仿野生種植三葉青不同部位總黃酮分析及其抗炎、抗氧化能力比較

汪傳寶，陳靜文，王 可，仇鳳梅，黃 真，鐘曉明,

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053；2.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興 314001）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg），又稱金線吊葫蘆、蛇附子、石抱子、三葉對，是一種具有重要藥用價(jià)值的多年生常綠藤本植物[1]。作為一種珍貴的中草藥材，三葉青在我國分布較廣，常見于浙江、江西、福建、廣西等地，全草皆可入藥，以塊根最佳[2]。藥理研究表明，三葉青具有抗腫瘤[3]、抗病毒[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]等生理活性。作為浙產(chǎn)地道藥材，三葉青常被用于小兒高熱驚厥、痢疾、活血散結(jié)、祛風(fēng)化痰等治療[7]。也有研究將三葉青添加到食用油中用作保健食品從而更有利于保留功效[8]；將鈣果和三葉青為主料加工成鈣果三葉青營養(yǎng)片等。三葉青的黃酮類物質(zhì)被廣泛認(rèn)為是其重要的藥物組成部分[9]，已有研究證實(shí)多種藥理活性與黃酮類密切相關(guān)[10-12]。目前，因?yàn)槿~青藥用價(jià)值較高，市場需求越來越大，導(dǎo)致三葉青市場價(jià)格突飛猛進(jìn)，人們對于三葉青野生資源的過度采挖，造成其自然條件下的野生資源逐漸減少。三葉青人工種植是解決這一現(xiàn)狀的主要手段之一[13]。又因其藥用部位以塊根為主，種植采收后的地上部分和根須[14]極少被合理利用，存在大量的資源浪費(fèi)。近年來，已有學(xué)者從三葉青塊根中分離出具有抗炎活性的物質(zhì)，證實(shí)三葉青塊根具有良好的抗炎活性[15]。本文從物質(zhì)基礎(chǔ)和功效方面比較仿野生種植三葉青不同部位間的差異，以期為仿野生種植三葉青質(zhì)量控制提供參考依據(jù)，并對仿野生種植三葉青資源的合理開發(fā)利用提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三葉青樣品 浙江麗水仿野生種植栽培基地2021 年8 月份采收，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院資源研究所黃真教授鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉青Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg 的干燥全株；蘆丁（純度均＞98%）、槲皮素（純度均＞98%）、山奈酚（純度均＞98%）、1,1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇 色譜純，美國Tedia 公司；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）酷爾化學(xué)；L-抗壞血酸（VC）、脂多糖（LPS）Sigma 公司；RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞 由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)；胎牛血清四季青公司；DMEM 培養(yǎng)基 Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液、PBS 緩沖液 Biosharp 公司；二甲基亞砜分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NO 檢測試劑盒 碧云天；其他試劑為分析純；超純水 Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備。

ME203E 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；GZX-9140MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海帥登儀器有限公司；HH-2 恒溫水浴鍋 上海宜昌儀器廠；UV-1800 紫外分光光度計(jì) 杭州宗燦科技有限公司；Waters 高效液相（HPLC）色譜儀 美國Waters 公司；ELX800 酶標(biāo)儀 美國博騰儀器有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾科技公司；超凈工作臺 丹麥Labogene 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三葉青不同部位總黃酮提取與含量測定

1.2.1.1 三葉青不同部位總黃酮的提取 仿野生種植三葉青莖葉、塊根、根須置于陰涼干燥處，自然干燥、粉碎、過50 目篩處理后，收集作為樣品粉末。精密稱取三葉青樣品粉末1.00 g，按照如下熱回流提取工藝進(jìn)行提取，料液比1:30 g·mL-1，溫度83 ℃，提取時(shí)間65 min，乙醇濃度60%。濾液經(jīng)抽濾后，用50 mL 容量瓶定容，備用[16]。

