金松酸對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響

楊興文，姚詩(shī)煒，盧紅伶，蔣陳凱，胡文君，馮永才，陳振濱，沈國(guó)新，相興偉1,，陳 琳,

（1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江湖州 313200；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑與茶葉研究所，浙江杭州 310021；3.諸暨綠康生物科技有限公司，浙江紹興 311800）

肥胖是人類目前最緊迫的公共健康問(wèn)題之一[1]，主要是由能量攝入、消耗以及儲(chǔ)存之間的不平衡所造成[2]。據(jù)報(bào)道，截止到2019 年，青少年肥胖率和成人肥胖率分別增長(zhǎng)至11.5%和16.4%[3]，在全球范圍內(nèi)肥胖和超重作為導(dǎo)致人類死亡的危險(xiǎn)因素位居第五，肥胖每年導(dǎo)致的成人死亡人數(shù)超過(guò)340 萬(wàn)[4]。同時(shí)，肥胖是造成一系列慢性疾病的因素之一，包括心血管疾病[5]、糖尿病[6]、慢性腎病[7]、非酒精性脂肪肝[8]、代謝綜合征[9]和許多癌癥[10]，以及其他并發(fā)癥。改善肥胖途徑主要包括節(jié)食、服藥和外科手術(shù)等，然而每種方法都存在一定的弊端，如節(jié)食難以長(zhǎng)期堅(jiān)持，且可能會(huì)對(duì)大腦造成不良影響。而藥物的副作用較為明顯，手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)也更大[11]。因此尋求安全高效預(yù)防肥胖的活性物質(zhì)非常必要。

香榧（Torreya grandis），是我國(guó)的藥食同源食物[12]，具有一定的降脂功效[13]。香榧起源于中國(guó)，是一種常綠樹種，主要分布于中國(guó)亞熱帶丘陵地區(qū)，以其可食用且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的種子而聞名[14]。香榧籽油脂含量豐富，約為40%～65%[15]，且富含角鯊烯、生育酚、甾醇等天然生物活性物質(zhì)[16]，具有抗炎[17]、抗腫瘤[18]、降脂[13]等諸多生理作用。

香榧仁油是多不飽和脂肪酸的良好來(lái)源[19]，其含量約為52.58%～56.50%[20]，其中以非亞甲基間斷多不飽和脂肪酸和具有順-5 乙烯鍵的多不飽和脂肪酸為主。非亞甲基間斷多不飽和脂肪酸包含一種特殊脂肪酸—順5,11,14－二十碳三烯酸，即金松酸（sciadonic acid，SA），含量為6.68%～11.20%[21-22]。有研究表明，SA 能通過(guò)減少體內(nèi)自由基的產(chǎn)生達(dá)到減輕氧化應(yīng)激的效果，并可抑制肝臟和血清中涉及脂肪酸合成酶的活性、提高肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶和?；o酶A 氧化酶的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)小鼠的血脂水平，改善肥胖[1]。碳水化合物引起的高甘油三酯血癥與肥胖密切相關(guān)[23]，研究表明SA 作為肝臟Δ9-不飽和酶SCD1 的抑制劑，能夠降低血漿中甘油三酯含量，調(diào)節(jié)高甘油三酯血癥[24]，進(jìn)而改善肥胖。雖然當(dāng)前研究已證明SA 具有一定的減肥作用，但對(duì)香榧籽油中SA 改善肥胖的降脂機(jī)制研究甚少。

