6.00±0.52 g）和GBH 組（5.80±0.31 g）小鼠體重增長(zhǎng)量均顯著低于PG 組（P＜0.05），分別下降了18.37%和21.09%。

圖1 不同濃度的GB 對(duì)肥胖小鼠體重增長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of GB on weight gain of obese mice

2.2 GB 對(duì)肥胖小鼠臟器脂肪系數(shù)的影響

為進(jìn)一步評(píng)估不同濃度的GB 對(duì)肥胖小鼠內(nèi)臟脂肪的影響，在干預(yù)8 周后，測(cè)量了各組小鼠的附睪和腎周脂肪系數(shù)。結(jié)果如圖2 所示，與PG 組小鼠相比，GBH 組小鼠的附睪及腎周脂肪系數(shù)顯著降低（P＜0.05），分別降低了22.02%和36.51%；GBM 組小鼠附睪脂肪系數(shù)與PG 組相比下降了12.22%（P＜0.05），腎周脂肪系數(shù)雖然略有下降（16.27%），但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；而GBL 組小鼠的附睪及腎周脂肪系數(shù)和PG 組小鼠相比，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。經(jīng)過(guò)中高劑量的GB 干預(yù)后，肥胖小鼠的體重增長(zhǎng)及內(nèi)臟脂肪系數(shù)均得到不同程度的抑制，尤其是高濃度的GB 效果更明顯，與空白對(duì)照組相近，差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。此外，陸江等[14]的研究表明，銀杏葉提取物可以降低肥胖犬的體重、體脂率，這與本研究結(jié)果類似。

圖2 不同濃度的GB 對(duì)肥胖小鼠內(nèi)臟脂肪系數(shù)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of GB on visceral fat coefficient of obese mice

2.3 GB 對(duì)肥胖小鼠血清TC、TG、LDL-C 和HDL-C的影響

本研究測(cè)定了各組小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C 水平，結(jié)果如圖3 所示。與PG 組相比，GBM 組和GBH 組小鼠的血清TC 水平顯著降低（P＜0.05），分別降低了27.49%和38.16%；此外，GBM組和GBH 組小鼠的血清LDL-C 水平與PG 組相比也分別降低了26.44%和37.39%。但只有GBH 組小鼠的血清TG 水平較PG 組顯著降低（P＜0.05），降低了27.32%，GBM 組小鼠的血清TG水平有降低趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，與PG 組相比，GBM 組和GBH 組的HDL-C 水平顯著升高（P＜0.05），分別升高了38.33%和72.50%。這表明中高劑量的GB 能有效調(diào)節(jié)肥胖小鼠的血脂水平，其中，高劑量的GB 干預(yù)改善機(jī)體脂蛋白分布的效果更好。不同劑量的GB 均有效降低肥胖小鼠血清中的TG、TC 和LDL-C，并且這種抑制作用具有劑量依賴關(guān)系，另外，中高劑量的GB 還能顯著（P＜0.05）增加HDL-C 的濃度，這說(shuō)明中高劑量的GB 干預(yù)能有效改善肥胖小鼠的血脂異常狀態(tài)。顏景灝等[15]的研究也證實(shí)了銀杏葉水溶液干預(yù)的肥胖大鼠血清TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平顯著低于高脂對(duì)照組，且銀杏葉水提取物濃度越高，改善效果越佳，表明銀杏葉片水溶液在治療高脂血癥方面療效明顯，這與本研究結(jié)果一致。

圖3 不同濃度的GB 對(duì)肥胖小鼠血清指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of different concentrations of GB on serum indexes of obese mice

2.4 GB 對(duì)肥胖小鼠肝臟及脂肪染色的影響

本研究對(duì)各組小鼠肝臟切片進(jìn)行油紅O 染色，對(duì)附睪脂肪切片進(jìn)行HE 染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果如圖4 所示，肝臟油紅O 染色結(jié)果顯示，PG 組小鼠肝臟切片中有大量明顯的紅色脂滴，GBL 組小鼠肝臟切片中也有不同密度的紅色脂滴，說(shuō)明其小鼠肝臟中也存在脂肪沉積，而GBM 組及GBH 組小鼠肝臟切片中幾乎未觀察到紅色脂滴，說(shuō)明其肝臟脂肪沉積較少；此外，附睪脂肪切片的HE 染色結(jié)果顯示，與PG 組相比，GBM 組及GBH組小鼠的附睪脂肪細(xì)胞顯著減小。這表明中高劑量的GB 能有效改善肥胖小鼠肝臟的脂質(zhì)變性，減少內(nèi)臟脂肪沉積，也進(jìn)一步說(shuō)明了GB 能夠改善脂肪代謝。

圖4 不同濃度的GB 對(duì)肥胖小鼠肝臟及脂肪染色的影響（200×）Fig.4 Effects of different concentrations of GB on liver and fat staining of obese mice (200×)