1.2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻(xiàn)[17]并加以修改，標(biāo)準(zhǔn)品的制備：精密稱取蘆丁10.0 mg，用60%乙醇進(jìn)行溶解，定容至10 mL 容量瓶中，搖勻后即得。測定方法：精密吸取配制好的蘆丁對照品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入到25 mL 容量瓶中，先加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min 后再加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min 后加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，用純水定容至25 mL，混勻后靜置15 min。以純水作為空白對照，采用紫外分光光度計(jì)測量各樣品在510 nm 波長處的吸光度值，以吸光度（A）對蘆丁質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，得到回歸方程：A=10.613X-0.0171（R2=0.9999）。

1.2.1.3 三葉青不同部位總黃酮的測定 精密量取三葉青試樣溶液2.0 mL，并置于25 mL 容量瓶中進(jìn)行定容，按照“1.2.1.2”中所述方法操作，測定三葉青總黃酮得率，以如下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中，Y 為三葉青總黃酮得率，mg·g-1；C 為三葉青總黃酮的質(zhì)量濃度，mg·mL-1；V 為三葉青提取液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為三葉青樣品質(zhì)量，mg。

1.2.2 三葉青不同部位指標(biāo)成分的含量差異測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取蘆丁、山奈酚、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，向其中分別加入1 mL純甲醇，使其完全溶解，稀釋至1.0 mg/mL，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取三葉青樣品適量，粉碎后精密稱量各不同部位粉末1.0 mg，置于圓底燒瓶中，采用醇提工藝[15]進(jìn)行提取，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)移并定容至5 mL 容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品。

1.2.2.3 色譜條件 采用Waters Sunfire C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸水為水相（A 相）-乙腈為有機(jī)相（B 相），梯度洗脫條件為（0～5 min，10% B；5～15 min，10%～12% B；15～30 min，12% B；30～35 min，12%～13% B；35～75 min，13%～43% B；75～90 min，43%～73% B；90～110 min，73%～100% B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取適當(dāng)?shù)幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)品溶液配制成濃度均為100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再依次稀釋成50、20、10、5、1 μg/mL 的系列溶液，分別進(jìn)樣，在360 nm 波長下測定各組分的峰面積，以峰面積對標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定各成分的線性范圍。

1.2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

1.2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品溶液，在“1.2.2.3”條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次[18]，計(jì)算得出槲皮素峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 值。

1.2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品溶液，在“1.2.2.3”條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定[18]，計(jì)算得出槲皮素峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 值。

1.2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6 份供試品溶液，在“1.2.2.3”條件下進(jìn)樣[18]，計(jì)算得出槲皮素峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 值。

1.2.4 三葉青不同部位黃酮提取物體外抗氧化能力測定

1.2.4.1 DPPH 自由基清除率測定 參考文獻(xiàn)[19]并加以改進(jìn)，將該提取工藝下得到的不同部位三葉青樣品配制成0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL 質(zhì)量濃度的樣品溶液。精密量取三葉青待測液各2 mL，和含有2 mL 1×10-4mol/L 的DPPH 溶液充分搖勻后避光靜置30 min，以純水作為空白組，在517 nm 波長處測定吸光度，以VC為對照品。按下式計(jì)算清除率。

式中：Ao表示純水和DPPH 溶液的吸光值；Ax表示三葉青樣品和DPPH 溶液的吸光值；Axo表示三葉青樣品和無水乙醇的吸光值。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除率測定 參考文獻(xiàn)[20]并加以改進(jìn)，提前配制好7.4 mmol/L 的ABTS 溶液與2.6 mmol/L 的過硫酸鉀溶液1:1 混合均勻，避光靜置過夜后，制成ABTS 儲備液。實(shí)驗(yàn)時(shí)用95%乙醇稀釋，使其在734 nm 波長下的A 值為0.700±0.020。

將該提取工藝下得到的不同部位三葉青樣品配制成0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL 質(zhì)量濃度的樣品溶液。取0.2 mL 樣品溶液，加入0.8 mL ABTS 工作液，混勻，在室溫下避光反應(yīng)10 min，空白組選擇用95%乙醇代替，在734 nm 波長下測定吸光度，以VC為對照品，按式（3）計(jì)算清除率。