本文在已有研究的基礎(chǔ)上，以高脂高糖飼料飼喂C57BL/6J 小鼠，建立肥胖模型，并在造模的同時(shí)使用低、中、高三種劑量的SA 進(jìn)行干預(yù)，16 周后檢測(cè)小鼠與肥胖和脂質(zhì)代謝相關(guān)的生理生化指標(biāo)，旨在更加深入地揭示SA 調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的作用機(jī)制，以期為金松酸降脂減重功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香榧（細(xì)榧）于2022 年購(gòu)自浙江省諸暨市浙江旭璟健康科技有限公司，在干燥陰涼處堆漚至假種皮柔軟，剝離假種皮后晾曬種子，蒸餾水沖洗后再次晾曬，得到香榧籽；雄性C57BL/6 小鼠（質(zhì)量合格證編號(hào)20170005070777）四周齡，體重18～22 g，杭州杭斯生物科技有限公司；小鼠高脂糧（45%）、小鼠普通糧、小鼠墊料 蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（NEFA）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-Px）試劑盒南京建成生物工程研究所；白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）試劑盒 武漢博士德有限公司；總RNA提取試劑盒 翌圣生物科技股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒 北京天根有限公司。

LDO-101-5 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；ZYJ-9028 型榨油機(jī) 德國(guó)Bestday 有限公司；FA1004N 型分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；5425R 型低溫高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 有限公司；JX-24 型樣品快速研磨儀 上海凈信公司；Multiskan SkyHigh 多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司；TC-EA-B-48DA 型PCR 擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；StepOne 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 美國(guó)Applied Biosystems 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香榧籽油的制備 將香榧籽樣品放置于45 ℃烘箱中干燥一段時(shí)間，控制其水分含量在5%以下，然后剝離種殼、種衣，將種仁切碎，采用螺旋壓榨得到香榧籽原油，靜置分層后，過(guò)濾，于10000 r/min 離心15 min，取上清，即得香榧籽油。

1.2.2 SA 的提取 參照溫思思等[25]制備SA 的方法，并在其基礎(chǔ)上對(duì)實(shí)驗(yàn)條件加以優(yōu)化。即將制備脂肪酸乙酯的攪拌時(shí)間延長(zhǎng)至6 h，并調(diào)整包埋時(shí)間為20 h。

1.2.3 模型制備及分組 將48 只四周齡C57BL/6雄性小鼠在動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，在此期間內(nèi)觀察每只小鼠的外觀、精神狀態(tài)、自主活動(dòng)、進(jìn)食飲水和排泄情況，一周后將小鼠隨機(jī)分為6 組，分別為正常對(duì)照組（C 組）、肥胖造模組（M 組）、奧利司他陽(yáng)性對(duì)照組（S，60 mg/kg）、低劑量SA 干預(yù)組（LSA，250 mg/kg/d）、中劑量SA 干預(yù)組（MSA，500 mg/kg/d）和高劑量SA 干預(yù)組（HAS，750 mg/kg/d），每組8 只，實(shí)驗(yàn)周期為16 周。C 組小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，其余5 組均飼喂高脂飼料（飼料配方見表1），同時(shí)對(duì)SA 干預(yù)組小鼠每日上午9 時(shí)按0.1 mL/10 g/d 的劑量灌胃SA 溶液，C 組和M 組小鼠灌胃相同劑量生理鹽水。

表1 高脂飼料配方Table 1 Formula of high-fat feed

所有實(shí)驗(yàn)大鼠均飼養(yǎng)于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，環(huán)境溫度22±2 ℃、相對(duì)濕度60%±5%、明暗交替12 h/12 h，每周記錄小鼠體重及各組小鼠總攝食量，并定期更換小鼠籠具內(nèi)的墊料及飲水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程小鼠皆可自由飲水、飲食，遵循“3R”原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷，動(dòng)物福利倫理審查批文號(hào)2022ZAASLA86。16 周后，確定肥胖造模組相對(duì)于正常對(duì)照組是否肥胖模型造模成功，以及SA 干預(yù)組是否有減肥的功效。

1.2.4 血清和組織樣本的收集 造模給藥結(jié)束后，小鼠均在不禁止飲水的情況下禁食12 h（9:30 pm 至9:30 am），并在處死小鼠前對(duì)其體重進(jìn)行記錄，后腹腔注射10%體重的水合氯醛將其麻醉，進(jìn)行腹腔靜脈采血，并將血樣置于無(wú)菌離心管，于提前預(yù)冷至4 ℃的離心機(jī)中12000 r/min 離心15 min，分離出血清并保存在-80 ℃冰箱，用于血清生化指標(biāo)檢測(cè)。