2.5 GB 對(duì)肥胖小鼠脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究不同濃度GB 可能的影響機(jī)體脂質(zhì)代謝機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)探究了GB 對(duì)各組肥胖小鼠肝臟PPARγ、UCP-2基因表達(dá)的影響。結(jié)果如圖5 所示，與PG 相比，GBM 組和GBH 組小鼠肝臟PPARγ的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），GBH 組小鼠肝臟PPARγ的mRNA 表達(dá)水平與空白對(duì)照組水平相近；同時(shí)，對(duì)UCP-2 的基因表達(dá)水平分析結(jié)果顯示，與PG 相比，GBM 組和GBH 組小鼠肝臟UCP2的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），GBL 組和PG 組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。該結(jié)果說(shuō)明，中高劑量的GB 干預(yù)能夠降低肥胖小鼠肝臟PPARγ的表達(dá)，促進(jìn)肥胖小鼠肝臟UCP-2 的表達(dá)。

圖5 不同濃度的GB 對(duì)肥胖小鼠肝臟PPARγ、UCP-2 基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of GB on the expression of PPARγ and UCP-2 genes in liver of obese mice

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中高劑量的GB 顯著抑制了PPARγ的mRNA 表達(dá)，而提高了UCP-2 的mRNA 表達(dá)。研究證實(shí)，肝臟中PPARγ過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致脂肪在肝組織中積累[16-18]，同時(shí)，文獻(xiàn)[14,19]表明，銀杏葉提取物能改善犬的肥胖癥狀，降低血脂，減少脂肪組織脂質(zhì)沉積。其作用機(jī)制可能與銀杏葉提取物激活A(yù)MPK 信號(hào)通路，抑制PPARγ信號(hào)通路有關(guān)，與本文研究結(jié)果相似[15,20-21]。UCP-2 在哺乳動(dòng)物大部分組織中廣泛分布，并且它能激活A(yù)MPK[22]，使其通過(guò)自身磷酸化的增加促進(jìn)下游ACC 磷酸化，從而增加脂肪酸的氧化，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[23]。這說(shuō)明UCP-2 是能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)降低會(huì)使能量消耗減小，導(dǎo)致肥胖[24-25]。UCP-2 是線粒體產(chǎn)生活性氧的不良調(diào)節(jié)劑，而其過(guò)表達(dá)可阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，它通過(guò)抑制活性氧生成和提高一氧化氮水平來(lái)改善血管內(nèi)皮功能[26]。Lan 等[27]的研究表明，在UCP-2 抑制劑存在的情況下，姜黃素改善血管功能的作用被阻斷。而在本研究中，中高劑量的GB 提高了UCP-2的mRNA 表達(dá)水平，這可能與改善小鼠肥胖機(jī)制相關(guān)。除此之外，有研究證實(shí)，PPARγ是UCP-2 的有效調(diào)節(jié)因子[28-30]，因此推測(cè)中高劑量的GB 可能通過(guò)PPARγ-UCP-2 信號(hào)途徑調(diào)節(jié)肥胖小鼠的機(jī)體能量和脂質(zhì)代謝。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)建立小鼠肥胖模型，給予肥胖小鼠不同濃度的GB 干預(yù)，通過(guò)比較其對(duì)肥胖小鼠體重和內(nèi)臟脂肪系數(shù)、血清生化指標(biāo)的影響來(lái)分析不同劑量的GB 對(duì)小鼠肥胖的改善作用。結(jié)果表明，在經(jīng)過(guò)8 周40 mg/kg、80 mg/kg 的GB 干預(yù)，肥胖小鼠的體重和附睪及腎周脂肪系數(shù)均顯著降低；此外，中高劑量的GB 均有效降低肥胖小鼠血清中的TG、TC 和LDL-C，另外，中高劑量的GB 還能顯著增加HDL-C 的濃度，改善肥胖小鼠肝臟的脂質(zhì)變性，減少內(nèi)臟脂肪沉積。為進(jìn)一步探究GB 改善肥胖作用的可能機(jī)制，本研究進(jìn)一步研究了GB 對(duì)肥胖小鼠肝臟PPARγ、UCP-2基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中高劑量的GB 有效抑制了肥胖小鼠肝臟PPARγ的表達(dá)，促進(jìn)肥胖小鼠肝臟UCP-2 的表達(dá)，這說(shuō)明GB 對(duì)肥胖小鼠的改善作用可能和PPARγ-UCP-2 信號(hào)途徑有關(guān)。本研究為GB 的進(jìn)一步加工利用提供了理論依據(jù)，但值得注意的是，考慮到小鼠和人類的種群差異，GB 對(duì)于人體肥胖的改善作用還需要臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。