式中：Ao表示95%乙醇和ABTS+溶液的吸光度；A 表示三葉青樣品和ABTS+溶液的吸光度。

1.2.4.3 羥自由基清除率測定 參考文獻(xiàn)[21]并加以改進(jìn)，將該提取工藝下得到的三葉青不同部位配制成0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL 質(zhì)量濃度的樣品溶液。吸取2 mL 三葉青待測液于試管中，依次加入9 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液2 mL、9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液2 mL 和9 mmol/L 的過氧化氫溶液2 mL，搖勻，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，冷卻后于510 nm 波長處測量吸光度，以純水作為空白組，以同濃度的VC作為對照組，按式（4）計(jì)算清除率。

式中：Ao表示純水+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+H2O2溶液的吸光值；Ax表示三葉青樣品+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+H2O2溶液的吸光值；Axo表示三葉青樣品+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液的吸光值。

1.2.4.4 鐵離子還原力測定 參考文獻(xiàn)[22]并加以改進(jìn)，將該提取工藝下得到的不同部位三葉青樣品配制成0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL 質(zhì)量濃度的樣品溶液。取1 mL 三葉青樣品于試管中，加入2.5 mL 磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH7.4），2.5 mL 1.0%鐵氰化鉀溶液混合均勻后置于50 ℃條件下反應(yīng)20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，于4000 r/min 離心10 min，吸取上清液2.5 mL 于另一試管中，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 三氯化鐵溶液（0.1%），混勻后靜置10 min，以同濃度的Vc 為對照品在700 nm 波長處測定吸光度值，吸光度值越大，說明該樣品對鐵離子的還原能力越強(qiáng)。

1.2.5 三葉青不同部位黃酮提取物抗炎能力測定

1.2.5.1 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW 264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.2 MTT 法篩選給藥安全濃度 參考文獻(xiàn)[23]并加以改進(jìn)，待RAW264.7 細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cell/mL，吹打均勻后，接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置空白組，正常組和給藥組，給藥組加入100 μL/孔的25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL 系列濃度的三葉青提取物溶液，正常組不添加藥物，代之等量的培養(yǎng)基；空白組不接種細(xì)胞，加入等量的培養(yǎng)基。每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5% CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS 溶液洗滌2 次，每孔加入5 mg/mL MTT 工作液100 μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，用移液槍吸去上清液，補(bǔ)加150 μL DMSO溶液，震蕩溶解13 min，立即至酶標(biāo)儀檢測490 nm波長下的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，按式（5）計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.2.5.3 Griess 法測定NO 釋放量 參考文獻(xiàn)[23]并加以改進(jìn)，待RAW264.7 細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cell/mL，吹打均勻后，將細(xì)胞分為正常組、模型組、阿司匹林（Aspirin，陽性藥）組和給藥低中高組，分別接種于96 孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，模型組不加入藥物，加入等量的培養(yǎng)基；陽性藥組加入含阿司匹林的培養(yǎng)基溶液，使終濃度為100 μg/mL；給藥組添加含待測樣品的培養(yǎng)基溶液，分別以終濃度為50、100、200 μg/mL。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5% CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h。其中模型組、陽性藥組、給藥組，在培養(yǎng)24 h 后，棄去原先培養(yǎng)基，加入200 μL 含1 μg/mL LPS 的DMEM 培養(yǎng)基，正常組代之等量的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待測樣品孔中加入各組培養(yǎng)上清液50 μL，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入濃度0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L 各50 μL，零孔加入培養(yǎng)基50 μL。各孔中分別加入50 μL 的Griess Reagent Ⅰ，再加入50 μL 的Griess Reagent Ⅱ，在540 nm 波長下測定OD 值，根據(jù)試劑盒說明書計(jì)算NO 釋放量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均為3 次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著；采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青不同部位總黃酮含量