血取凈后，將小鼠脫頸處死，用75%酒精進(jìn)行全身消毒后進(jìn)行解剖，分離肝臟等主要臟器，剝離附睪周圍脂肪組織墊，經(jīng)無(wú)菌PBS 漂洗后用濾紙吸干殘留溶液，并依次稱重，記錄。另因需制作肝臟切片，稱重后對(duì)肝臟進(jìn)行切割，分裝，制片部分置于盛有4%多聚甲醛溶液的離心管中固定。將所有實(shí)驗(yàn)樣本置于液氮冷卻，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.5 脂肪及肝臟指數(shù)測(cè)定 根據(jù)1.2.4 中稱量得到的肝臟和附睪脂肪重量計(jì)算肝臟系數(shù)與附睪脂肪系數(shù)。

1.2.6 血清生化指標(biāo)測(cè)定 使用相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，并根據(jù)生產(chǎn)廠家說(shuō)明書推薦的操作方法及計(jì)算公式測(cè)定小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 的含量。

1.2.7 肝臟病理組織切片觀察 對(duì)固定狀態(tài)良好的肝臟進(jìn)行剪切，經(jīng)梯度濃度無(wú)水乙醇脫水后，采用二甲苯進(jìn)行透明處理，浸沒(méi)石蠟進(jìn)行包埋，后組織切片4 μm，切片經(jīng)二甲苯脫蠟、分級(jí)酒精脫色脫蠟后，進(jìn)行HE 染色（具體方法參照林寧等[26]肝臟病理組織檢測(cè)過(guò)程），然后再經(jīng)脫水、透明處理，即可在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)組織形態(tài)并拍照。

1.2.8 肝臟生化指標(biāo)測(cè)定 分別稱取1 g 小鼠肝臟，于組織勻漿器中勻漿，加入9 倍體積生理鹽水，制成10%（m/V）肝組織勻漿，并于4 ℃預(yù)冷的離心機(jī)中，12000 r/min 離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝臟TC、TG、NEFA、SOD、MDA 和GSH-Px 水平。

1.2.9 肝臟相關(guān)因子 mRNA 表達(dá)水平測(cè)定 切取100 mg 肝臟組織于無(wú)酶管中，加入1 mL 組織裂解液研磨，將制備的勻漿液按照試劑盒說(shuō)明書提取RNA。通過(guò)TGem Plus 全波長(zhǎng)分光光度計(jì)計(jì)算RNA 樣本的濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。肝臟組織擴(kuò)增腺苷酸激活蛋白激酶-α（AMPK-α）、乙酰輔酶A 羧化酶1（ACC-1）、脂肪酸合成酶（FAS），固醇元件調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）、過(guò)氧化物增殖激活受體-α（PPAR-α）、羥甲基戊二酸單酰輔酶還原酶（HMGCR）的基因表達(dá)，引物由上海生物工程公司合成，引物序列詳見表2。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，不同退火溫度34 s，65 ℃延伸1 min，反應(yīng)循環(huán)40 次，65℃延伸10 min。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因（β-actin）進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表2 目的基因引物序列Table 2 Primer sequence of target gene

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)本章數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA 對(duì)小鼠體重和攝食量的影響

小鼠的體重可直觀的反映出它是否處于肥胖狀態(tài)[27]，進(jìn)而判斷SA 對(duì)高脂飲食小鼠肥胖的干預(yù)效果。如圖1a 所示，在灌胃實(shí)驗(yàn)之前，6 組小鼠的初始體重之間無(wú)明顯差別，這說(shuō)明分組是合理的。經(jīng)過(guò)16 周的灌胃，各組小鼠體重均呈上升趨勢(shì)，灌胃期間健康狀況良好，毛發(fā)有光澤，證實(shí)了小鼠飲食結(jié)構(gòu)的合理性。

圖1 金松酸對(duì)飼喂高脂飲食小鼠體重和攝食量的影響Fig.1 Effect of sciadonic acid on body weight and food intake of mice fed high-fat diet

對(duì)16 周以來(lái)小鼠的體重變化進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，M 組小鼠體重（41.20±1.15）g 始終顯著高于C 組（29.07±0.62）g（P＜0.05），且兩組間體重差異隨飼喂時(shí)間的增加而增加，說(shuō)明該肥胖模型建立成功[28]。灌胃低、中、高三個(gè)劑量SA 對(duì)小鼠體重的增加均有一定的抑制作用（體重分別為39.86±0.63、38.67±0.55、32.80±1.33 g），且作用效果呈現(xiàn)較為明顯的劑量依賴性，同時(shí)S 組小鼠體重（35.6±0.62）g 與造模組相比也有明顯的降低，證明藥物治療和SA 干預(yù)可抑制高脂飲食小鼠體重的增加，具有預(yù)防肥胖的效果。

同時(shí)，通過(guò)比較各組小鼠每周的飲食攝入量（圖1b）發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)初期，各組小鼠攝食量的增加和降低交替出現(xiàn)，分析原因可能是初期的灌胃操作使小鼠產(chǎn)生了應(yīng)急反應(yīng)[29]。但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中C 組小鼠的飲食攝入量（118.15 g）高于其他各組，LSA 組、MSA 組和HSA 組小鼠相較于C 組周均飲食量分別降低了7.68%、12.79%和15.83%，說(shuō)明SA 對(duì)小鼠的飲食攝入量有較為明顯的抑制作用，且作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性。以上結(jié)果表明SA 酸可能通過(guò)抑制小鼠食欲減少其飲食攝入量，從而減少了高脂飲食引起的體重增加，這可能是SA 抑制小鼠肥胖的重要原因之一。

2.2 SA 對(duì)小鼠附睪脂肪及肝臟指數(shù)的影響

小鼠體內(nèi)肝臟和附睪脂肪質(zhì)量，肝臟和附睪脂肪系數(shù)也是體現(xiàn)其肥胖程度的重要指標(biāo)[30]。經(jīng)奧利司他和低、中、高三種劑量SA 溶液灌胃治療16 周后，肝臟和附睪脂肪的重量變化如圖2a 和圖2b 所示，與C 組相比M 組小鼠肝臟重量和附睪脂肪重量均顯著升高（P＜0.05），約為C 組的4.64 倍和4.10倍，這與高脂高糖食物的攝入有密不可分的聯(lián)系。而與M 組相比，奧利司他治療和SA 干預(yù)顯著降低了高脂飲食小鼠肝臟和附睪脂肪組織重量（P＜0.05），其中HSA 組效果最為顯著（P＜0.05），分別降低了39.11%和48.86%。LSA 組和MSA 組小鼠肝臟和附睪脂肪重量與S 組相比有顯著差異（P＜0.05），而HSA 組肝臟重量與S 組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），推測(cè)原因可能是SA 與辛伐他調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減緩體重增加的機(jī)制相似，且高劑量SA 作用效果與辛伐他汀更相近。

圖2 金松酸對(duì)飼喂高脂飲食小鼠肝臟和附睪脂肪重量及其系數(shù)的影響Fig.2 Effect of sciadonic acid on the weight and coefficient of liver and epididymal fat in mice fed high-fat diet