2.1.1 三葉青不同部位的黃酮提取物得率比較 分別稱取三葉青莖葉，塊根，根須三個(gè)部位藥材粉末33.30 g，以最佳提取工藝提取，抽濾，旋蒸，烘干，計(jì)算提取物得率。結(jié)果顯示，莖葉的提取物得率為8.96%±0.02%；塊根的提取物得率為12.06%±0.02%；根須的提取物得率為7.23%±0.01%。

2.1.2 三葉青不同部位總黃酮含量差異 結(jié)果顯示，莖葉總黃酮含量為11.86±0.23 mg·g-1；塊根總黃酮含量為8.48±0.10 mg·g-1；根須總黃酮含量為7.52±0.02 mg·g-1。從得率和總黃酮含量比較看，莖葉部分的總黃酮含量最高，得率次于塊根部分，在資源開發(fā)方面保證了產(chǎn)量，這有利于后續(xù)對三葉青莖葉部分的開發(fā)利用。

2.2 三葉青不同部位總黃酮HPLC 指紋圖譜的建立

通過將三葉青色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”中，如圖1 所示，根據(jù)相同的保留時(shí)間共標(biāo)定了10 個(gè)共有峰，三個(gè)部位的液相色譜圖比較，莖葉的色譜峰更多，表明成分更豐富。從出峰的強(qiáng)度來看，莖葉樣品的總峰面積更多，所含有的化學(xué)成分含量更多，這對三葉青莖葉化學(xué)成分進(jìn)一步研究提供了參考。與混合對照品比對，指認(rèn)其中三個(gè)指標(biāo)成分，確認(rèn)6 號峰為蘆丁，8 號峰為槲皮素，9 號峰為山奈酚，可以進(jìn)一步進(jìn)行含量測定。

圖1 三葉青樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批塊根樣品為供試品，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以8 號峰為參考峰，計(jì)算得出各樣品峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 值分別為0.5%、0.9%，表明該儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批塊根樣品為供試品，分別在配制后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定，以8 號峰為參考峰，計(jì)算得出各樣品峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 值分別為0.1%、1.0%，表明供試品在24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6 份塊根樣品為供試品，分別進(jìn)樣，以8 號峰為參考峰，計(jì)算得出各樣品峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 值分別為0.5%、1.3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與線性范圍的確定

通過查看各標(biāo)準(zhǔn)品在200～400 nm 下的光譜圖，發(fā)現(xiàn)蘆丁、槲皮素、山奈酚在360 nm 左右有較強(qiáng)吸收，于是對各標(biāo)準(zhǔn)品在360 nm 波長下對各峰進(jìn)行積分。以標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)峰的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2 所示，線性方程分別為：蘆丁，y=878.39x-689.21，R2=0.9993；槲皮素，y=3199.5x-5555.1，R2=0.9992；山奈酚，y=3725.6x-2189.5，R2=0.9994。蘆丁，槲皮素，山奈酚均在1～100 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系。

圖2 三葉青不同部位指標(biāo)成分含量比較（±s，n=3）Fig.2 Comparison of contents of index components in different parts of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg（±s，n=3）

2.5 三葉青不同部位指標(biāo)成分的含量差異

將三葉青的三個(gè)不同部位進(jìn)行HPLC 檢測，對三個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，蘆丁，槲皮素和山奈酚在塊根樣品中含量都是最高。蘆丁含量由高到低依次為塊根（4.99 mg/kg）、根須（2.79 mg/kg）、莖葉（2.49 mg/kg）。槲皮素含量由高到低依次為塊根（30.93 mg/kg）、根須（14.75 mg/kg）、莖葉（9.59 mg/kg）。山奈酚含量由高到低依次為塊根（4.89 mg/kg）、根須（4.28 mg/kg）、莖葉（3.43 mg/kg）。從總體上看，塊根中的三種指標(biāo)成分含量最多[24]，但是從總黃酮含量以及高效液相色譜圖分析，莖葉中有著更加豐富的成分，表明三葉青不同部位間各化學(xué)成分不同，各成分含量也不盡相同，這與藍(lán)艷等[25]對不同產(chǎn)地三葉青中化學(xué)成分測定的結(jié)果相似?？赡艿脑蚴侨~青在生長過程中化學(xué)成分富集的部位不同，且莖葉部位的成分種類更多可能跟光合作用有關(guān)，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