肝臟系數(shù)和附睪脂肪系數(shù)的變化趨勢(shì)和質(zhì)量變化趨勢(shì)相同如圖2c 和圖2d 所示，M 組小鼠的肝臟和附睪脂肪系數(shù)顯著高于C 組（P＜0.05），且分別比正常組增加了69.45%和65.43%。與M 組相比，S 組、SA 處理組小鼠肝臟和附睪脂肪系數(shù)均顯著下降（P＜0.05），且干預(yù)效果呈現(xiàn)劑量依賴性，但LSA 組、MSA 組和HSA 組對(duì)肝臟系數(shù)的影響差異不顯著（P＞0.05）。圖2c 中，S 組與HSA 組肝臟系數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。圖2d 顯示，S 組與HSA 組小鼠附睪脂肪系數(shù)雖差異顯著（P＜0.05）但均向C 組靠近（P＜0.05），說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)SA 對(duì)動(dòng)物肝臟和脂肪無(wú)損傷作用。綜上所述，SA 能夠顯著減少高脂飲食小鼠體內(nèi)脂肪蓄積，緩解肝臟重量的增加，有效改善小鼠因高脂飲食引起的機(jī)體肥胖，且劑量越高，效果越好。

2.3 SA 對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

長(zhǎng)期高脂飲食可能會(huì)引起小鼠血脂代謝紊亂。研究表明，臨床上通過(guò)對(duì)血脂血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)有助于肥胖、高脂血癥等疾病的診斷，對(duì)早篩早診早治具有良好的促進(jìn)作用，血脂指標(biāo)TC、TG、HDL-C、LDL-C 等與肥胖等脂代謝疾病的相關(guān)性已得到證實(shí)[31]。由圖3 可知，與C 組相比，M 組的TC、TG和LDL-C 水平顯著（P＜0.05）升高，而HDL-C 水平顯著下降（P＜0.05），表明小鼠脂質(zhì)代謝紊亂引起高血脂癥。SA 干預(yù)后，小鼠血脂水平均有不同程度的改善。與M 組相比，SA 處理組在四項(xiàng)指標(biāo)中表現(xiàn)出與S 組相似的趨勢(shì)，其中，HSA 組效果最為顯著（P＜0.05），與S 組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。血清中TC 的含量隨SA 濃度的增加而顯著降低（P＜0.05），呈現(xiàn)劑量依賴性；而經(jīng)SA 干預(yù)后血清中TG 和LDL-C 含量較M 組顯著降低（P＜0.05），HDL-C 含量顯著升高（P＜0.05），但MSA 組TG 含量與HSA 組無(wú)顯著差異（P＞0.05），LSA 組LDL-C 和HDL-C 的含量與MSA 組無(wú)顯著差異（P＞0.05），而LSA 組與HSA 組始終有顯著差異（P＜0.05）。綜上所述，辛伐他汀和SA 都能夠降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠血清中的TC、TG 和LDL-C 水平，升高HDL-C 水平，對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂起到一定程度的改善作用。

圖3 金松酸對(duì)飼喂高脂飲食小鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of sciadonic acid on serum biochemical indexes in mice fed high-fat diet

2.4 SA 對(duì)小鼠肝臟組織病理變化的影響

肝臟是脂肪合成的主要場(chǎng)所，長(zhǎng)期高脂高糖的飲食會(huì)影響肝臟代謝功能，損傷肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)[32]。組織形態(tài)學(xué)檢查是了解臟器受損的程度最直觀清晰的手段，各組小鼠肝臟病理切片見圖4。C 組肝細(xì)胞分界清晰，大小較均一，從中心靜脈放射出來(lái)，肝細(xì)胞核圓而清晰，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)豐富，排列規(guī)律有序，肝細(xì)胞形態(tài)正常。而在長(zhǎng)期喂食高脂飼料后，M 組小鼠出現(xiàn)明顯的肝臟病理?yè)p傷，少數(shù)肝細(xì)胞呈氣球狀，細(xì)胞質(zhì)間有許多白色中性脂質(zhì)，形成大小不一的脂肪空泡，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，呈現(xiàn)明顯的脂肪變性，存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。S 組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞脂肪變性明顯減少，肝細(xì)胞排列較規(guī)則，接近正常的狀態(tài)。SA 各劑量組由HFD 引起的肝臟病變得到了明顯改善，肝組織內(nèi)小葉結(jié)構(gòu)排列較整齊，脂肪空泡明顯減少，炎癥浸潤(rùn)得到緩解，肝細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞質(zhì)保存良好，細(xì)胞核突出，形態(tài)正常，其中以HSA組改變最為明顯，且與S 組效果較為接近。

圖4 小鼠脂肪組織病理H&E 染色觀察（20×）Fig.4 Pathological H&E staining of mouse adipose tissue (20×)

2.5 SA 對(duì)小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響

高脂飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠的肝臟生化指標(biāo)異常，造成小鼠的代謝紊亂，從而引起小鼠肥胖[33]。如圖5a～圖5c 所示，M 組小鼠的肝臟TG、TC 和NEFA 水平與C 組小鼠相比，顯著地（P＜0.05）增加了1.80、1.52 和2.99 倍，說(shuō)明高脂飲食可能誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)的積累。經(jīng)奧利司他和SA 干預(yù)后，相比M 組，LSA、MSA、HSA 和S 組小鼠肝臟TC、TG 和NEFA 水平均有不同程度的降低，其中S 組與M 組差異顯著（P＜0.05），且HSA 組TC、TG 和NEFA 小鼠含量與S 組小鼠無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明SA 干預(yù)可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)積累，進(jìn)而預(yù)防小鼠肥胖，從改善程度上看，高劑量SA 效果優(yōu)于其他劑量。

圖5 金松酸對(duì)飼喂高脂飲食小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響Fig.5 Effect of sciadonic acid on liver biochemical parameters of mice fed high-fat diet

活性氧自由基（ROS）的過(guò)量產(chǎn)生以及抗氧化能力的下降是肥胖氧化應(yīng)激產(chǎn)生的可能機(jī)制之一。機(jī)體的防御系統(tǒng)通?？梢云胶怏w內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和消除，但長(zhǎng)期的高脂飲食會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激使其失衡，從而導(dǎo)致體內(nèi)ROS 的積累，而大量研究表明機(jī)體內(nèi)自由基水平與肥胖呈顯著的正相關(guān)性[34]。SOD 是體內(nèi)主要的氧自由基清除酶，對(duì)于緩解體內(nèi)氧化應(yīng)激起到重要作用；MDA 是體內(nèi)多不飽和脂肪酸過(guò)氧化物的降解產(chǎn)物，具有一定的細(xì)胞毒性，可以反應(yīng)機(jī)體內(nèi)氧化損傷程度的高低[35]；GSH-Px 是體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，具有清除和中和體內(nèi)自由基和過(guò)氧化物的作用[36]。如圖5d～圖5f 所示，M 組小鼠肝臟SOD 和GSH-Px 水平顯著低于C 組小鼠（P＜0.05），而其MDA 水平則顯著高于C 組（P＜0.05）。經(jīng)奧利司他干預(yù)后，S 組小鼠SOD、GSH-Px 和MDA水平得到明顯改善（P＜0.05）。LSA、MSA 和HSA組對(duì)三個(gè)指標(biāo)的影響與S 組趨勢(shì)相同，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其中HSA 組與S 組差異不顯著（P＞0.05）。綜上，SA 能夠增加小鼠肝臟SOD 和GSH-Px 酶活力，同時(shí)顯著降低MDA 水平，從而清除體內(nèi)自由基，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，緩解小鼠肥胖。