2.6 三葉青不同部位體外抗氧化能力差異

2.6.1 三葉青黃酮提取物對DPPH 自由基的清除能力 由圖3 可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，三葉青不同部位對DPPH 自由基的清除率逐漸提高，在質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 時(shí)，三葉青莖葉的清除率為95.08%，IC50值為0.2107 mg/mL；塊根的清除率為91.53%，IC50值為0.3134 mg/mL；根須的清除率為94.12%，IC50值為0.2058 mg/mL。而VC對DPPH的清除率在0～0.1 mg/mL 的范圍內(nèi)急劇增加，達(dá)到96.67%，此后基本維持在此水平。由此可見，三葉青提取物對DPPH 自由基具有一定的清除能力，但與Vc 相比能力較弱。且三葉青不同部位之間也有差異，莖葉和根須的清除能力較塊根強(qiáng)一些。張進(jìn)軍等[26]對浙產(chǎn)三葉青地上部分抗氧化活性評價(jià)，測得對DPPH 自由基清除率的IC50值為0.1902 mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果相符，為仿野生種植三葉青更加全面、客觀的評價(jià)抗氧化能力提供了參考。

圖3 三葉青對DPPH 自由基清除率的影響Fig.3 Scavenging effect of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on DPPH radical

2.6.2 三葉青黃酮提取物對ABTS+自由基的清除能力 由圖4 可知，隨著質(zhì)量濃度的增大，三葉青不同部位對ABTS+自由基的清除率逐漸提高，在質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 時(shí)，三葉青莖葉的清除率為97.56%，IC50值為0.2315 mg/mL；塊根的清除率為89.64%，IC50值為0.3758 mg/mL；根須的清除率為99.91%，IC50值為0.2587 mg/mL。而VC對ABTS+自由基的清除率在0～0.1 mg/mL 的范圍內(nèi)急劇增加，達(dá)到99.70%，此后基本維持在此水平。由此可見，三葉青提取物對ABTS+自由基具有一定的清除能力，但與VC相比能力較弱。且三葉青不同部位之間也有差異，莖葉和根須的清除能力較塊根強(qiáng)一些。

圖4 三葉青對ABTS+自由基清除率的影響Fig.4 Scavenging effect of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on ABTS+ radical

2.6.3 三葉青黃酮提取物對羥自由基清除能力 由圖5 可知，隨著質(zhì)量濃度的增大，三葉青不同部位對羥自由基的清除率呈現(xiàn)上升趨勢。當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，三葉青莖葉的清除率為77.50%，IC50值為0.7625 mg/mL；塊根的清除率為68.21%，IC50值為0.8967 mg/mL；根須的清除率為78.96%，IC50值為0.7856 mg/mL。而VC對羥自由基的清除率在0～0.4 mg/mL 的范圍內(nèi)呈上升趨勢，在0.4 mg/mL時(shí)達(dá)到100%。由此可見，三葉青提取物對羥自由基具有一定的清除能力，但與VC相比能力較弱。且三葉青不同部位之間也有差異，莖葉和根須的清除能力較塊根強(qiáng)一些。

圖5 三葉青對羥自由基清除率的影響Fig.5 Scavenging effect of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on hydroxyl radical

2.6.4 三葉青黃酮提取物的還原能力 由圖6 可知，在測試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC和三葉青的還原能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)。在1.0 mg/mL 時(shí)，VC的吸光度值為0.785；三葉青莖葉、塊根、根須的吸光度值分別為0.172、0.153、0.184。雖然三葉青的還原力較VC弱，但也表現(xiàn)出一定的還原力，且莖葉和根須的還原能力較塊根更強(qiáng)。