2.6 SA 對(duì)小鼠肝臟相關(guān)因子 mRNA 表達(dá)水平的影響

機(jī)體脂質(zhì)合成和代謝通路中，ACC-1、FAS、SREBP-1c、PPAR-α、HMGCR是調(diào)控脂類物質(zhì)合成和代謝的關(guān)鍵基因[37]。SREBP-1c可調(diào)控FAS、ACC-1、HGMCR表達(dá)上調(diào)，增加脂肪酸生物合成，觸發(fā)肝臟脂肪變性[38]；PPAR-α在肝臟組織中高表達(dá)，其不但參與肝臟中脂肪酸氧化代謝系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，并且在脂質(zhì)代謝疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。而AMPK-1α能抑制脂肪酸代謝途徑，使FAS、ACC-1、SREBP-1c表達(dá)下調(diào)，PPAR-α表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)脂質(zhì)分解代謝[39]。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR 檢測(cè)影響肝臟脂質(zhì)積累的重要調(diào)節(jié)因子mRNA 的表達(dá)情況，由圖6a、圖6e 可以看出，與C 組相比，M 組小鼠的肝臟組織中AMPK-1α和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因PPAR-α的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。MSA、HSA 組顯著（P＜0.05）改善了AMPK-1α和PPAR-α基因的mRNA 表達(dá)水平，相對(duì)于M 組其表達(dá)分別增加了41.85%、57.67%和26.57%、36.60%，改善效果呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，其中HSA 組對(duì)PPAR-αmRNA 表達(dá)水平的影響與S 組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。而由圖6b～圖6d、圖6f可知，M 組小鼠肝臟中脂質(zhì)合成相關(guān)基因ACC-1、FAS、SREBP-1c、HMGCRmRNA 的表達(dá)水平較C 組顯著升高（P＜0.05）。而SA 干預(yù)可不同程度的降低此類基因的mRNA 表達(dá)水平，其中以HSA 組效果最為顯著（P＜0.05），且與陽(yáng)性藥物S 組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果顯示，SA 可通過(guò)抑制脂肪從頭合成，增強(qiáng)能量代謝等來(lái)改善長(zhǎng)期高脂飲食引起的小鼠糖脂代謝異?，F(xiàn)象，進(jìn)而發(fā)揮其抗肥胖的作用。

圖6 金松酸對(duì)高脂飲食小鼠肝組織基因mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of sciadonic acid on the mRNA expression levels of liver genes in mice on high-fat diet

3 討論與結(jié)論

諸多研究報(bào)道香榧籽油中的SA 具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)沉積，促進(jìn)脂質(zhì)代謝的作用，進(jìn)而緩解脂代謝引起的肥胖[1,40]，但是其作用機(jī)制尚不清楚。本研究證實(shí)低、中、高劑量SA 干預(yù)16 周后均能減緩由HFD 誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量增加、臟器的擴(kuò)增，并降低血清中脂代謝相關(guān)指標(biāo)TG、TC 和LDL-C 水平，同時(shí)增加HDL-C 水平，其中高劑量組效果最佳。

HFD 同樣會(huì)引起肝臟脂代謝紊亂，而肝臟脂質(zhì)代謝紊亂是引發(fā)高血糖、脂肪肝和肥胖等代謝綜合征的關(guān)鍵原因[41]。因此，本研究探索了SA 影響肝臟脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制，結(jié)果表明經(jīng)HFD 誘導(dǎo)的小鼠肝臟中脂質(zhì)大量積累，其組織形態(tài)也發(fā)生了明顯的病變。SA 處理可顯著降低小鼠肝臟脂質(zhì)水平，改善肝臟脂肪變性的程度，同時(shí)增強(qiáng)小鼠肝臟組織中脂質(zhì)代謝基因AMPK-1α、PPAR-α的mRNA 表達(dá)，降低脂質(zhì)合成基因ACC-1、FAS、SREBP-1c、HMGCR的mRNA 表達(dá)，改善機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，從而達(dá)到預(yù)防或減輕肥胖的目的。

除體重增加、脂質(zhì)代謝紊亂外，肥胖通常還伴隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)，其中以肝臟的氧化應(yīng)激最為顯著，SOD、GSH-Px 和MDA 是衡量體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)[42]。研究表明，SA 干預(yù)能顯著增加小鼠肝臟中SOD 和GSH-Px 含量，同時(shí)降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA 的水平，進(jìn)而減輕肥胖食小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)肝臟組織。

綜上所述，SA 對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖有一定的改善作用，該作用可能與抑制脂質(zhì)合成、促進(jìn)脂質(zhì)代謝、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)等機(jī)制有關(guān)。