2.7 三葉青不同部位抗炎能力測定

2.7.1 MTT 法篩選給藥安全濃度 如圖7 所示，三葉青三部位的給藥濃度在25～200 μg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，RAW264.7 細(xì)胞存活率無明顯下降，表明三葉青提取物在此濃度范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性，可作為安全給藥劑量范圍。當(dāng)三葉青給藥濃度上升到400 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率顯著性下降（P＜0.05），表明此時(shí)已產(chǎn)生細(xì)胞毒性。故本實(shí)驗(yàn)選用25～200 μg/mL 作為安全劑量濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖7 三葉青黃酮提取物對RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響（±s，n=3）Fig.7 Effect of flavonoid extract of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on the viability of RAW264.7 cells（±s，n=3）

2.7.2 三葉青對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 釋放的影響 炎癥是生物體對抗外來有害物質(zhì)或損傷的防御性反應(yīng)，通過釋放NO 等炎癥介質(zhì)或因子對抗細(xì)菌、病毒等入侵物質(zhì)，以維持機(jī)體平衡。NO 是一種獨(dú)特的內(nèi)源性信號分子，參與正常生理活動(dòng)；然而，炎癥反應(yīng)過度爆發(fā)時(shí)，NO 會異常過量表達(dá)，導(dǎo)致炎癥加劇，其與多種炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，通常被認(rèn)為是炎癥產(chǎn)生的標(biāo)志和用作體外抗炎藥物篩選模型[27-28]。本實(shí)驗(yàn)采用LPS 刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)NO 對待測樣品進(jìn)行抗炎活性篩選，結(jié)合MTT 法所得的安全濃度影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，模型組細(xì)胞NO 含量極顯著上升（P＜0.001）；與模型組相比，阿司匹林組細(xì)胞NO 釋放量極顯著性降低（P＜0.001）。三葉青不同部位各給藥組NO 釋放量呈劑量依賴性降低，均有顯著性差異（P＜0.01），三葉青三個(gè)部位提取物均可以降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 含量，且塊根和根須樣品在濃度達(dá)到200 μg/mL 時(shí)，表現(xiàn)出比阿司匹林更好的抗炎活性圖8。

圖8 三葉青黃酮提取物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 釋放量的影響（±s，n=3）Fig.8 Effect of flavonoid extract of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on LPS-induced NO release in RAW264.7 cells（±s，n=3）

3 討論與結(jié)論

本研究采用醇提工藝，測出的結(jié)果與吉慶勇等[29]測定的人工種植和野生三葉青地下塊莖的總黃酮含量相近，各部位之間總黃酮含量沒有顯著性差異。從指紋圖譜分析可知，三葉青莖葉中的成分更多，提示三葉青莖葉可以作為三葉青功效性部位的可能。

常用的體外抗氧化活性[30]評價(jià)包括自由基清除能力和還原能力，指在自由基溶液中加入抗氧化劑，兩者反應(yīng)產(chǎn)生的光學(xué)變化差異來反映抗氧化活性或根據(jù)抗氧化劑能將鐵氰化鉀還原，在700 nm 處有最大吸收峰。吸光值越大，表明樣品還原力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)采用DPPH、ABTS+、羥自由基法及鐵離子還原法進(jìn)行分析，三葉青三部位均具有一定的抗氧化活性，莖葉和根須的IC50值均比塊根高，顯示出三葉青莖葉和根須具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

有研究報(bào)道三葉青黃酮可以通過減輕LPS 誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞滲出和促炎因子分泌達(dá)到抗炎的作用[31]，故本實(shí)驗(yàn)使用LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞對三葉青不同部位進(jìn)行抗炎活性研究，結(jié)果表明在安全濃度范圍內(nèi)，三葉青不同部位的黃酮提取物均能使細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO 含量顯著降低，這說明三葉青三部位均表現(xiàn)出良好的抗炎作用。

對于種植采收時(shí)拋棄的三葉青莖葉和根須而言，是一種很大的資源浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)為仿野生種植三葉青莖葉和根須的資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)，也為加快三葉青藥材全資源利用和食品、保健品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。